王博銳,許丹丹,谷蒙林,姚蔚,王耀,肖付剛,王德國(guó)*
(1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471000;2.許昌學(xué)院 食品與藥學(xué)院河南省食品安全生物標(biāo)識(shí)快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 許昌 461000;3.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院,河南 鄭州 450001)
肉類富含多種優(yōu)質(zhì)蛋白,可為人體提供多種必需氨基酸,從而提高人們的身體素質(zhì)[1]。與其他肉類相比,牛肉和羊肉的價(jià)格更高,以致于有些不法商家以次充好、以假亂真,將便宜的雞肉或鴨肉摻入到牛、羊肉中,賺取更高的利潤(rùn)[2-3]。這種行為嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的合法權(quán)益,擾亂了市場(chǎng)秩序,甚至可能會(huì)造成消費(fèi)者產(chǎn)生過(guò)敏癥狀,從而危及生命[4]。因此,亟需開發(fā)一種快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、實(shí)用性強(qiáng)的肉類摻假檢測(cè)方法。
目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者們開發(fā)了各種肉類摻假的檢測(cè)方法,包括以蛋白質(zhì)和DNA 分子為目標(biāo)物的方法[5-6],此外,還可以根據(jù)肉類中的脂類、大分子糖類和酚類等代謝物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)[7-9]。DNA 分子基于其熱穩(wěn)定性和高度保守性,在加工處理后仍可穩(wěn)定存在,因此成為肉制品物種鑒定的主要方法[10-12]。目前,基于DNA 分子的主要鑒定方法包括實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)[13-15]、數(shù)字PCR[16-17]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)[18-19]、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA)[20-21]等。其中,PCR具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn),但需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)人員,不適用于基層單位的快速檢測(cè)[22]。LAMP 和RPA 等核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),但可能存在引物設(shè)計(jì)困難和假陽(yáng)性等問(wèn)題[23-24]。因此,需要開發(fā)一種快速、高效、操作簡(jiǎn)單、成本較低的新型檢測(cè)技術(shù)以應(yīng)對(duì)市場(chǎng)需求。
梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(ladder-shape melting temperature isothermal amplification,LMTIA)是近兩年發(fā)展起來(lái)的一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[25],該技術(shù)在反應(yīng)時(shí)不需要溫度的變化,反應(yīng)全程只需要一個(gè)恒定的溫度,還具有反應(yīng)時(shí)間迅速、靈敏度高、針對(duì)的靶序列短等優(yōu)點(diǎn)[26],因此在食品摻假檢測(cè)[27-29]和病毒檢測(cè)[30]等領(lǐng)域已得到成功應(yīng)用。LMTIA 技術(shù)主要利用靶序列上的熔解溫度差值來(lái)進(jìn)行解鏈,而不依賴溫度的變化及酶的作用,從而實(shí)現(xiàn)核酸的穩(wěn)定擴(kuò)增。Proofman 探針(proofreading enzyme-mediated probe cleavage)是一種新型探針[31],在其序列的兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán),通過(guò)高保真酶的校正作用實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。本研究將Proofman 探針與LMTIA 技術(shù)相結(jié)合,建立一種雞肉源基因的快速檢測(cè)方法,以期對(duì)肉制品中雞肉源基因進(jìn)行檢測(cè),為市場(chǎng)上肉制品摻假提供一種新的檢測(cè)方法。
雞肉、鴨肉、豬肉、羊肉、牛肉、玉米淀粉、紅薯淀粉、木薯淀粉、綠豆淀粉、小麥粉:市售。
血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒:天根生化科技(北京)有限公司;Nucleo Spin R Food 試劑盒:德國(guó)MACHEREY-NAGEL 公司;GPV8 超保真DNA 聚合酶:通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司;Bst II Pro DNA聚合酶大片段:南京諾唯贊生物科技股份有限公司;通用型LMTIA 反應(yīng)預(yù)混液:德歌生物技術(shù)(山東)有限公司。
Gentier 96E 全自動(dòng)PCR 分析系統(tǒng):西安天隆科技有限公司;Archimed X4 醫(yī)用熒光定量PCR 儀:鯤鵬(徐州)科學(xué)儀器有限公司;F6/10 勻漿機(jī):上海凈信科技有限公司;1-15K 高速冷凍離心機(jī):德國(guó)Sigma 公司;DH300 干式恒溫器:杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司;Nano Drop One 超微量核酸蛋白測(cè)定儀:美國(guó)Thermo 公司。
1.3.1 模擬樣品的制備
所用樣品均為去除表皮、脂肪和骨頭后的新鮮肉塊,使用勻漿機(jī)將肉塊打成肉糜,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
參考Chen 等[32]的方法,稱取0.1 g 雞肉與99.9 g的牛肉,將二者混合,并向混合肉糜中加入不影響反應(yīng)的有色染料,使用勻漿機(jī)將二者混合均勻,所制樣品即為雞肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的模擬樣品。按照該方法分別制備雞肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的混合樣品,每組樣品分別制作5 個(gè)平行樣,所有樣品置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 DNA 提取
按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒操作說(shuō)明提取各肉類基因組DNA 和1.3.1 制備的模擬肉樣。按照Nucleo Spin R Food 試劑盒操作說(shuō)明提取玉米淀粉、紅薯淀粉、木薯淀粉、綠豆淀粉和小麥粉等植物淀粉的DNA。提取完成后,使用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)所提DNA 的濃度和純度,確保A260/A280比值在1.6~2.0 之間,以便進(jìn)行LMTIA 擴(kuò)增。將提取的DNA樣品置于-20 ℃保存。
1.3.3 LMTIA 引物和Proofman 探針設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)上公布的雞源基因,選取雞細(xì)胞核中的高度保守序列prolactin receptor(GenBank ID:KU553470.1)為靶標(biāo),使用Oligo 7 軟件分析所選序列,選取熔解溫度曲線呈梯型且DNA 分子中GC 堿基含量在40%~60%的片段,以該片段為靶序列設(shè)計(jì)LMTIA 引物,而后根據(jù)所設(shè)計(jì)的LMTIA 環(huán)引物設(shè)計(jì)Proofman 探針。所設(shè)計(jì)的引物和探針均由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成,序列見(jiàn)表1。
表1 LMTIA 引物及Proofman 探針序列Table 1 Sequences of LMTIA primers and Proofman probe
1.3.4 反應(yīng)溫度優(yōu)化
使用提取的雞肉基因組DNA 作為陽(yáng)性對(duì)照對(duì)所設(shè)計(jì)的LMTIA 引物和探針進(jìn)行溫度篩選,反應(yīng)程序設(shè)置:溫度區(qū)間為53、54、55、56 ℃,90 s 采集一次熒光信號(hào),40 個(gè)循環(huán),反應(yīng)結(jié)束后觀察并分析擴(kuò)增結(jié)果,確定所建Proofman-LMTIA 方法的最適溫度。
1.3.5 靈敏度測(cè)定
為確定所建立的Proofman-LMTIA 檢測(cè)方法的靈敏度,將雞肉基因組DNA 梯度稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL,以優(yōu)化好的反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)。由于樣品新鮮度、人為因素誤差和DNA 降解等原因可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響,為保證檢測(cè)結(jié)果具有可重復(fù)性,每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5 次以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。
1.3.6 特異性測(cè)定
為驗(yàn)證所建方法能否區(qū)分不同肉類及肉類中可能摻入的淀粉類制品,以1.3.2 中提取的豬肉、鴨肉、牛肉、羊肉、玉米淀粉、紅薯淀粉、木薯淀粉、綠豆淀粉、小麥粉等基因組DNA 作為對(duì)照,H2O 為陰性對(duì)照、雞肉基因組DNA 為陽(yáng)性對(duì)照,以優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行測(cè)試,觀察并分析測(cè)試結(jié)果。每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5 次以保證方法的準(zhǔn)確性。
1.3.7 模擬樣品檢測(cè)限測(cè)定
為驗(yàn)證所建方法的最低檢測(cè)限,制備混合模擬肉樣,配制LMTIA 反應(yīng)體系,將制備的雞肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的模擬樣品DNA 進(jìn)行測(cè)試,試驗(yàn)結(jié)束后觀察并分析結(jié)果。每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5 次以保證方法的準(zhǔn)確性。
使用Gentier 96E 全自動(dòng)醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)(V1)和Archimed Analyzer 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀軟件(v1.4.4)對(duì)檢測(cè)結(jié)果和擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析,再使用Excel、PowerPoint 軟件對(duì)結(jié)果和擴(kuò)增圖進(jìn)行分析處理。
基于Proofman 探針的LMTIA 方法檢測(cè)雞肉源基因的原理如圖1 所示。
圖1 Proofman 探針原理Fig.1 Proofman probe principle diagram
Proofman 探針根據(jù)LMTIA 的環(huán)引物所設(shè)計(jì),如圖1 所示,標(biāo)記熒光基團(tuán)的錯(cuò)配堿基設(shè)計(jì)Proofman 探針的3′端,Proofman 探針的5′端設(shè)計(jì)一個(gè)淬滅基團(tuán)。反應(yīng)未開始時(shí),3′端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光被5′端淬滅基團(tuán)所吸收,故反應(yīng)無(wú)熒光信號(hào)產(chǎn)生。反應(yīng)開始時(shí),Proofman 探針的3′端錯(cuò)配堿基被超保真DNA 聚合酶切除,熒光基團(tuán)被釋放,儀器通過(guò)采集產(chǎn)生的熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
圖2 為Proofman-LMTIA 的溫度優(yōu)化結(jié)果。
圖2 Proofman-LMTIA 溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Proofman-LMTIA reaction temperature optimization
由圖2 所示,在反應(yīng)溫度為53、54、55、56 ℃時(shí),只有雞肉基因組DNA 出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng),陰性對(duì)照未擴(kuò)增。反應(yīng)溫度為54 ℃時(shí),擴(kuò)增效率和重復(fù)性都比較好,所以選擇54 ℃作為所建方法的最適溫度。
Proofman-LMTIA 靈敏度檢測(cè)結(jié)果如圖3 所示。
圖3 Proofman-LMTIA 靈敏度結(jié)果Fig.3 Sensitivity determination of Proofman-LMTIA assay
由圖3 可知,在反應(yīng)溫度54 ℃,反應(yīng)進(jìn)行40 循環(huán)時(shí),梯度稀釋的10 ng/μL 和1 ng/μL 的雞肉基因組DNA 出現(xiàn)擴(kuò)增,而0.1、0.01、0.001 ng/μL 和陰性對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增。說(shuō)明該方法能檢測(cè)到DNA 質(zhì)量濃度為1 ng/μL 的樣品,即Proofman-LMTIA 方法的靈敏度為1 ng/μL。
Proofman-LMTIA 特異性檢測(cè)結(jié)果如圖4 所示。
圖4 Proofman-LMTIA 特異性結(jié)果Fig.4 Specificity determination of the Proofman-LMTIA assay
由圖4 可知,在反應(yīng)進(jìn)行到40 循環(huán)時(shí),只有加入的雞基因組DNA 出現(xiàn)擴(kuò)增,而陰性對(duì)照及其它物種DNA 均未出現(xiàn)擴(kuò)增。說(shuō)明所建方法的特異性較強(qiáng),與其他物種無(wú)交叉反應(yīng),能夠特異區(qū)分雞源基因和其它物種DNA,能夠?qū)θ庵破分须u肉源基因摻假進(jìn)行檢測(cè)。
雞肉模擬樣品Proofman-LMTIA 方法檢測(cè)限測(cè)試結(jié)果如圖5 所示。
圖5 Proofman-LMTIA 模擬肉樣結(jié)果Fig.5 Simulated meat sample results of Proofman-LMTIA
由圖5 可知,在54 ℃反應(yīng)的40 循環(huán)內(nèi),陰性對(duì)照及雞肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%的肉樣未出現(xiàn)擴(kuò)增,雞肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的混合模擬樣品均在20 循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)擴(kuò)增。因此,該方法能夠在30 min 內(nèi)檢測(cè)出雞肉含量為0.1%及以上的樣品,即可檢測(cè)出1 000 kg 肉制品中摻入1 kg 雞肉。
本研究建立了一種用于快速檢測(cè)肉制品中雞肉成分的Proofman-LMTIA 檢測(cè)方法。選取雞細(xì)胞核中單拷貝且特異性強(qiáng)的prolactin receptor 基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)引物及Proofman 探針。通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化,在反應(yīng)溫度為54 ℃時(shí)對(duì)雞肉基因組DNA 的檢測(cè)靈敏度為1 ng/μL,與所測(cè)試的肉制品中常見(jiàn)的可摻假物種無(wú)交叉反應(yīng),可在30 min 內(nèi)檢測(cè)出肉制品中摻入的0.1%及以上的雞肉,為檢測(cè)肉制品中雞肉摻假提供了一個(gè)快速、準(zhǔn)確的方法,該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短、適用范圍廣,為規(guī)范肉制品市場(chǎng)秩序提供技術(shù)支持。