孫康婷，陳勝軍，潘 創(chuàng)，胡 曉，鄧建朝，李春生

（1 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 廣東湛江 524088 2 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心 廣州 510300 3 三亞熱帶水產(chǎn)研究院 海南省深遠(yuǎn)海漁業(yè)資源高效利用與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南三亞 572000 4 大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連 116034）

南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）是世界上養(yǎng)殖最廣泛的甲殼類動(dòng)物之一。最早捕獲于太平洋，目前作為經(jīng)濟(jì)上重要的甲殼類資源，在亞洲和南美洲國(guó)家進(jìn)行商業(yè)養(yǎng)殖[1]。南美白對(duì)蝦營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白含量高，在運(yùn)輸和流通過(guò)程中品質(zhì)極易劣變，蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的氧化、降解和變性。隨著居民生活水平的提高，水產(chǎn)品的安全和營(yíng)養(yǎng)備受關(guān)注。如何在流通過(guò)程中行之有效地維持水產(chǎn)品品質(zhì)較為關(guān)鍵。溫度控制是流通過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)，低溫儲(chǔ)藏常被用于提高水產(chǎn)品的貨架期[2]。目前低溫保鮮技術(shù)根據(jù)溫度的不同分為冷藏、冰溫、微凍和凍藏[3]。近年來(lái)的研究表明微凍能顯著延長(zhǎng)水產(chǎn)品的保鮮期，約比冷藏保鮮延長(zhǎng)1.5～4 倍，尤其對(duì)耐凍性較差的水產(chǎn)品的保鮮效果更為顯著[4-5]。Ge 等[4]采用-5 ℃微凍結(jié)合明膠包埋哈氏仿對(duì)蝦（Parapenaeopsis hardwickii），研究發(fā)現(xiàn)，該保藏方法可有效抑制Ca2＋-ATPase 活力，降低pH、TVB-N 和TBA 值，使保藏期限達(dá)到23 d。劉歡等[6]發(fā)現(xiàn)，與冰藏（0 ℃）相比，微凍（-2 ℃）可較好地保持大鯢（Andrias davidianus）的肌肉品質(zhì)。

目前，品質(zhì)監(jiān)測(cè)預(yù)測(cè)模型在水產(chǎn)品質(zhì)量安全方面應(yīng)用較為廣泛[7]，如阿倫尼烏斯（Arrhenius）模型是這些產(chǎn)品最常用的方法，同時(shí)，徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Radial basis function neural network，RBFNN）模型也在水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。Xu 等[8]研究發(fā)現(xiàn)RBFNN 模型是預(yù)測(cè)-28～-12℃凍藏大管鞭蝦（Solenocera melantho）整個(gè)貯藏期品質(zhì)變化的有效工具，且RBFNN 模型優(yōu)于Arrhenius 模型。Liu 等[9]研究虹鱒魚(yú)（Oncorhynchus mykiss）魚(yú)片在9，6，3，0，-3 ℃貯藏過(guò)程中的菌落總數(shù)，電導(dǎo)率（EC）、K值、感官評(píng)價(jià)的變化，并建立前饋人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN），相對(duì)誤差均低于10%，可以作為虹鱒魚(yú)質(zhì)量變化建模的潛在工具。然而，目前鮮有微凍貯藏條件下南美白對(duì)蝦肌肉蛋白質(zhì)品質(zhì)變化和應(yīng)用RBFNN 預(yù)測(cè)品質(zhì)變化的模型報(bào)道。本文以南美白對(duì)蝦為研究對(duì)象，比較微凍（-3℃）貯藏條件下表面疏水性、Ca2+-ATPase、總巰基含量、羰基含量、TCA 溶解肽、肌原纖維小片化指數(shù)（Myofibril fragmentation index，MFI）、化學(xué)作用力（離子鍵、氫鍵、疏水相互作用力、二硫鍵）的變化，同時(shí)通過(guò)熒光分光光度計(jì)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析蛋白變化，用已有的蛋白質(zhì)變化數(shù)據(jù)建立RBFNN 品質(zhì)預(yù)測(cè)模型，旨在為南美白對(duì)蝦蛋白質(zhì)品質(zhì)的預(yù)測(cè)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活體南美白對(duì)蝦，廣東省廣州市華潤(rùn)萬(wàn)家超市，平均體質(zhì)量為（13.0±0.1）g/尾。

微量總巰基測(cè)試盒、超微量Ca2+ATPase 測(cè)試盒、羰基含量測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；NuPAGETMBis-Tris 預(yù)制膠（12%）、NuPAGETMMOPS SDS 電泳緩沖液（20×），英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；BeyoColorTM彩色預(yù)染蛋白、5X SDSPAGE 上樣緩沖液、考馬斯亮藍(lán)染色液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

T50 型均質(zhì)機(jī)，德國(guó)IKA 公司；Sigma-K30 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司；Sunrize 吸光酶標(biāo)儀，瑞士Tacan 公司；Cary Eclipse 熒光分光光 度計(jì)，美國(guó)VARIAN 公司；Mini Gel Tank PAGE 電泳系統(tǒng)，美國(guó)賽默飛科技公司；Image Scanner Ⅲ掃描儀，美國(guó)EPSON 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理 用碎冰使蝦猝死，流水清洗后去除頭部，吸干表面水分，將去頭蝦隨機(jī)分成7組，自封袋密封，置于-3 ℃冰箱中冷藏。分別在0，5，10，15，20，25，30 d 取出樣品，解凍后測(cè)定以下各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取和測(cè)定 參照孟粉等[7]的方法，提取肌原纖維蛋白。肌原纖維蛋白的含量用Bradford 法測(cè)定。

1.3.3 肌原纖維表面疏水性的測(cè)定 參照Chelh等[10]的方法，測(cè)定肌原纖維表面疏水性。

1.3.4 肌原纖維蛋白總巰基、羰基和Ca2+ATPase的測(cè)定 按照微量總巰基試劑盒、羰基試劑盒和Ca2+ATPase 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 TCA 溶解肽的測(cè)定 參照張喜才[11]和齊慧林[12]的方法，測(cè)定TCA 溶解肽。準(zhǔn)確稱取3 g 攪碎后的蝦肉，加入9 倍體積的5%三氯乙酸，冰?。?℃）條件下充分勻漿1 min，冰浴放置1 h，在4 ℃，5 000×g 離心5 min，取上清液1 mL 加入5 mL 混合液（A 液∶B 液按照體積比50∶1 混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。A 液：10 g NaCO3，2 g NaOH，0.5 g 酒石酸鉀鈉定容至500 mL；B 液：0.5 g CuSO4·5H2O 定容至500 mL），反應(yīng)10 min，再加入0.5 mL 的福林酚反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)680 nm 下測(cè)OD 值。同時(shí)配制30，60，90，120，150 μg/mL 質(zhì)量濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制波長(zhǎng)680 nm 下酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品所測(cè)的OD 值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到酪氨酸的含量，結(jié)果表示為每克肌肉中含有的酪氨酸的量（μmol 酪氨酸/g 肌肉）。

1.3.6 MFI 的測(cè)定 參照孫紅霞等[13]的方法，稍作修改。準(zhǔn)確稱取1 g 攪碎后的蝦肉，加入15 倍體積預(yù)冷的MFI 緩沖液（100 mmol/L KCl，11.2 mmol/L K2HPO4，8.8 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgCl2），冰?。? ℃）條件下充分勻漿1 min，過(guò)200 目篩，在2 ℃，1 000×g 離心15 min 后棄上清，于沉淀中加入15 倍體積的MFI 緩沖液，沉淀充分懸浮后相同條件下離心棄上清。沉淀用2.5 mL 預(yù)冷的MFI 緩沖液充分懸浮后，得肌原纖維蛋白懸浮液，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度至0.5 mg/mL，在波長(zhǎng)562 nm 處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，將所得結(jié)果乘以200 即可得到MFI 值。

1.3.7 分子作用力的測(cè)定 參考Sun 等[14]的方法，稍作修改。取2 g 樣品分別與10 mL 的SA（0.05 mol/L NaCl）、SB（0.6 mol/L NaCl）、SC（0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L 尿素）、SD（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L 尿素）和SE（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L 尿素+1.5 mol/L β-巰基乙醇）混合，在2 500 r/min 勻漿5 min 后，于4 ℃靜置1 h，8 000 r/min 離心10 min。用Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，確定離子鍵（SB 和SA 中溶解的蛋白質(zhì)含量之差）、氫鍵（SC和SB 中溶解的蛋白質(zhì)含量之差）、疏水相互作用力（SD 和SC 中溶解的蛋白質(zhì)含量之差）、二硫鍵（SE 和SD 中溶解的蛋白質(zhì)含量之差）含量。

1.3.8 內(nèi)源熒光強(qiáng)度的測(cè)定 參照石徑[15]的方法，稍作修改。用Tris-maleate 緩沖溶液（0.6 mol/L KCl-0.02 mol/L Tris-maleate，pH 7.0）將肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度調(diào)整至1 mg/mL，在激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)310～400 nm 掃描范圍，1 200 nm/min 掃描速度，5 nm 激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度的條件下測(cè)定內(nèi)源熒光強(qiáng)度圖譜。

1.3.9 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）參照Pan 等[16]的方法，將肌原纖維蛋白溶液與上樣緩沖液（5×）按照3∶1（V/V）比例混合后，沸水加熱5 min。用12%的預(yù)制凝膠在Mini Gel Tank PAGE 系統(tǒng)進(jìn)行SDS-PAGE 分析。上樣量統(tǒng)一為10 μg，加入膠孔中，以100 V 的恒壓電泳70 min。電泳結(jié)束后取下凝膠，考馬斯亮藍(lán)試劑盒進(jìn)行染色和脫色，使用Image Scanner Ⅲ掃描儀掃描電泳條帶。條帶的分子質(zhì)量通過(guò)與蛋白分子質(zhì)量Marker（6.5～270 ku）進(jìn)行比較確定。

1.3.10 徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（RBFNN）預(yù)測(cè)模型的建立 RBFNN 是一種線性良好的前向網(wǎng)絡(luò)，具有最佳逼近、訓(xùn)練簡(jiǎn)潔、學(xué)習(xí)收斂速度快以及克服局部最小值問(wèn)題的性能。RBF 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)由輸入層、隱藏層、輸出層構(gòu)成。RBFNN 預(yù)測(cè)模型采用SPSS Statistics 19 構(gòu)建[17]，選擇貯藏時(shí)間為因子，蛋白質(zhì)品質(zhì)特性指標(biāo)為因變量，其余參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)值進(jìn)行分析。

1.3.11 徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（RBFNN）預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證 采用模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值進(jìn)行比較，以驗(yàn)證預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性。采用均方誤差（Mean squared error，MSE），決定系數(shù)（R-Square，R2），相對(duì)誤差（%）來(lái)評(píng)估模型的預(yù)測(cè)精度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，使用SPSS Statistics 19對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性（P＜0.05）分析，并建立徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，采用Origin 2021 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏期間南美白對(duì)蝦表面疏水性、Ca2+-ATPase 的變化

蛋白質(zhì)表面疏水性、Ca2＋-ATPase 是衡量蛋白質(zhì)變性程度的有效指標(biāo)，蛋白質(zhì)變性時(shí)表面疏水性上升，Ca2＋-ATPase 活性下降[18]。肌原纖維蛋白表面疏水性可根據(jù)其與溴酚藍(lán)的結(jié)合能力來(lái)確定[19]。由圖1 可知，與新鮮的蝦相比，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)表面疏水性顯著增加（P＜0.05），溴酚藍(lán)結(jié)合量從43.13 μg 上升至68.12 μg，在30 d 內(nèi)上升了58%。這可能是由于蛋白質(zhì)之間的亞甲基的形成導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，進(jìn)而導(dǎo)致疏水氨基酸基團(tuán)如脂肪族和芳香族氨基酸的暴露[20]。

圖1 微凍過(guò)程中南美白對(duì)蝦表面疏水性、Ca2+-ATPase 的變化Fig.1 Changes in surface hydrophobicity，Ca2＋-ATPase of L.vannamei during partial freezing

同時(shí)由圖1 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，Ca2＋-ATPase 活性顯著下降（P＜0.05），從0.33 U/mg pro下降到0.13 U/mg prot，在30 d 內(nèi)下降率達(dá)到了60.6%，且貯藏前期下降較慢，在15 d 后下降速率比貯藏前期快。在貯藏期間，由于肌球蛋白構(gòu)象的改變和破壞，致使酶活中心崩塌，Ca2＋-ATPase 活性下降。同時(shí)，Ca2＋-ATPase 活性與巰基的氧化密切相關(guān)，尤其是肌球蛋白頭部的巰基[21]。

2.2 貯藏期間南美白對(duì)蝦總巰基、羰基的變化

總巰基含量是衡量蛋白質(zhì)氧化程度的一個(gè)指標(biāo)。由圖2 可知，新鮮樣品的總巰基含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)顯著下降（P＜0.05），所得結(jié)果與Ca2＋-ATPase 活性一致，且總巰基在貯藏初期的下降趨勢(shì)更加顯著。Chen 等[22]發(fā)現(xiàn)-3 ℃的南美白對(duì)蝦（L.vannamei）貯藏4 周后總巰基含量與0 周相比下降52.97%。本文與其研究結(jié)果相似，南美白對(duì)蝦在貯藏期間總巰基逐步下降，下降的原因可能是半胱氨酸殘基巰基被氧化成二硫鍵[23]。

圖2 微凍過(guò)程中南美白對(duì)蝦總巰基、羰基的變化Fig.2 Changes in total sulfhydryl content，carbonyl content of L.vannamei during partial freezing

由氨基酸殘基衍生的羰基化合物的形成被認(rèn)為是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)氧化的可靠指標(biāo)，這些氨基酸主要在肌原纖維蛋白中被檢出，肌原纖維蛋白是食品中蛋白質(zhì)的主要成分[24]。新鮮樣品的羰基含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)顯著上升（P＜0.05），此變化與總巰基含量的變化趨勢(shì)相反。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，水產(chǎn)品中肌原纖維蛋白的某些氨基酸殘基受到自由基的攻擊，氧化成羰基，因此羰基含量上升[18]。

2.3 貯藏期間南美白對(duì)蝦TCA 溶解肽、MFI 的變化

TCA 溶解肽含量反映了蛋白質(zhì)的降解情況[25]，TCA 溶解肽含量高，表明蛋白質(zhì)降解程度高。由圖3 可知，與新鮮的蝦相比，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)TCA 溶解肽顯著增加（P＜0.05），TCA-溶解肽含量從初始值（1.42±0.14）μmol 酪氨酸/g 肌肉增長(zhǎng)到30 d 的（6.29±0.14）μmol 酪氨酸/g 肌肉。初始水平（作為酪氨酸當(dāng)量）可能表示水產(chǎn)品中的內(nèi)源性寡肽以及收獲后處理過(guò)程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)品。TCA 溶解肽在貯存過(guò)程中含量的增加可能表明內(nèi)源性和微生物蛋白酶的活動(dòng)，蛋白質(zhì)持續(xù)發(fā)生溶解[26]。

圖3 微凍過(guò)程中南美白對(duì)蝦TCA 溶解肽、MFI 的變化Fig.3 Changes in TCA soluble peptides，MFI of L.vannamei during partial freezing

肌原纖維小片化指數(shù)（MFI）作為肌原纖維蛋白降解的有用標(biāo)志，既可以評(píng)估剪切力和肉嫩度，也可以評(píng)估肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)受到破壞的程度[27]。在本試驗(yàn)中隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，MFI 顯著增加（P＜0.05），且在貯藏15 d 后MFI 值增加速率加快。蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，使蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度降低，特別是構(gòu)成肌纖維束膜中的粗絲更容易溶解，導(dǎo)致MFI 值增加[28]。

2.4 貯藏期間南美白對(duì)蝦分子作用力的變化

離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵是維持蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的作用力。從表1 可以看出，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，離子鍵、氫鍵下降，而二硫鍵、疏水相互作用力上升。由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的巰基基團(tuán)在微凍過(guò)程中被氧化成二硫鍵，蛋白質(zhì)原有的結(jié)構(gòu)可能會(huì)受到化學(xué)鍵變化的影響。二硫鍵的形成導(dǎo)致肌凝蛋白重鏈聚集，肌原纖維蛋白的鹽溶性降低，導(dǎo)致離子鍵含量降低。此外，由于微凍貯藏期間蛋白質(zhì)的展開(kāi)和芳香族氨基酸的暴露，疏水相互作用力含量增加，氫鍵的數(shù)量隨著疏水相互作用的減少而增加[29]。

表1 微凍過(guò)程中南美白對(duì)蝦分子作用力的變化Table 1 Changes in intermolecular bonds of L.vannamei during partial freezing

2.5 貯藏期間南美白對(duì)蝦內(nèi)源熒光強(qiáng)度的變化

色氨酸熒光檢測(cè)廣泛應(yīng)用于跟蹤蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化，因?yàn)樯彼釟埩粑锏膬?nèi)在熒光對(duì)微環(huán)境的極性和熒光能量特別敏感[30]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)是折疊狀態(tài)時(shí)，色氨酸殘基主要位于蛋白質(zhì)內(nèi)核的疏水環(huán)境中，此時(shí)被激發(fā)的色氨酸的熒光強(qiáng)度相對(duì)較高。圖4 為微凍過(guò)程中南美白對(duì)蝦內(nèi)源熒光強(qiáng)度的變化，在激發(fā)波長(zhǎng)295 nm 的新鮮蝦肉的肌原纖維蛋白在335.93 nm 處具有最高的熒光強(qiáng)度，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)源熒光強(qiáng)度出現(xiàn)不同程度的降低，且在貯藏前期內(nèi)源熒光強(qiáng)度大幅度降低，隨后逐漸降低。熒光強(qiáng)度的逐漸降低表明長(zhǎng)期的貯藏會(huì)導(dǎo)致蝦肉肌原纖維蛋白色氨酸殘基的暴露和三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

圖4 微凍過(guò)程中南美白對(duì)蝦內(nèi)源熒光強(qiáng)度的變化Fig.4 Changes in endogenous fluorescence intensity of L.vannamei during partial freezing

2.6 貯藏期間南美白對(duì)蝦SDS-PAGE 的變化

SDS-PAGE 電泳圖譜中蛋白質(zhì)條帶的弱化、消失或新條帶的出現(xiàn)都是蛋白質(zhì)變性、降解的具體體現(xiàn)[31]。圖5 可以看到肌球蛋白重鏈和輕鏈、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和尚不明了的結(jié)構(gòu)性調(diào)節(jié)蛋白條帶，樣品在貯藏期間蛋白質(zhì)發(fā)生一定的變化，分子質(zhì)量175 ku 附近的蛋白質(zhì)在20 d 電泳條帶發(fā)生降解，分子質(zhì)量95 ku 附近的條帶在逐漸消失，在17～23 ku 之間條帶密度清晰而在貯藏后期減弱甚至消失，推測(cè)這些蛋白質(zhì)與對(duì)蝦品質(zhì)的變化相關(guān)，可能是由于外源蛋白酶將大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)降解形成小分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。電泳分析結(jié)果表明，在貯藏期間蝦肉肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生降解，且貯藏時(shí)間長(zhǎng)，蛋白質(zhì)降解程度高。

圖5 微凍過(guò)程中南美白對(duì)蝦SDS-PAGE 的變化Fig.5 Changes in SDS-PAGE of L.vannamei during partial freezing

2.7 徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型的建立

SPSS（Statistical package for the social science）軟件不僅具有數(shù)據(jù)管理、統(tǒng)計(jì)分析、圖表分析、輸出管理等基本統(tǒng)計(jì)功能，而且相比于Metlab等軟件，使用SPSS 建立RBFNN 模型免去了繁瑣的編程，具有簡(jiǎn)便、易操作的特點(diǎn)[32]。南美白對(duì)蝦在-3 ℃微凍貯藏過(guò)程中，蛋白質(zhì)品質(zhì)指標(biāo)的試驗(yàn)值用于RBFNN 模型的建立。圖6 是RBF 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從右到左依次是輸入層、隱藏層、輸出層。在本次試驗(yàn)預(yù)測(cè)模型的建立中，輸入層有10 個(gè)單元；隱藏層有8 個(gè)單元，激活函數(shù)為Softmax，隱藏層的單元是系統(tǒng)根據(jù)原始記錄特性計(jì)算的最佳結(jié)構(gòu)組成的；輸出層有7 個(gè)單元，激活函數(shù)為恒等式函數(shù)，誤差函數(shù)為平方和函數(shù)。

圖6 RBF 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)Fig.6 RBF neural network structure

2.8 徑向基函數(shù)（RBF）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證徑向基函數(shù)（RBF）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型對(duì)南美白對(duì)蝦微凍過(guò)程中蛋白質(zhì)品質(zhì)的預(yù)測(cè)效果，將模型對(duì)各指標(biāo)的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較，分別計(jì)算各指標(biāo)預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的均方誤差（MSE）和決定系數(shù)（R2），展示得出預(yù)測(cè)模型對(duì)每個(gè)指標(biāo)的擬合效果，同時(shí)，通過(guò)計(jì)算模型對(duì)每個(gè)指標(biāo)預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間的相對(duì)誤差來(lái)評(píng)價(jià)RBF神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)每個(gè)指標(biāo)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。預(yù)測(cè)模型相對(duì)誤差的可接受范圍為±10%，由表2 可知，建立的RBF 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型的相對(duì)誤差均在±10%以內(nèi)，試驗(yàn)結(jié)果整體顯示RBF 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度高，可以成為微凍貯藏過(guò)程中南美白對(duì)蝦蛋白質(zhì)品質(zhì)監(jiān)測(cè)可靠的模型。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首先對(duì)微凍貯藏期間南美白對(duì)蝦肌肉蛋白質(zhì)品質(zhì)特性指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，與鮮蝦相比，不同的試驗(yàn)組的肌肉蛋白均發(fā)生了不同程度的變性、氧化和降解，表現(xiàn)為表面疏水性、羰基含量、TCA溶解肽、肌原纖維小片化指數(shù)上升；Ca2+-ATPase、總巰基含量下降?；瘜W(xué)作用力的結(jié)果顯示貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，引起離子鍵、氫鍵含量上升和疏水相互作用力、二硫鍵含量的下降。通過(guò)色氨酸熒光強(qiáng)度的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，貯藏30 d 后熒光強(qiáng)度顯著降低，表明色氨酸所處的微環(huán)境發(fā)生了變化。SDS-PAGE 圖譜也顯示貯藏后期，大分子蛋白發(fā)生了不同程度的降解。最后利用SPSS 軟件建立RBFNN 模型，該模型的相對(duì)誤差均在±10%以內(nèi)，具有較高的預(yù)測(cè)精度和較好的擬合特性，可作為一種肌肉蛋白質(zhì)品質(zhì)變化的監(jiān)測(cè)模型，能夠較好地預(yù)測(cè)微凍南美白對(duì)蝦的肌肉蛋白質(zhì)品質(zhì)變化。