趙立晶 張鴻翔 王國安

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，在青春期和老年期發(fā)病率較高。骨肉瘤極易發(fā)生轉移，且以肺轉移最常見[1]。近三十年來，骨肉瘤的治療進入了平臺期，尤其是轉移性骨肉瘤和復發(fā)性骨肉瘤，致殘率和死亡率極高[2-3]。探究骨肉瘤發(fā)病的分子機制和治療靶點是骨肉瘤研究的重要方向。

miRNA是一種由18 ～ 24個核苷酸組成的小型單鏈非編碼RNA，其通過與特定mRNA的靶向結合來調(diào)控基因的表達[4]。miRNA 水平的改變與包括腫瘤在內(nèi)的常見人類疾病的發(fā)展有關，能夠參與所有關鍵的腫瘤相關過程，包括DNA 損傷修復、細胞死亡、細胞增殖，以及上皮-間質轉化、腫瘤侵襲和轉移形成等[5-6]。同樣，miRNA的異常變化也參與骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展，本研究通過生信分析，從經(jīng)典GEO 數(shù)據(jù)庫中篩選骨肉瘤中異常表達的miRNA。探究miR-654-3p對GMFB基因的靶向調(diào)控作用，以及對骨肉瘤細胞增殖的影響，并繪制基于GMFB表達來預測骨肉瘤患者預后情況的列線圖，從而為探究骨肉瘤更多的發(fā)病機制、探索更可靠的生存預后預測方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

主要材料、試劑：人正常成骨細胞系hFOB1.19，人骨肉瘤細胞系143B、MG-63、SAOS2 和HOS[美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）]；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS，美 國Gibco 公 司）； miR-654-3p mimics、 mimics NC、pcDNA-GMFB、雙熒光素酶報告質粒（上海吉瑪基因公司）。PrimeScripTM RT試劑盒、SYBR Green Premix試劑盒（日本TaKaRa公司）；4%多聚甲醛、CCK8 試劑盒、RIPA裂解液、制膠試劑盒、上樣緩沖液、ECL化學發(fā)光試劑盒（上海碧云天公司）；抗GMFB抗體、山羊抗兔IgG二抗（英國Abcam公司）。主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺、NanoDrop 分光光度計（美國Thermo Scientific 公司）；電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；酶標儀（美國BioTek 公司）；倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉染

將凍存的細胞復蘇，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液將細胞培養(yǎng)于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，每2 ～ 3 d更換一次培養(yǎng)液。當細胞融合度達到80% ～ 90%時，將細胞消化并以5×105/孔的密度接種到6孔板中。培養(yǎng)過夜后，用miR-654-3p mimics或mimics NC及pcDNA-GMFB轉染細胞，嚴格按照轉染試劑說明書進行。置于培養(yǎng)箱中孵育6 h后，更換細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 生物信息學分析

在GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索GSE70367數(shù)據(jù)集，然后采用GEO2R在線分析工具對數(shù)據(jù)集中骨肉瘤細胞和正常細胞進行miRNA 表達差異分析，篩選滿足P值＜0.05 且logFC 絕對值≥2 的前20 個miRNA。在TargetScan7.2 數(shù)據(jù)庫（https://www.targetscan.org/vert_72/）和miRmap 數(shù)據(jù)庫（https://mirmap.ezlab.org/app/）中輸入has-miR-654-3p，對其靶基因進行預測。在TCGA 數(shù)據(jù)庫（http://cancergenome.nih. gov/）中下載骨肉瘤患者的GMFB表達數(shù)據(jù)和臨床信息，使用R軟件4.0.2版本基于survminer R 軟件包和survival R 軟件包繪制GMFB與骨肉瘤患者總體生存率的KM生存曲線，rms R軟件包和survival R軟件包繪制骨肉瘤患者的生存預后列線圖。

1.2.3 RT-qPCR實驗

提取各處理組的不同骨肉瘤細胞的總RNA，根據(jù)逆轉錄試劑盒的說明書反轉錄合成cDNA，然后按照RT-qPCR試劑盒的反應體系進行定量檢測。引物序列如下：miR-654-3p 上游引物：5′-AGCGAATATGTCTGCTGACCA-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下 游 引物：5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′；GMFB上游引物：5′-ACGCCTGGTGGTACTGGATGAG-3′，下游引物：5′-GCGAGGTTGTCGTTCAGGTAGTTC-3′；GAPDH 上 游引物：5′-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3′，下游引物：5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3′。

1.2.4 Western blot實驗

收集各處理組的骨肉瘤細胞進行裂解，提取總蛋白，然后加入上樣緩沖液在金屬浴中煮沸10 min。將蛋白樣品經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、一抗孵育和二抗孵育，采用ECL 化學發(fā)光試劑盒在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中進行顯色。選用抗GMFB 抗體（1∶1 000）、山羊抗兔IgG 二抗（1∶2 000）。將目的蛋白和內(nèi)參蛋白GAPDH的比值作為相對定量結果。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因實驗

將包含GMFB 3'UTR 區(qū)的野生型和突變型pGL3 報告質粒，分別和miR-654-3p mimics 或mimics NC 一起轉染MG-63 細胞和HOS 細胞。在二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，測定兩種骨肉瘤細胞的熒光素酶活性。

1.2.6 CCK8實驗

將處于對數(shù)生長期的各處理組骨肉瘤細胞以1 500個每孔的數(shù)量接種于96孔板中，在二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。棄去上清液，在每孔中加入含10% CCK8 溶液的培養(yǎng)液進行孵育。孵育2 ～ 4 h 后，將96 孔板置于酶標儀中在450 nm波長下檢測各孔吸光度OD值。

1.2.7 菌落形成實驗（colony forming units，CFU）

將處于對數(shù)生長期的各處理組骨肉瘤細胞以300 個每孔的數(shù)量接種于6 孔板中，然后置于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，每3 d觀察一次菌落形成數(shù)量。培養(yǎng)14 d后，當出現(xiàn)肉眼可見的菌落時，棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定后用結晶紫溶液進行染色。拍照并對克隆數(shù)進行計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結果用均值±標準差的方式表示。兩組間的比較采用Studentt檢驗，三組或三組以上采用單因素方差分析。KM 生存曲線采用單因素Cox 回歸分析，而預后列線圖的繪制采用單因素和多因素Cox回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GEO數(shù)據(jù)庫篩選骨肉瘤細胞中異常表達的miRNA

通過GEO數(shù)據(jù)庫檢索到包含骨肉瘤細胞和正常細胞的miRNA表達值的數(shù)據(jù)集GSE70367，通過GEO2R工具分析骨肉瘤細胞與正常細胞差異表達最明顯的20 個miRNA。結果發(fā)現(xiàn)其中有4 個miRNA 表達明顯上調(diào)，16 個miRNA表達明顯下調(diào)。在這些差異表達的miRNA中，miR-654-3p在骨肉瘤細胞樣本中明顯下調(diào)（見圖1）。

圖1 GSE70367 數(shù)據(jù)集中骨肉瘤細胞差異表達的miRNA：A. GSE70367數(shù)據(jù)集中差異最明顯的20個miRNA；B. miR-654-3p在骨肉瘤樣本中的表達情況

2.2 miR-654-3p在骨肉瘤細胞系中的表達情況

通過PCR實驗檢測了正常成骨細胞hFOB1.19和143B、MG-63、SAOS2 及HOS 骨肉瘤細胞中miR-654-3p 的表達情況，結果如圖2所示。與hFOB1.19細胞相比，miR-654-3p在這4種骨肉瘤細胞系中的表達均明顯下調(diào)，且以MG-63細胞和HOS細胞最為明顯。

圖2 正常成骨細胞和骨肉瘤細胞中miR-654-3p的表達

2.3 miR-654-3p靶向調(diào)控GMFB

如圖3 所示，通過TargetScan 7.2 數(shù)據(jù)庫和miRmap 數(shù)據(jù)庫預測到GMFB 基因是miR-654-3p 的靶基因之一，且PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，與hFOB1.19 細胞相比，GMFB 在143B、MG-63和HOS骨肉瘤細胞中的含量明顯上調(diào)。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，miR-654-3p mimics能夠明顯降低野生型GMFB-WT轉染的MG-63細胞和HOS細胞的熒光素酶活性，而對突變型GMFB-Mut轉染的細胞的熒光素酶活性沒有明顯影響，而陰性對照組mimics NC 轉染的細胞同樣沒有明顯變化（見圖4）。miR-654-3p mimics 轉染的MG-63細胞和HOS細胞中的GMFB在mRNA和蛋白質水平的表達明顯降低（見圖5）。

圖3 A. miR-654-3p 與GMFB mRNA 的預測結合位點；B. 正常成骨細胞和骨肉瘤細胞中GMFB的表達

圖4 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-654-3p與GMFB的結合

圖5 miR-654-3p 模擬物對骨肉瘤細胞中GMFB 表達的干預情況：A. PCR 實驗檢測GMFB 在mRNA 水平的變化；B. Western blot 實驗檢測GMFB在蛋白質水平的變化

2.4 miR-654-3p和GMFB對骨肉瘤細胞增殖的影響情況

CCK8 實驗和CFU 實驗結果均顯示，與mimics NC 組相比，miR-654-3p mimics轉染能夠明顯抑制MG-63細胞和HOS 細胞的增殖，且這種抑制現(xiàn)象能夠被pcDNA-GMFB轉染所逆轉（P＜0.05，見圖6）。

圖6 CCK8實驗和CFU實驗檢測miR-654-3p和GMFB對骨肉瘤細胞增殖的影響：A. CCK8 實驗檢測MG-63 和HOS 細胞增殖的變化；B. CFU實驗檢測MG-63和HOS細胞增殖的變化

2.5 GMFB的表達對骨肉瘤患者預后的影響情況

通過TCGA 數(shù)據(jù)庫下載骨肉瘤患者的臨床信息和GMFB 表達數(shù)據(jù)，KM 生存曲線顯示GMFB 高表達患者的總體生存率明顯低于低表達患者（見圖7）。列線圖則展示了通過年齡、性別、轉移情況、放療情況和GMFB的表達量對骨肉瘤患者的1 年、3 年和5 年生存率的預測情況（見圖8）。

圖7 GMFB對骨肉瘤患者生存預后的影響情況

圖8 基于臨床信息和GMFB表達量構建的骨肉瘤患者預后列線圖

3 討論

既往研究表明，miRNA 在成骨方面發(fā)揮著重要作用，miRNA是破骨細胞維持骨吸收活性以及成骨細胞增殖和分化過程中的重要調(diào)節(jié)因子，如miR-29b、miR-141 和miR-200a均對成骨細胞的分化起到調(diào)節(jié)作用[7-8]。miRNA的失調(diào)是骨退化、吸收和骨腫瘤形成等相關骨疾病中的一個重要病理因素[9]，miR-21 在骨肉瘤中過表達，能夠參與腫瘤抑制基因和凋亡相關蛋白的調(diào)節(jié)，如TPM1、PDCD4 和TIMP3等[10]。miR-125和miR-143的異常表達也都對骨肉瘤細胞的異常增殖產(chǎn)生影響，與骨肉瘤的發(fā)展密切相關[11-12]。然而目前對骨肉瘤的發(fā)病機制研究仍然不足，已發(fā)現(xiàn)的異常表達的miRNA未能在骨肉瘤更深入的治療中提供有力的指導作用，所以骨肉瘤中miRNA的調(diào)控譜仍有待完善。因此，本研究對骨肉瘤中miRNA的調(diào)控作用繼續(xù)進行深入挖掘，為骨肉瘤的發(fā)病機制、治療靶點選擇和生存情況預測提供更多的理論依據(jù)。

本研究首先通過GEO2R 在線工具分析GSE70367 數(shù)據(jù)集中骨肉瘤細胞與正常細胞之間的miRNA表達差異，以此來篩選骨肉瘤中異常表達的miRNA。筆者發(fā)現(xiàn)在表達差異最明顯的前20 個miRNA 中有4 個明顯上調(diào)，16 個明顯下調(diào)。miR-654-3p 是一種在2010 年才被首次公開描述的miRNA，其生物學功能在2014 年被報道。Geraldo 等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-654-3p在甲狀腺乳頭狀癌中明顯下調(diào)，在體外逆轉miR-654-3p能夠降低癌細胞的增殖和遷移，并且誘導轉移相關基因的表達降低，這表明miR-654-3p具有腫瘤抑制作用。Pu等[14]發(fā)現(xiàn)miR-654-3p無論是在非小細胞肺癌患者還是細胞系中的含量都顯著降低，并且與患者的腫瘤大小和腫瘤淋巴結轉移分期顯著相關。miR-654-3p通過負調(diào)控靶基因PLK4 顯著增加癌細胞的凋亡和腫瘤的體內(nèi)生長。鑒于miR-654-3p作為基因調(diào)控分子密切參與其他腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而目前關于miR-654-3p在骨肉瘤中的表達及調(diào)控作用尚未見報道，因此筆者聚焦在miR-654-3p展開后續(xù)研究。

筆者首先通過PCR實驗對骨肉瘤細胞中miR-654-3p的表達進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)與人正常成骨細胞hFOB1.19 相比，miR-654-3p在人骨肉瘤細胞中均明顯下調(diào)。隨后通過TargetScan網(wǎng)站和miRmap網(wǎng)站對miR-654-3p的靶基因進行預測，在兩個網(wǎng)站中都顯示miR-654-3p能夠與GMFB基因特異性結合。于是，筆者猜測miR-654-3p 能夠通過調(diào)控GMFB 的表達來參與骨肉瘤細胞的生物學功能。GMFB 是一種生長和分化因子，主要參與脊椎動物大腦的生長和分化、中性粒細胞趨化性、單核細胞遷移、T 淋巴細胞遷移和黏附等過程[15-17]。GMFB 在幾種神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性變情況下上調(diào)，而GMFB的表達增加還與包括膠質瘤和卵巢癌在內(nèi)的多種類型的癌癥高度相關，且與腫瘤患者的預后不良相關[18-20]。Liu等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，在高血糖誘導的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中過表達的miR-5195-3p 負調(diào)控GMFB 基因的表達，增強細胞凋亡和促炎細胞因子的分泌。本研究中雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果顯示，在MG-63和HOS 細胞中miR-654-3p 能夠與GMFB 相結合，且被miR-654-3p的模擬物負向調(diào)控，因此這說明miR-654-3p在骨肉瘤細胞中作為GMFB 的基因表達調(diào)控因子來發(fā)揮作用，這與筆者的預測是一致的。為了檢測miR-654-3p 及GMFB 是否能對骨肉瘤細胞的增殖發(fā)揮作用，筆者進行了CCK8 和CFU 實驗，結果顯示miR-654-3p 的增加能夠顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖，且這種抑制作用能夠被GMFB所逆轉，這說明miR-654-3p—GMFB 軸能夠參與骨肉瘤細胞增殖的調(diào)控過程。

探究腫瘤發(fā)病的分子機制主要是為腫瘤診斷、治療和預后判斷提供理論依據(jù)，而在骨肉瘤的研究中仍然缺乏一個可靠的生存預后預測模型。為了驗證本研究中GMFB基因調(diào)控作用對骨肉瘤患者生存預后的影響，筆者對TCGA數(shù)據(jù)庫中骨肉瘤患者的GMFB表達和臨床信息進行綜合分析，結果發(fā)現(xiàn)GMFB高表達患者的總體生存率要明顯低于低表達患者。此外，筆者構建了一個包含GMFB 表達量、年齡、性別、轉移情況和放療情況的生存預后模型，能夠根據(jù)以上幾種因素對骨肉瘤患者的1年、3年和5年生存率進行預測，方便判斷骨肉瘤患者的預后生存情況，這為骨肉瘤患者的生存發(fā)展方向及治療選擇提供了更加豐富可靠的數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細胞系中表達降低的miR-654-3p能夠調(diào)控靶基因GMFB的表達，且二者的調(diào)控作用影響骨肉瘤細胞的增殖能力。本研究還構建了通過GMFB 基因表達量來預測骨肉瘤患者生存預后情況的列線圖模型。研究揭示了miR-654-3p—GMFB 軸在骨肉瘤中的作用，為miR-654-3p和GMFB可能作為骨肉瘤診斷標志物提供了理論依據(jù)。