查靖，葛玲，姚穎，李婷婷，龍白雪，劉鑫漢，2，王武，2*，馬飛，2*

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.皖南特色農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究與應(yīng)用中心，安徽 宣城 242000；3.宣城市宣州區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，安徽 宣城 242000）

揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）成分有氨、二甲胺、三甲胺等，是衡量魚肉新鮮度的重要指標(biāo)之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，TVB-N 與氨基酸破壞程度顯著正相關(guān)，特別是蛋氨酸和酪氨酸的降解，會(huì)在很大程度上改變魚肉顏色和風(fēng)味，造成嚴(yán)重的品質(zhì)劣化[2]。目前，我國(guó)對(duì)TVB-N 值有明確規(guī)定，預(yù)制動(dòng)物性水產(chǎn)品不得超過(guò)30 mg/100 g[3]。雖然臭鱖魚作為鹽漬預(yù)制性水產(chǎn)品不在此標(biāo)準(zhǔn)約束之列，但考慮到TVB-N 對(duì)臭鱖魚新鮮度的影響，開(kāi)展TVB-N 檢測(cè)十分必要。

目前，傳統(tǒng)的TVB-N 檢測(cè)以凱氏定氮法和微量擴(kuò)散法為主，這類方法效率低且對(duì)樣品具有破壞性[4]。隨著科技發(fā)展，比色傳感、高光譜成像和電子鼻等新技術(shù)也被用于肉和肉制品的TVB-N 無(wú)損檢測(cè)中[5-7]。然而，這些方法均存在較多局限性，主要表現(xiàn)為比色傳感存在環(huán)境污染和交叉敏感，高光譜成像存在間接性和數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，電子鼻存在設(shè)備昂貴且使用壽命短等問(wèn)題，難以滿足工業(yè)場(chǎng)景應(yīng)用[8-9]。

傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）是根據(jù)分子內(nèi)部原子間的相對(duì)振動(dòng)和分子轉(zhuǎn)動(dòng)等信息來(lái)確定物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)[10]。由于FT-IR 靈敏度高，被廣泛應(yīng)用于食品新鮮度識(shí)別[11]、摻假造假識(shí)別[12]、農(nóng)藥殘留檢測(cè)[13]、疾病的快速診斷[14]、環(huán)境氣體監(jiān)測(cè)[15]等領(lǐng)域。這些研究表明基于氣相FT-IR技術(shù)在食品分析領(lǐng)域具有較大應(yīng)用潛力。然而，基于FT-IR 技術(shù)無(wú)損檢測(cè)肉及肉制品中TVB-N 未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本文以臭鱖魚為研究對(duì)象，探究FT-IR 分析技術(shù)對(duì)臭鱖魚中TVB-N 檢測(cè)的可行性。

機(jī)器學(xué)習(xí)是當(dāng)前工業(yè)現(xiàn)代化背景下的研究熱點(diǎn)，被廣泛用于處理大量數(shù)據(jù)和建立與優(yōu)化各種模型。在光譜預(yù)處理上，Savitzky-Golay 平滑（Savitzky-golay smooth，S-GS）在濾除噪聲的同時(shí)可以確保信號(hào)的形狀，小波閾值去噪（wavelet threshold denoising，WTD）能在平滑的同時(shí)較好地保留反映原始信號(hào)特征的尖峰點(diǎn)，穩(wěn)健局部加權(quán)回歸（robust locally weighted regression，RLWR）在處理離群值時(shí)更為穩(wěn)健，模擬退火-偏最小二乘（simulated annealing-partial least squares，SAPLS）特征選擇具有跳出局部最小值而搜索全局最小值的特點(diǎn)[16-18]。在回歸分析方面，偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）和支持向量機(jī)（support vector machines，SVM）是兩種經(jīng)典的線性和非線性回歸建模方法。PLSR 通過(guò)將預(yù)測(cè)和觀測(cè)變量投影到新的變量空間，將復(fù)雜光譜變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)的潛變量（latent variables，LVs），廣泛應(yīng)用于變量多且高度共線時(shí)構(gòu)建預(yù)測(cè)模型[19]；SVM 應(yīng)用了一個(gè)非線性神經(jīng)元的隱藏層、一個(gè)輸出線性神經(jīng)元和一個(gè)專門的學(xué)習(xí)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了全局最優(yōu)值求解和對(duì)未知樣本良好的泛化能力，被廣泛用于回歸和分類等多種機(jī)器學(xué)習(xí)[20]。機(jī)器學(xué)習(xí)的應(yīng)用對(duì)于工業(yè)現(xiàn)代化具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

本文使用氣相FT-IR 獲取臭鱖魚揮發(fā)物的紅外光譜，利用移動(dòng)平均（moving average，MA）、S-GS、高斯濾波（gaussian filtering，GF）、RLWR 和WTD 對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，采用區(qū)間偏最小二乘（interval partial least squares，iPLS）和SA-PLS 進(jìn)行特征波段選擇，構(gòu)建PLSR 和SVM 檢測(cè)模型，以相對(duì)預(yù)測(cè)誤差（ratio of prediction deviation，RPD）確定較優(yōu)的預(yù)測(cè)模型，以期為研發(fā)臭鱖魚TVB-N 無(wú)損檢測(cè)技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臭鱖魚：市售，均為同一批發(fā)酵而成產(chǎn)品，質(zhì)量為（400±30）g，冰藏運(yùn)輸至合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室；甲基紅、溴甲酚綠、硼酸、鹽酸、氧化鎂、無(wú)水碳酸鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；E-switch 鋁箔氣體采樣袋：上海申源科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IS50 傅里葉變換紅外光譜儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；LHP-100 恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；K9860 全自動(dòng)凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；16 m 長(zhǎng)光程氣室：美國(guó)PIKE 技術(shù)公司。

1.3 樣品制備

將臭鱖魚分別裝入貯藏袋（材質(zhì)：PA/PE 復(fù)合性材料），置于恒溫恒培養(yǎng)濕箱（20 ℃、75%濕度）中進(jìn)行貯藏試驗(yàn)。分別在0、24、48 h 和72 h 取出12 條臭鱖魚樣本，使用氣體采樣袋收集揮發(fā)性氣體。

1.4 光譜采集

采用置換法減少氣體池內(nèi)氣體的影響，使用真空泵將氣體池內(nèi)氣體抽出，充入氮?dú)?，重?fù)3 次，在每個(gè)樣本采集前重復(fù)此操作。紅外光譜的譜儀參數(shù)設(shè)置：掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率0.5 cm-1，掃描頻率為64 次。使用真空泵將氣體池內(nèi)氣體抽出，直至壓力表顯示為-75 kPa，掃描獲取背景光譜。連接氣體采樣袋與氣體池，打開(kāi)進(jìn)氣口閥門和氣體采樣袋閥門，泵入揮發(fā)性氣體，至壓力表顯示為0，在相同條件下獲取樣本揮發(fā)物的紅外光譜，每個(gè)氣體樣本重復(fù)采集3 次，取平均值。共獲取48 個(gè)樣本的光譜，以36 個(gè)樣品作為校正集，用于建立預(yù)測(cè)模型，以12 個(gè)樣品作為測(cè)試集，用于對(duì)建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 揮發(fā)性鹽基氮檢測(cè)

參考GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[21]方法檢測(cè)魚肉中的揮發(fā)性鹽基氮。在獲得臭鱖魚揮發(fā)物紅外光譜后，將臭鱖魚各部位肉絞碎，取絞碎魚肉10 g（精確至0.001 g），加入100 mL 超純水，超聲輔助提取15 min，過(guò)濾，采用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定。

1.6 紅外光譜數(shù)據(jù)處理方法

1.6.1 平滑

基于窗口的平滑方法主要包括MA、S-GS、GF 和RLWR。MA 是對(duì)光譜的每個(gè)窗口進(jìn)行移動(dòng)平均，這種方法有利于減少數(shù)據(jù)的周期性趨勢(shì)；S-GS 是對(duì)光譜的每個(gè)窗口擬合的二次多項(xiàng)式進(jìn)行平滑處理，當(dāng)數(shù)據(jù)快速變化時(shí)，這種方法比其他方法更有效；GF 對(duì)每個(gè)窗口進(jìn)行移動(dòng)加權(quán)平均；RLWR 是對(duì)每個(gè)窗口進(jìn)行穩(wěn)健線性回歸，它在處理離群值時(shí)更為穩(wěn)健。通過(guò)改變平滑窗口長(zhǎng)度，分別對(duì)平滑后光譜建立預(yù)測(cè)模型，以預(yù)測(cè)結(jié)果的預(yù)測(cè)均方誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）選擇最優(yōu)窗口長(zhǎng)度。

在WTD 中，小波基函數(shù)、閾值類型和小波分解級(jí)別等參數(shù)的選擇均會(huì)對(duì)最終的信號(hào)去噪效果產(chǎn)生很大影響[22]。本文選擇多貝西小波，閾值類型包括硬閾值和軟閾值。通過(guò)改變消失矩、閾值類型和小波分解的級(jí)別，分別對(duì)平滑后光譜建立預(yù)測(cè)模型，以預(yù)測(cè)結(jié)果的RMSEP 選擇合適參數(shù)對(duì)光譜進(jìn)行平滑處理。

1.6.2 特征選擇

SA-PLS 的使用參考文獻(xiàn)[23]的方法，基于初始波段組合，構(gòu)建PLS 模型，以預(yù)測(cè)集R2p及RMSEP 作為SA 的適應(yīng)度函數(shù)，通過(guò)Metropolis 準(zhǔn)則以一定概率接受新的解集的思想，在全光譜內(nèi)搜索隨機(jī)變量，以促進(jìn)從局部最小值到全局最小值的移動(dòng)。其參數(shù)設(shè)置分別為子區(qū)間的長(zhǎng)度41 cm-1和數(shù)量5，初始波段組合861～820、921～880、1 162～1 121、2 844～2 803、3 085～3 044 cm-1，初始溫度700，外循環(huán)最大迭代次數(shù)600，鏈長(zhǎng)500，退溫速率0.95。

iPLS 被廣泛用于特征光譜區(qū)間的優(yōu)化選擇[24]。它是將整個(gè)光譜范圍劃分為n 個(gè)等長(zhǎng)的子區(qū)間，通過(guò)建立每個(gè)子區(qū)間的獨(dú)立PLSR 模型，以每個(gè)子模型的交叉驗(yàn)證的均方根誤差作為模型的判斷標(biāo)準(zhǔn)選取最優(yōu)的子區(qū)間組合，本文選擇5 個(gè)長(zhǎng)度為41 cm-1子區(qū)間作為新的光譜變量。

1.6.3 回歸模型

PLSR 是基于多元線性回歸改進(jìn)而來(lái)[25]，將復(fù)雜光譜變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)的LVs，以LVs 解釋的百分比方差和RMSEP 選擇合適的LVs 數(shù)量，建立TVB-N 預(yù)測(cè)模型。

SVM 是機(jī)器學(xué)習(xí)中伴隨人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)而出現(xiàn)的熱點(diǎn)，涉及到分類和回歸等許多實(shí)際問(wèn)題，參考文獻(xiàn)[26]的方法，采用MATLAB 2020a 中fitrsvm 函數(shù)建模，并使用自動(dòng)超參數(shù)優(yōu)化，找到使五折交叉驗(yàn)證損失最小的超參數(shù)，建立TVB-N 預(yù)測(cè)模型。

1.7 數(shù)據(jù)處理

光譜處理及預(yù)測(cè)模型構(gòu)建通過(guò)MATLAB 2020a 完成。顯著性分析通過(guò)SPSS Statistics 24 完成。圖形繪制采用Origin 2019b。

2 結(jié)果與分析

2.1 TVB-N 分析

TVB-N 隨貯藏時(shí)間的變化見(jiàn)圖1。

圖1 TVB-N 隨貯藏時(shí)間的變化Fig.1 Changes in TVB-N over storage time

由圖1 可知，新鮮臭鱖魚中TVB-N 為39.90 mg/100 g，在內(nèi)源酶和微生物的作用下，魚肉中蛋白質(zhì)被分解為堿性含氮物質(zhì)[27]，使得貯藏過(guò)程中TVB-N 顯著增加（P<0.05），在24、48 h 和72 h 后分別達(dá)到了56.12、68.31 mg/100 g和86.38 mg/100 g，接近限量標(biāo)準(zhǔn)的3 倍，高含量TVB-N不僅會(huì)降低臭鱖魚的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，食用也會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害[28]。因此，實(shí)現(xiàn)臭鱖魚發(fā)酵貯藏過(guò)程TVBN 的在線無(wú)損檢測(cè)對(duì)于消費(fèi)者健康至關(guān)重要。

2.2 紅外光譜分析

臭鱖魚在貯藏過(guò)程中釋放的揮發(fā)物產(chǎn)生了大量的特征紅外吸收峰，為去除水汽和二氧化碳吸收的影響，取1 300～780 cm-1和3 300～2 500 cm-1范圍的紅外光譜進(jìn)行分析。臭鱖魚揮發(fā)物紅外光譜見(jiàn)圖2。

圖2 臭鱖魚揮發(fā)物的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of volatiles from stinky mandarin fish

由圖2a 為1 300～780 cm-1范圍的紅外光譜，其中1 200～800 cm-1包含許多窄的吸收峰，這與魚肉釋放的氨有關(guān)，特別是在1 078、1 069 cm-1和966 cm-1，是氨的特征吸收峰[29]。圖2b 為3 300～2 500 cm-1范圍的紅外光譜，在3 150～2 750 cm-1產(chǎn)生的特征吸收主要與貯藏過(guò)程產(chǎn)生的胺類物質(zhì)有關(guān)[30]，尤其是三甲胺，它是TVB-N 的主要成分，也是被用來(lái)評(píng)估魚變質(zhì)程度的特征化合物，主要由魚肉中氧化三甲胺經(jīng)微生物作用而產(chǎn)生[28，31]；在2 650～2 550 cm-1范圍產(chǎn)生的特征吸收主要與甲硫醇相關(guān)，由含硫氨基酸在微生物作用下降解產(chǎn)生[32]。這些特征吸收峰與臭鱖魚變質(zhì)密切相關(guān)，且吸收峰強(qiáng)度與TVB-N 含量變化呈正相關(guān)。因此，結(jié)合紅外光譜和計(jì)量學(xué)分析對(duì)TVB-N 預(yù)測(cè)具有理論支撐。

采用MA、S-GS、GF 和RLWR 平滑方法，依次改變窗口長(zhǎng)度獲取對(duì)應(yīng)平滑處理后的光譜，并分別建立預(yù)測(cè)模型，其RMSEP 變化如圖3 所示。

圖3 4 種平滑方法在不同窗口長(zhǎng)度下建立的預(yù)測(cè)模型RMSEP 變化Fig.3 Changes in RMSEP of prediction models established by four smoothing methods with different window lengths

由圖3 可知，隨著窗口長(zhǎng)度的變化，MA、S-GS 和GF 對(duì)模型性能的影響均先提高后降低，分別在窗口長(zhǎng)度為17、31 和26 時(shí)模型最佳，RMSEP 分別為7.156 6、7.179 8 和7.150 4；RLWR 對(duì)RMSEP 的影響呈振蕩形式，在窗口長(zhǎng)度為22 時(shí)模型最佳，RMSEP 為5.7689。結(jié)果表明光譜平滑對(duì)于優(yōu)化模型至關(guān)重要。

采用小波閾值去噪對(duì)光譜進(jìn)行平滑處理，平滑光譜建立模型的RMSEP 變化見(jiàn)圖4。

圖4 小波閾值去噪在不同參數(shù)下建立的預(yù)測(cè)模型RMSEP 變化Fig.4 Change in RMSEP of prediction models established by wavelet threshold denoising with different parameters

由圖4 可知，圖4a 和圖4b 分別為硬閾值和軟閾值在不同消失矩和小波分解等級(jí)下，平滑后光譜所建立預(yù)測(cè)模型的RMSEP 變化。當(dāng)閾值類型為軟閾值，小波函數(shù)為db2，平滑等級(jí)為6 時(shí)，RMSEP 為6.991 9，優(yōu)于硬閾值（RMSEP=7.107 7）。原因在于軟閾值法將絕對(duì)值大于閾值的小波系數(shù)不完全保留，進(jìn)行收縮處理，使得小波系數(shù)整體連續(xù)性較好，避免附加振蕩信號(hào)產(chǎn)生[33]。

平滑后光譜結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 原始光譜及平滑后光譜Fig.5 Original spectra and smoothed spectra

由圖5 可知，對(duì)比于原始光譜，5 種平滑方法均有效減少了光譜中雜峰。雖然WTD 在平滑過(guò)程中有效保留光譜中的尖峰，如1 244 cm-1，但其平滑效果并不明顯，而MA、GF、S-GS 和RLWR 有效平滑了在990～930 cm-1和1 090～1 025 cm-1出現(xiàn)的大量雜峰，這也是氨及胺類物質(zhì)的特征吸收波段。結(jié)果表明，光譜平滑處理有效提高了光譜信噪比。

2.3 模型建立

基于原始光譜的PLSR 和SVM 模型對(duì)TVB-N 預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 基于原始光譜的PLSR 和SVM 模型對(duì)TVB-N 檢測(cè)Table 1 Detection of TVB-N by PLSR and SVM models based on raw spectra

表1 總結(jié)了PLSR 和SVM 回歸模型的校正集的R2c、測(cè)試集的RMSEP 和R2p，并以RPD 值評(píng)估模型的魯棒性。當(dāng)RPD 小于1.4 時(shí)，認(rèn)為所建模型不可靠；介于1.4～2.0，認(rèn)為所建模型較可靠；RPD 大于2.0，則認(rèn)為所建模型具備較高可靠性，能夠用于模型分析[34]。由表1 可知，構(gòu)建的SVM 預(yù)測(cè)模型R2p為0.870 9，RPD值為2.812 8，PLSR 預(yù)測(cè)模型R2p為0.853 2，RPD 值為2.542 3，模型均具備較高可靠性。良好的預(yù)測(cè)結(jié)果證明了通過(guò)揮發(fā)物的紅外光譜預(yù)測(cè)TVB-N 具有可行性。

平滑后光譜建立預(yù)測(cè)模型結(jié)果如表2 所示。

表2 基于5 種平滑處理方法的PLSR 和SVM 模型對(duì)TVB-N 檢測(cè)Table 2 Detection of TVB-N by PLSR and SVM models based on five smoothing methods

由表2 可知，5 種平滑方法對(duì)于TVB-N 檢測(cè)精度均具有積極影響。其中，RLWR 平滑處理結(jié)果最佳，可能由于該方法在平滑過(guò)程中將異常值賦予較小的權(quán)重。PLSR 預(yù)測(cè)模型R2p和RPD 分別為0.901 0 和3.247 0。因此，平滑對(duì)于提高FT-IR 工業(yè)在線檢測(cè)精度十分重要。

2.4 特征波段選擇與建模

盡管通過(guò)平滑處理減少了無(wú)用光譜信息，但模型的穩(wěn)健性仍具有提升空間。在RLWR 平滑光譜的基礎(chǔ)上，采用iPLS 和SA-PLS 對(duì)光譜進(jìn)行特征波段選擇，減少無(wú)關(guān)光譜變量，提高模型性能和運(yùn)行效率。對(duì)兩種方法各選擇了5 個(gè)長(zhǎng)度為41 cm-1的子區(qū)間，SAPLS 特征選擇結(jié)果（850～809、993～952、1 145～1 104、2 804～2 763、3 123～3 082 cm-1）和iPLS 特征選擇結(jié)果（821～780、944～903、985～944、1 067～1 026、1 108～1 067 cm-1）見(jiàn)圖6。

圖6 特征波段選擇結(jié)果Fig.6 Selection of characteristic wavebands

由圖6 可知，在SA-PLS 選取的5 個(gè)波段中，2 804～2 763、3 123～3 082 與胺的吸收相關(guān)，850～809、993～952、1 145～1 104 cm-1與氨吸收相關(guān)，而iPLS 只選擇了1 300～780 cm-1范圍內(nèi)的光譜特征，忽略胺類物質(zhì)在3 150～2 750 cm-1特征吸收。從選擇結(jié)果可知，SA-PLS優(yōu)于iPLS，這來(lái)源于SA 具有能跳出局部最小值搜索全局最小值的優(yōu)勢(shì)[35]。

特征波段選擇后光譜的建模結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 基于SA-PLS 和iPLS 特征選擇的PLSR 和SVM 模型對(duì)TVB-N 檢測(cè)Table 3 Detection of TVB-N by PLSR and SVM models based on SA-PLS and iPLS for feature selection

由表3 可知，SA-PLS 顯著優(yōu)于iPLS，雖然特征波段選擇減少了重要光譜信息，使得SVM 模型性能降低（R2p=0.886 4，RPD=2.892 2），但變量數(shù)量減少了84.46%，運(yùn)行效率得到顯著提升。RLWR-SA-PLS 模型預(yù)測(cè)結(jié)果R2p和RPD 分別為0.942 8 和4.005 0，模型具有可靠性，且優(yōu)于非線性模型SVM。因此，結(jié)合光譜信息與RLWR-SA-PLS 模型可以高精度檢測(cè)臭鱖魚TVB-N。

3 結(jié)論

TVB-N 是衡量臭鱖魚新鮮度的一項(xiàng)重要指標(biāo)，本文利用氣相FT-IR 結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)開(kāi)展臭鱖魚TVBN 含量的無(wú)損檢測(cè)技術(shù)研究。基于揮發(fā)物的紅外光譜建立PLSR 和SVM 兩種TVB-N 預(yù)測(cè)模型，模型可靠性較高（SVM，R2p=0.870 9，RPD=2.812 8），證明方案具有可行性；5 種光譜平滑處理結(jié)果表明，RLWR 不僅能有效平滑光譜雜峰，同時(shí)還可以提升模型性能（PLSR，R2p=0.901 0，RPD=3.247 0）；在此基礎(chǔ)上，由SAPLS 優(yōu)選的5 個(gè)特征波段（850～809、993～952、1 145～1 104、2 804～2 763、3 123～3 082 cm-1）可實(shí)現(xiàn)TVB-N的高精度預(yù)測(cè)（PLSR，R2p=0.942 8，RPD=4.005 0），RLWR-SA-PLS 實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)維度的明顯降低和識(shí)別效率的明顯提升。因此，基于氣相FT-IR 可以實(shí)現(xiàn)臭鱖魚中TVB-N 的無(wú)損檢測(cè)，具備工業(yè)在線應(yīng)用可行性。