霍少川 楊俊興 劉付懿斐 郭富明 程文昌 溫劉瑩 鐘嘉漫 蔣子云*

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis, OA）是一種全關(guān)節(jié)的復(fù)雜退行性疾病，其特征是軟骨退行性變、軟骨下骨增厚、骨贅形成、滑膜炎癥及關(guān)節(jié)囊、韌帶和相關(guān)肌肉的結(jié)構(gòu)改變[1]。臨床表現(xiàn)為骨關(guān)節(jié)的反復(fù)疼痛、腫脹，甚至功能障礙，嚴(yán)重影響著患者的工作和生活[2]，并且顯著升高心血管事件、下肢深靜脈血栓、髖部骨折及全因死亡率[3]。OA是一種多因素疾病，具有多種相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素，包括性別、年齡、創(chuàng)傷、肥胖、關(guān)節(jié)損傷、關(guān)節(jié)過度使用和遺傳因素（如轉(zhuǎn)錄控制和表觀遺傳調(diào)控的改變[4]）。DNA甲基化屬于表觀遺傳調(diào)控方式的一種，由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases,DNMTs）催化和維持，在OA病理生理中具有重要作用，通常與基因沉默相關(guān)[5]。性別決定區(qū)域Y（SRY）相關(guān)的高遷移率族框9（SRY-related high-mobility group box 9, SOX9）是軟骨細(xì)胞產(chǎn)生軟骨基質(zhì)所必需的轉(zhuǎn)錄因子，直接靶向編碼關(guān)鍵軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)成分的基因，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)[6-7]。國外研究發(fā)現(xiàn)OA軟骨細(xì)胞中SOX9受DNA甲基化的調(diào)節(jié)[8]，但關(guān)于DNMTs對SOX9基因DNA甲基化修飾的調(diào)控機(jī)制相關(guān)研究尚不完全清楚。因此，筆者在OA軟骨細(xì)胞中研究SOX9 基因DNA 甲基化狀態(tài)，深入探討DNMT3A對SOX9基因DNA甲基化的調(diào)控機(jī)制，有利于加深OA表觀遺傳調(diào)控的認(rèn)識，為OA藥物的開發(fā)及體內(nèi)的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人正常軟骨細(xì)胞和OA 軟骨細(xì)胞由廣州中醫(yī)藥大學(xué)骨傷科實(shí)驗(yàn)室提供，實(shí)驗(yàn)過程符合廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院（福田）倫理委員會要求。

主要試劑：中強(qiáng)度RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、ECL 發(fā)光液（杭州弗德生物科技有限公司）；TRIzol Reagent[天根生化科技（北京）有限公司]；熒光定量PCR檢測試劑盒（中國GeneCopies 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Scientific 公司）；DNMT3A 抗體、SOX9 抗體、Collagen Ⅱ抗體、二抗HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（美國Abcam公司）；β-actin抗體（北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司）；甲苯胺藍(lán)染色液（武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司）；基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；亞硫酸鹽處理及純化試劑盒（德國QIAGEN公司）。

主要儀器：PCR 基因擴(kuò)增儀TC-96/G/H(b)C（杭州博日科技有限公司）；ABI 3730XL 基因測序儀（賽默飛世爾科技公司）；ND5000超微量紫外可見分光光度計(jì)（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；電泳儀（韓國Bioneer公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；生物倒置顯微鏡[尼康映像儀器銷售（中國）有限公司]；純水儀（上海和泰公司）；蘇凈安泰SW-CJ-1FD 超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；脫色搖床（江蘇其林貝爾儀器公司）；超速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞以3.5×105cells/mL 接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3 d更換1次培養(yǎng)基，待軟骨細(xì)胞貼壁達(dá)80%后，采用含青霉素和鏈霉素的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入0.25%胰蛋白酶消化液，放置恒溫箱1 min后反復(fù)吹打瓶壁上軟骨細(xì)胞，收集細(xì)胞液，800 r/min，離心5 min，1∶2傳代。培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞生長、形態(tài)、細(xì)胞密度等生物學(xué)形態(tài)并拍照記錄。

1.2.2 甲苯胺藍(lán)染色

將第3代軟骨細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞爬片上，待細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，用4%多聚甲醛在室溫固定細(xì)胞1 h，PBS溶液洗滌細(xì)胞2次，1%甲苯胺藍(lán)染色液孵育細(xì)胞2 h，蒸餾水漂洗后在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照記錄。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

將第3代軟骨細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞爬片上，待細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞10 min，PBS溶液洗細(xì)胞3次，用5%BSA于室溫封閉30 min，加入一抗Collagen Ⅱ（1∶200 稀釋）于4℃孵育細(xì)胞過夜，PBS溶液漂洗細(xì)胞3次，加入二抗HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶200稀釋），37℃孵育細(xì)胞30 min，PBS溶液漂洗細(xì)胞3次后加入顯色液進(jìn)行顯色，最后終止顯色反應(yīng)后，將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下拍照記錄。

1.2.4 慢病毒載體構(gòu)建及病毒包裝

1.2.4.1 慢病毒載體構(gòu)建

根據(jù)DNMT3A 的mRNA 序列，在上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成并構(gòu)建了沉默DNMT3A的慢病毒載體和對照載體，分別命名為Sh-DNMT3A和Sh-NC。Sh-DNMT3A正義鏈序列：5'-CACCGCCAGATGTTCTTCGCTAATTTCAAGAGAATTAGCGAAGAACATCTGGTTTTTTG-3'，反義鏈序列：5'-GATCCAAAAAACCAGATGTTCTTCGCTAATTCTCTTGAAATTAGCGAAGAACATCTGGC-3'； Sh-NC 正義鏈序列：5'-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAACTTTTTTG-3'， 反義鏈序列：5'-GATCCAAAAAAGTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAC-3'。

1.2.4.2 慢病毒包裝

將構(gòu)建的質(zhì)粒及慢病毒包裝輔助質(zhì)粒（pCMV-dr8.91和pMD2.G）擴(kuò)增后進(jìn)行質(zhì)粒抽提，并濃縮至濃度大于1 g/L備用。在細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)293T 細(xì)胞至80% ～ 90%匯合度時，將構(gòu)建的質(zhì)粒與Lenti-XTM HT包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染，分別于轉(zhuǎn)染后48 h 和72 h 收集培養(yǎng)上清，0.45 μm 濾膜過濾后，在超速離心機(jī)中離心2 h，最后用400 μL 新鮮的培養(yǎng)液將病毒液重懸，備用。

1.2.4.3 慢病毒感染軟骨細(xì)胞

取第3代軟骨細(xì)胞，按照2×105cells/孔的量將細(xì)胞接種于6 孔板中。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，吸去孔內(nèi)原有培養(yǎng)基，加入1 mL 1640 培養(yǎng)基，并加入polybrene 至終濃度為5 μg/mL，以MOI=100加入對應(yīng)體積的病毒原液，于37℃、5%CO2條件下孵育4 h。之后向培養(yǎng)孔內(nèi)補(bǔ)加1 mL 1 640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下孵育過夜。

1.2.5 qRT-PCR檢測

取第3 代軟骨細(xì)胞，以1×105cells/mL 濃度接種6 孔板中，每孔加2 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)48 h后按照Trizol試劑盒步驟提取樣本總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測定RNA 濃度，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成cDNA。反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL，50× Rox Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 3.6 μL，上下游引物各2 μL。反應(yīng)條件為：95℃初始變性10 min，95℃變性10 s，40 個循環(huán)，55℃退火20 s，72℃延伸35 s。用2－△△Ct法計(jì)算基因表達(dá)的相對倍數(shù)。設(shè)計(jì)引物：DNMT3A上游引物：5'-GCCCATTCGATCTGGTGATT-3'，下游引物：5'-GGCGGTAGAACTCAAAGAAGAG-3'；SOX9 上 游引物：5'-TGACCTATCCAAGCGCATTAC-3'，下游引物：5'-GCTTGCTCTGAAGAGGGTTTA-3'；GAPDH 上游引物：5'-CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG-3'，下游引物：5'CTACATGGCAACTGTGAGGAG-3'。

1.2.6 Western Blot檢測

取第3 代軟骨細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105cells/mL，接種6 孔板中，每孔加2 mL 細(xì)胞懸液。培養(yǎng)48 h 后加入RIPA 裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上孵育30 min，4℃，13 000g，離心30 min，獲取總蛋白。BCA 法測定蛋白的濃度，經(jīng)SDS-PAGF電泳將蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜上，然后將膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h，之后加入一抗SOX9（1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，加入山羊抗體二抗-HRP（Jackson，111-035-003，1∶10 000稀釋），室溫條件下孵育30 min。使用ECL工作液在X射線片上顯影、定影，以β-actin（1∶2 000稀釋）為內(nèi)參，采用Image J軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.2.7 亞硫酸氫鹽測序

采用基因組DNA 提取試劑盒提取人正常軟骨細(xì)胞和OA軟骨細(xì)胞DNA，取基因組DNA 1 μg進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化并純化回收。引物的設(shè)計(jì)：SOX9上游引物：5'TTTTGGATTTTTTTATGAAGATGA-3'，下游引物：5'CCCACACCATAAAAACRTT-3'。PCR 反應(yīng)體系：DNA 2 μL，2×PCR Mix 25 μL，ddH2O 21 μL，上下游引物各1 μL。反應(yīng)條件為：95℃初始變性4 min，94℃變性30 s，52℃變性30 s，40個循環(huán)，72℃退火40 s，72℃延伸5 min。采用亞硫酸鹽處理及純化試劑盒將目標(biāo)片段割膠純化。采用Generay的pTG19-T（Lot：GV6021）載體克隆試劑盒進(jìn)行克隆。采用XL10-Gold感受態(tài)，按照產(chǎn)品說明進(jìn)行轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇和涂板。酶切法鑒定陽性菌落挑取質(zhì)粒進(jìn)行測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞光鏡下觀察

正常軟骨細(xì)胞和OA軟骨細(xì)胞呈長梭形或多角形，胞核為圓形或橢圓形，核仁為單個或多個。正常軟細(xì)胞成簇現(xiàn)象，突起相連結(jié)，周圍有基質(zhì)樣物質(zhì)沉積，呈“鋪路石樣”（見圖1A）。OA軟骨細(xì)胞數(shù)量、突起連結(jié)、“鋪路石樣”細(xì)胞群落及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌明顯減少（見圖1B）。

圖1 兩組軟骨細(xì)胞形態(tài)（×200）：A. 正常軟骨細(xì)胞；B. OA 軟骨細(xì)胞

2.2 兩組細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色

軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色陽性可見細(xì)胞核成藍(lán)色，胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)成紫色。正常軟骨細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，體積較大，數(shù)量較多（見圖2A）；OA 軟骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，體積較小，數(shù)量較少（見圖2B）。

圖2 兩組軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色（×200）：A. 正常軟骨細(xì)胞；B. OA軟骨細(xì)胞

2.3 兩組細(xì)胞Ⅱ型膠原染色

Ⅱ型膠原染色陽性可見核仁成深藍(lán)色，胞質(zhì)區(qū)成淺藍(lán)色，細(xì)胞外基質(zhì)染成棕黃色，說明軟骨細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原。正常軟骨細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，體積較大，數(shù)量較多（見圖3A）；OA骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，體積較小，數(shù)量較少（見圖3B）。

圖3 兩組軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原染色（×200）：A. 正常軟骨細(xì)胞；B. OA軟骨細(xì)胞

2.4 兩組細(xì)胞DNMT3A、SOX9表達(dá)水平比較

采用qRT-PCR方法檢測SOX9在mRNA水平表達(dá)情況，如圖4A所示。正常軟骨細(xì)胞DNMT3A、SOX9 mRNA表達(dá)水平分別為1.00±0.08、1.00±0.05，OA軟骨細(xì)胞DNMT3A、SOX9 mRNA 表達(dá)水平分別為5.41±0.63、0.57±0.05，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。采用Western Blot方法檢測DNMT3A、SOX9蛋白水平的表達(dá)情況，如圖4B、4C所示，正常軟骨細(xì)胞DNMT3A、SOX9蛋白表達(dá)水平分別為0.65±0.01、0.29±0.03，OA 軟骨細(xì)胞DNMT3A、SOX9 蛋白表達(dá)水平分別為1.05±0.04、0.18±0.03，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 兩組細(xì)胞DNMT3A、SOX9 表達(dá)水平：A. qRT-PCR 檢測兩組細(xì)胞DNMT3A、SOX9 mRNA 表達(dá)水平；B. Western Blot 檢測兩組細(xì)胞DNMT3A、SOX9蛋白條帶；C. DNMT3A、SOX9蛋白定量分析結(jié)果

2.5 兩組細(xì)胞SOX9基因CpG島甲基化差異

從正常軟骨細(xì)胞和OA軟骨細(xì)胞獲取DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，計(jì)算SOX9 啟動子共32 個CpG 位點(diǎn)的百分比（CpG 甲基化百分比）。如圖5 所示，正常軟骨細(xì)胞SOX9基因DNA甲基化百分比為0.63%，OA軟骨細(xì)胞SOX9基因DNA 甲基化百分比為17.81%，說明SOX9 基因DNA 甲基化修飾增加可能導(dǎo)致OA發(fā)生。

圖5 SOX9啟動子亞硫酸氫鹽測序棒棒糖圖：○為非甲基化CpG，●為甲基化CpG

2.6 沉默DNMT3A慢病毒株效果的驗(yàn)證

OA 軟骨細(xì)胞在不感染病毒（Blank）、感染對照病毒（Sh-NC）或感染沉默DNMT3A 慢病毒（Sh-DNMT3A）72 h，采用qRT-PCR方法對所構(gòu)建的病毒的效果進(jìn)行檢測，如圖6A 所示，Sh-NC mRNA 表達(dá)水平為1.02±0.09，Sh-DNMT3A mRNA 表達(dá)水平為0.49±0.07，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；采用Western Blot方法對所構(gòu)建的病毒的效果進(jìn)行檢測，如圖6B、6C所示，Sh-NC蛋白表達(dá)水平為1.03±0.02，Sh-DNMT3A 蛋白表達(dá)水平為0.30±0.05，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 沉默DNMT3A慢病毒效果驗(yàn)證：A. qRT-PCR檢測三組細(xì)胞DNMT3A mRNA表達(dá)水平；B. Western Blot檢測三組細(xì)胞DNMT3A蛋白條帶；C. DNMT3A蛋白定量分析結(jié)果

2.7 兩組細(xì)胞SOX9基因DNA甲基化修飾差異

在OA 軟骨細(xì)胞中感染沉默對照病毒（OA+Sh-NC）和感染沉默DNMT3A 病毒（OA+Sh-DNMT3A）72 h。獲取OA 軟骨細(xì)胞，進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，計(jì)算SOX9 啟動子共32 個CpG 位點(diǎn)的百分比（CpG 甲基化百分比）。如圖7 所示，OA+Sh-NC SOX9 基因DNA 甲基化百分比為12.50%，OA+Sh-DNMT3A SOX9 基因DNA 甲基化百分比降至4.38%。

3 討論

表觀遺傳修飾是指在未發(fā)生DNA 序列改變的情況下，基因表達(dá)和功能發(fā)生的可遺傳改變，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA[9]。DNA甲基化是指在DNMTs的作用下，將甲基添加到胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸（CpG）中的胞嘧啶的C5 位置以形成5-甲基胞嘧啶[10-11]。DNMTs 家族有4 個成員，DNM3A 為其中的一員，被稱為從頭甲基化酶[12-13]。商安全等[14]研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3A在人OA軟骨細(xì)胞中高表達(dá)，抑制DNMT3A的表達(dá)能夠增強(qiáng)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的生長與增殖。本研究采用qRT-PCR、Western Blot檢測人OA軟骨細(xì)胞中DNMT3A表達(dá)量增高，與上述結(jié)果一致。

SOX9 屬于由20 個SRY 相關(guān)的HMG 盒蛋白組成的家族，在軟骨生長板的肥大軟骨細(xì)胞中受到抑制，但在整個生命過程中，仍在健康關(guān)節(jié)軟骨的永久軟骨細(xì)胞中表達(dá)[15]。SOX9 是調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞表型和活性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，具有確保軟骨細(xì)胞譜系的定型，促進(jìn)細(xì)胞存活并轉(zhuǎn)錄激活許多軟骨特異性結(jié)構(gòu)成分和調(diào)節(jié)因子的作用[6]。與健康軟骨細(xì)胞相比，人類OA 軟骨細(xì)胞中SOX9 的表達(dá)降低[16]。OA 軟骨細(xì)胞SOX9 啟動子甲基化增加，SOX9 下調(diào)，降低了SOX9 的結(jié)合親和力[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，人OA 軟骨細(xì)胞中SOX9 基因DNA 甲基化百分比增高，SOX9 表達(dá)量降低，與上述結(jié)果一致。

DNA甲基化通過干擾轉(zhuǎn)錄因子與其靶位點(diǎn)的結(jié)合直接抑制基因活性，或通過募集形成甲基-CpG結(jié)合蛋白復(fù)合物（部分甲基-CpG 結(jié)合域蛋白）間接促進(jìn)基因沉默[18]。CpG位點(diǎn)的DNA甲基化百分比通常采用亞硫酸氫鹽焦磷酸測序分析確定，如Imagawa 等[19]采用焦磷酸測序分析COL9A1啟動子甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)CpG 甲基化減弱了SOX9 與COL9A1啟動子的結(jié)合。本研究也采用亞硫酸氫鹽焦磷酸測序檢測SOX9基因DNA甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)人OA軟骨細(xì)胞中SOX9基因DNA甲基化百分比增高，采用慢病毒在OA軟骨細(xì)胞中沉默DNMT3A后SOX9基因DNA甲基化百分比降低，解釋了OA病變中DNMT3A對SOX9的調(diào)控機(jī)制。

綜上，在OA 軟骨細(xì)胞中SOX9 啟動子甲基化增高，DNMT3A mRNA 和蛋白表達(dá)量增高，沉默DNMT3A 能夠降低SOX9 基因DNA 甲基化狀態(tài)，初步探討了OA 軟骨細(xì)胞病變的表觀遺傳機(jī)制。