王博銳，許丹丹，谷蒙林，姚蔚，王耀，肖付剛，王德國(guó)*

（1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471000；2.許昌學(xué)院 食品與藥學(xué)院河南省食品安全生物標(biāo)識(shí)快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 許昌 461000；3.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

肉類富含多種優(yōu)質(zhì)蛋白，可為人體提供多種必需氨基酸，從而提高人們的身體素質(zhì)[1]。與其他肉類相比，牛肉和羊肉的價(jià)格更高，以致于有些不法商家以次充好、以假亂真，將便宜的雞肉或鴨肉摻入到牛、羊肉中，賺取更高的利潤(rùn)[2-3]。這種行為嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的合法權(quán)益，擾亂了市場(chǎng)秩序，甚至可能會(huì)造成消費(fèi)者產(chǎn)生過敏癥狀，從而危及生命[4]。因此，亟需開發(fā)一種快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、實(shí)用性強(qiáng)的肉類摻假檢測(cè)方法。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者們開發(fā)了各種肉類摻假的檢測(cè)方法，包括以蛋白質(zhì)和DNA 分子為目標(biāo)物的方法[5-6]，此外，還可以根據(jù)肉類中的脂類、大分子糖類和酚類等代謝物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)[7-9]。DNA 分子基于其熱穩(wěn)定性和高度保守性，在加工處理后仍可穩(wěn)定存在，因此成為肉制品物種鑒定的主要方法[10-12]。目前，基于DNA 分子的主要鑒定方法包括實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[13-15]、數(shù)字PCR[16-17]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[18-19]、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）[20-21]等。其中，PCR具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，但需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)人員，不適用于基層單位的快速檢測(cè)[22]。LAMP 和RPA 等核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但可能存在引物設(shè)計(jì)困難和假陽性等問題[23-24]。因此，需要開發(fā)一種快速、高效、操作簡(jiǎn)單、成本較低的新型檢測(cè)技術(shù)以應(yīng)對(duì)市場(chǎng)需求。

梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（ladder-shape melting temperature isothermal amplification，LMTIA）是近兩年發(fā)展起來的一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[25]，該技術(shù)在反應(yīng)時(shí)不需要溫度的變化，反應(yīng)全程只需要一個(gè)恒定的溫度，還具有反應(yīng)時(shí)間迅速、靈敏度高、針對(duì)的靶序列短等優(yōu)點(diǎn)[26]，因此在食品摻假檢測(cè)[27-29]和病毒檢測(cè)[30]等領(lǐng)域已得到成功應(yīng)用。LMTIA 技術(shù)主要利用靶序列上的熔解溫度差值來進(jìn)行解鏈，而不依賴溫度的變化及酶的作用，從而實(shí)現(xiàn)核酸的穩(wěn)定擴(kuò)增。Proofman 探針（proofreading enzyme-mediated probe cleavage）是一種新型探針[31]，在其序列的兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，通過高保真酶的校正作用實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。本研究將Proofman 探針與LMTIA 技術(shù)相結(jié)合，建立一種雞肉源基因的快速檢測(cè)方法，以期對(duì)肉制品中雞肉源基因進(jìn)行檢測(cè)，為市場(chǎng)上肉制品摻假提供一種新的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉、鴨肉、豬肉、羊肉、牛肉、玉米淀粉、紅薯淀粉、木薯淀粉、綠豆淀粉、小麥粉：市售。

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；Nucleo Spin R Food 試劑盒：德國(guó)MACHEREY-NAGEL 公司；GPV8 超保真DNA 聚合酶：通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司；Bst II Pro DNA聚合酶大片段：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；通用型LMTIA 反應(yīng)預(yù)混液：德歌生物技術(shù)（山東）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Gentier 96E 全自動(dòng)PCR 分析系統(tǒng)：西安天隆科技有限公司；Archimed X4 醫(yī)用熒光定量PCR 儀：鯤鵬（徐州）科學(xué)儀器有限公司；F6/10 勻漿機(jī)：上海凈信科技有限公司；1-15K 高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma 公司；DH300 干式恒溫器：杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司；Nano Drop One 超微量核酸蛋白測(cè)定儀：美國(guó)Thermo 公司。

1.3 方法

1.3.1 模擬樣品的制備

所用樣品均為去除表皮、脂肪和骨頭后的新鮮肉塊，使用勻漿機(jī)將肉塊打成肉糜，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考Chen 等[32]的方法，稱取0.1 g 雞肉與99.9 g的牛肉，將二者混合，并向混合肉糜中加入不影響反應(yīng)的有色染料，使用勻漿機(jī)將二者混合均勻，所制樣品即為雞肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的模擬樣品。按照該方法分別制備雞肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的混合樣品，每組樣品分別制作5 個(gè)平行樣，所有樣品置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA 提取

按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒操作說明提取各肉類基因組DNA 和1.3.1 制備的模擬肉樣。按照Nucleo Spin R Food 試劑盒操作說明提取玉米淀粉、紅薯淀粉、木薯淀粉、綠豆淀粉和小麥粉等植物淀粉的DNA。提取完成后，使用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)所提DNA 的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.6～2.0 之間，以便進(jìn)行LMTIA 擴(kuò)增。將提取的DNA樣品置于-20 ℃保存。

1.3.3 LMTIA 引物和Proofman 探針設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫上公布的雞源基因，選取雞細(xì)胞核中的高度保守序列prolactin receptor（GenBank ID：KU553470.1）為靶標(biāo)，使用Oligo 7 軟件分析所選序列，選取熔解溫度曲線呈梯型且DNA 分子中GC 堿基含量在40%～60%的片段，以該片段為靶序列設(shè)計(jì)LMTIA 引物，而后根據(jù)所設(shè)計(jì)的LMTIA 環(huán)引物設(shè)計(jì)Proofman 探針。所設(shè)計(jì)的引物和探針均由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成，序列見表1。

表1 LMTIA 引物及Proofman 探針序列Table 1 Sequences of LMTIA primers and Proofman probe

1.3.4 反應(yīng)溫度優(yōu)化

使用提取的雞肉基因組DNA 作為陽性對(duì)照對(duì)所設(shè)計(jì)的LMTIA 引物和探針進(jìn)行溫度篩選，反應(yīng)程序設(shè)置：溫度區(qū)間為53、54、55、56 ℃，90 s 采集一次熒光信號(hào)，40 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后觀察并分析擴(kuò)增結(jié)果，確定所建Proofman-LMTIA 方法的最適溫度。

1.3.5 靈敏度測(cè)定

為確定所建立的Proofman-LMTIA 檢測(cè)方法的靈敏度，將雞肉基因組DNA 梯度稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL，以優(yōu)化好的反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)。由于樣品新鮮度、人為因素誤差和DNA 降解等原因可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，為保證檢測(cè)結(jié)果具有可重復(fù)性，每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5 次以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。

1.3.6 特異性測(cè)定

為驗(yàn)證所建方法能否區(qū)分不同肉類及肉類中可能摻入的淀粉類制品，以1.3.2 中提取的豬肉、鴨肉、牛肉、羊肉、玉米淀粉、紅薯淀粉、木薯淀粉、綠豆淀粉、小麥粉等基因組DNA 作為對(duì)照，H2O 為陰性對(duì)照、雞肉基因組DNA 為陽性對(duì)照，以優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行測(cè)試，觀察并分析測(cè)試結(jié)果。每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5 次以保證方法的準(zhǔn)確性。

1.3.7 模擬樣品檢測(cè)限測(cè)定

為驗(yàn)證所建方法的最低檢測(cè)限，制備混合模擬肉樣，配制LMTIA 反應(yīng)體系，將制備的雞肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的模擬樣品DNA 進(jìn)行測(cè)試，試驗(yàn)結(jié)束后觀察并分析結(jié)果。每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5 次以保證方法的準(zhǔn)確性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Gentier 96E 全自動(dòng)醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)（V1）和Archimed Analyzer 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀軟件（v1.4.4）對(duì)檢測(cè)結(jié)果和擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析，再使用Excel、PowerPoint 軟件對(duì)結(jié)果和擴(kuò)增圖進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)原理

基于Proofman 探針的LMTIA 方法檢測(cè)雞肉源基因的原理如圖1 所示。

圖1 Proofman 探針原理Fig.1 Proofman probe principle diagram

Proofman 探針根據(jù)LMTIA 的環(huán)引物所設(shè)計(jì)，如圖1 所示，標(biāo)記熒光基團(tuán)的錯(cuò)配堿基設(shè)計(jì)Proofman 探針的3′端，Proofman 探針的5′端設(shè)計(jì)一個(gè)淬滅基團(tuán)。反應(yīng)未開始時(shí)，3′端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光被5′端淬滅基團(tuán)所吸收，故反應(yīng)無熒光信號(hào)產(chǎn)生。反應(yīng)開始時(shí)，Proofman 探針的3′端錯(cuò)配堿基被超保真DNA 聚合酶切除，熒光基團(tuán)被釋放，儀器通過采集產(chǎn)生的熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

2.2 反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果

圖2 為Proofman-LMTIA 的溫度優(yōu)化結(jié)果。

圖2 Proofman-LMTIA 溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Proofman-LMTIA reaction temperature optimization

由圖2 所示，在反應(yīng)溫度為53、54、55、56 ℃時(shí)，只有雞肉基因組DNA 出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)，陰性對(duì)照未擴(kuò)增。反應(yīng)溫度為54 ℃時(shí)，擴(kuò)增效率和重復(fù)性都比較好，所以選擇54 ℃作為所建方法的最適溫度。

2.3 靈敏度測(cè)試結(jié)果

Proofman-LMTIA 靈敏度檢測(cè)結(jié)果如圖3 所示。

圖3 Proofman-LMTIA 靈敏度結(jié)果Fig.3 Sensitivity determination of Proofman-LMTIA assay

由圖3 可知，在反應(yīng)溫度54 ℃，反應(yīng)進(jìn)行40 循環(huán)時(shí)，梯度稀釋的10 ng/μL 和1 ng/μL 的雞肉基因組DNA 出現(xiàn)擴(kuò)增，而0.1、0.01、0.001 ng/μL 和陰性對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增。說明該方法能檢測(cè)到DNA 質(zhì)量濃度為1 ng/μL 的樣品，即Proofman-LMTIA 方法的靈敏度為1 ng/μL。

2.4 特異性結(jié)果分析

Proofman-LMTIA 特異性檢測(cè)結(jié)果如圖4 所示。

圖4 Proofman-LMTIA 特異性結(jié)果Fig.4 Specificity determination of the Proofman-LMTIA assay

由圖4 可知，在反應(yīng)進(jìn)行到40 循環(huán)時(shí)，只有加入的雞基因組DNA 出現(xiàn)擴(kuò)增，而陰性對(duì)照及其它物種DNA 均未出現(xiàn)擴(kuò)增。說明所建方法的特異性較強(qiáng)，與其他物種無交叉反應(yīng)，能夠特異區(qū)分雞源基因和其它物種DNA，能夠?qū)θ庵破分须u肉源基因摻假進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 模擬樣品檢測(cè)限測(cè)試結(jié)果

雞肉模擬樣品Proofman-LMTIA 方法檢測(cè)限測(cè)試結(jié)果如圖5 所示。

圖5 Proofman-LMTIA 模擬肉樣結(jié)果Fig.5 Simulated meat sample results of Proofman-LMTIA

由圖5 可知，在54 ℃反應(yīng)的40 循環(huán)內(nèi)，陰性對(duì)照及雞肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%的肉樣未出現(xiàn)擴(kuò)增，雞肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的混合模擬樣品均在20 循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)擴(kuò)增。因此，該方法能夠在30 min 內(nèi)檢測(cè)出雞肉含量為0.1%及以上的樣品，即可檢測(cè)出1 000 kg 肉制品中摻入1 kg 雞肉。

3 結(jié)論

本研究建立了一種用于快速檢測(cè)肉制品中雞肉成分的Proofman-LMTIA 檢測(cè)方法。選取雞細(xì)胞核中單拷貝且特異性強(qiáng)的prolactin receptor 基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)引物及Proofman 探針。通過對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化，在反應(yīng)溫度為54 ℃時(shí)對(duì)雞肉基因組DNA 的檢測(cè)靈敏度為1 ng/μL，與所測(cè)試的肉制品中常見的可摻假物種無交叉反應(yīng)，可在30 min 內(nèi)檢測(cè)出肉制品中摻入的0.1%及以上的雞肉，為檢測(cè)肉制品中雞肉摻假提供了一個(gè)快速、準(zhǔn)確的方法，該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短、適用范圍廣，為規(guī)范肉制品市場(chǎng)秩序提供技術(shù)支持。