辛夢(mèng)娜，袁棟棟，2，3，劉國(guó)榮，2，3*，趙世博，韓 非

（1 北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 北京 100048 2 北京工商大學(xué) 老年?duì)I養(yǎng)與健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100048 3 北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京 100048）

肉類(lèi)，是人們攝取蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一。由于肉類(lèi)具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，因此更易受到微生物污染，導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)，引發(fā)食源性疾病。食品保鮮與防腐一直是科學(xué)研究與行業(yè)發(fā)展的重要議題。一直以來(lái)添加合成防腐劑與化學(xué)防腐劑是控制食品腐敗的有效手段。然而，化學(xué)防腐劑濫用或亂用引起的食品安全事件使得消費(fèi)者產(chǎn)生一些擔(dān)憂(yōu)。同時(shí)，不斷提高的物質(zhì)生活水平也使人們更加追求食品的品質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)健康。綠色健康、安全無(wú)害的天然防腐劑逐漸受到人們的關(guān)注與青睞[1-2]。

乳酸鏈球菌素（Nisin）是一種由34 個(gè)氨基酸組成的多肽分子，由乳酸菌產(chǎn)生，進(jìn)入人體后可被完全降解，安全無(wú)害，并且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有良好的抑制作用。乳酸鏈球菌素作為一種微生物來(lái)源的天然食品防腐劑已在世界上50 多個(gè)國(guó)家得到合法應(yīng)用，然而乳酸鏈球菌素對(duì)革蘭氏陰性菌和真菌沒(méi)有抑制作用，常與其它抑菌劑復(fù)配使用[3-4]。精油作為植物源的天然抑菌劑同樣具有安全健康的優(yōu)點(diǎn)。香芹酚是牛至精油中含量最高、最為有效的抑菌活性成分[5-6]，同時(shí)具有抗炎[7]、抗癌[8]的作用，然而香芹酚具有顯著的揮發(fā)性氣味，限制了其使用劑量。已有文獻(xiàn)表明，乳酸鏈球菌素和香芹酚具有良好的協(xié)同作用[9-12]，通過(guò)復(fù)配能夠相互彌補(bǔ)不足之處，充分發(fā)揮各自?xún)?yōu)勢(shì)。

然而，防腐劑的抑菌效果在實(shí)際使用過(guò)程中仍受到多種因素的影響，例如微生物因素，化學(xué)成分的生物活性，食品體系的內(nèi)在特性，以及各組分間的相互作用等[13]。已有文獻(xiàn)針對(duì)乳酸鏈球菌素和香芹酚在不同食品體系中的使用效果進(jìn)行了研究。在乳制品中，乳脂的含量與乳酸鏈球菌素的抑菌活性緊密相關(guān)，乳脂濃度增加使乳酸鏈球菌素的抑菌活性顯著下降甚至喪失，可能是由于乳酸鏈球菌素與乳脂球之間存在某些相互作用[14-17]。在熟制香腸的保藏中，乳酸鏈球菌素的回收率隨著脂肪含量的增加而降低[18]；而且肉中谷胱甘肽存在時(shí)也導(dǎo)致乳酸鏈球菌素回收率極大降低，通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二者發(fā)生結(jié)合[19]。一定濃度的鈣離子、鎂離子也造成乳酸鏈球菌素抑菌活性的損失[20]。同樣，在香芹酚抑菌活性的研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基環(huán)境中，香芹酚的最小抑菌濃度（MIC）隨葵花籽油含量的增加而顯著增大，蛋白提取物使MIC略有增大[21]。在烤雞、牛肉、豬肉等食品中應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，添加相同含量的牛至精油并沒(méi)有達(dá)到相同的抑菌效果，菌的數(shù)量都有所增加，體外試驗(yàn)的良好抑菌效果在實(shí)際應(yīng)用中并不明顯[22-24]。以上研究結(jié)果表明，抑菌劑或其活性成分與菌體直接接觸時(shí)，可以發(fā)揮良好的抑制或滅活作用，然而，當(dāng)被添加到一個(gè)復(fù)雜的食物系統(tǒng)中時(shí)，抑菌活性大大降低，顯然歸因于復(fù)雜的食品基質(zhì)成分干擾了其抑菌活性的發(fā)揮[3，13，17，25]。

目前，關(guān)于肉中哪些組分會(huì)對(duì)乳酸鏈球菌素和香芹酚抑菌活性存在影響還不明確。為此，本研究采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈直徑，采用肉湯稀釋法測(cè)定菌落總數(shù)，分別探究肉中多種組分對(duì)乳酸鏈球菌素與香芹酚抑菌活性的影響，旨在為食品防腐劑的減量增效研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 指示菌為單核增生李斯特氏菌（L.monocytogenes），中國(guó)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 原料與試劑 新鮮豬肉，物美超市；乳酸鏈球菌素、香芹酚、亞油酸、糖原，上海麥克林生化科技有限公司；賴(lài)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨酸、半胱氨酸、肌紅蛋白，Sigma-Aldrich 上海貿(mào)易有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、胰蛋白胨大豆固體培養(yǎng)基（TSA）、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（PCA），北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；鹽酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 電子天平，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；pH 計(jì)，安萊立思儀器科技（上海）有限公司；立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，致微（廈門(mén)）儀器有限公司；潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；微生物生長(zhǎng)曲線儀，德國(guó)BMG Micro-GCM；菌落計(jì)數(shù)儀Scan 4000，法國(guó)interscience；切碎機(jī)，小熊電器股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 指示菌的活化與菌懸液的準(zhǔn)備 取出凍存的單核增生李斯特氏菌（-80 ℃），解凍后按體積分?jǐn)?shù)1%接種于TSB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，連續(xù)活化3 代后用PCA 培養(yǎng)基測(cè)定活菌總數(shù)，約為109CFU/mL。將活化后的菌液在TSB 培養(yǎng)基中稀釋至2×106CFU/mL 備用。

1.2.2 肉中組分對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響

1.2.2.1 乳酸鏈球菌素抑菌活性的測(cè)定 采用瓊脂擴(kuò)散法（打孔）通過(guò)測(cè)定乳酸鏈球菌素的抑菌圈直徑大小來(lái)表征其抑菌活性。用無(wú)菌0.02 mol/L鹽酸溶液配制20 mg/mL 的乳酸鏈球菌素溶液，用無(wú)菌純水分別稀釋至10，5，2.5，1.25，0.625 mg/mL的乳酸鏈球菌素溶液。在無(wú)菌平板中加入1 mL 準(zhǔn)備好的菌懸液，倒入TSA 培養(yǎng)基（40～50 ℃），搖晃平板使菌懸液與培養(yǎng)基混勻，待培養(yǎng)基凝固，用牛津杯在合適位置打孔。孔中分別加入100 μL 不同質(zhì)量濃度的乳酸鏈球菌素溶液，同時(shí)，以等量的無(wú)菌0.02 mol/L 鹽酸溶液作為空白對(duì)照。每個(gè)樣品做3 次平行。將平板置于4 ℃下擴(kuò)散12 h，再轉(zhuǎn)移至37 ℃培養(yǎng)6～8 h，觀察抑菌圈，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.2.2 肉湯對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響

將從超市采購(gòu)的新鮮豬里脊肉，用無(wú)菌刀具切去表層，取里層組織肉用絞肉機(jī)絞碎，稱(chēng)取一定質(zhì)量肉糜于無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入無(wú)菌生理鹽水，均質(zhì)混勻，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的肉湯。再配制20%肉湯與2.5 mg/mL 乳酸鏈球菌素的混合樣品，均質(zhì)混勻。以2.5 mg/mL 的乳酸鏈球菌素溶液作為對(duì)照。將所有樣品置于4 ℃搖床（120 r/min）作用4 h，每個(gè)樣品各取100 μL 采用瓊脂擴(kuò)散法（打孔）測(cè)定乳酸鏈球菌素的抑菌活性，每個(gè)樣品做3 次平行。向每個(gè)樣品中接入1%指示菌，以不含樣品的菌懸液作為空白對(duì)照，置于37 ℃培養(yǎng)12 h，每個(gè)樣品各取1 mL，在無(wú)菌生理鹽水中連續(xù)10 倍稀釋至合適梯度，用PCA 平板測(cè)定菌落總數(shù)。

1.2.2.3 肌紅蛋白對(duì)乳酸鏈球菌素n 抑菌活性的影響 配制5 mg/mL 的乳酸鏈球菌素溶液，用無(wú)菌水配制5，2，0.5 mg/mL 的肌紅蛋白溶液，將乳酸鏈球菌素溶液與不同濃度的肌紅蛋白溶液等量混合，以乳酸鏈球菌素與等量無(wú)菌水混合為空白對(duì)照，乳酸鏈球菌素最終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，肌紅蛋白的最終質(zhì)量濃度為2.5，1，0.25，0 mg/mL。將所有樣品置于4 ℃搖床（120 r/min），分別在0，3，6，9，12，18，24，36，48 h 取樣，采用瓊脂擴(kuò)散法（打孔）測(cè)定乳酸鏈球菌素的抑菌活性，記錄抑菌圈直徑，每個(gè)樣品做3 次平行。

1.2.2.4 肌原纖維蛋白對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響 參考文獻(xiàn)[26]和[27]的方法提取肌原纖維蛋白，通過(guò)牛血清蛋白BCA 法測(cè)定所提取的蛋白質(zhì)量濃度為7.3 mg/mL。用無(wú)菌水稀釋獲得4，2，1，0.5 mg/mL 的肌原纖維蛋白，與5 mg/mL 的乳酸鏈球菌素溶液等量混合，以乳酸鏈球菌素與等量無(wú)菌水混合為空白對(duì)照，乳酸鏈球菌素最終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，肌纖蛋白的最終質(zhì)量濃度為2，1，0.5，0.25，0 mg/mL。將所有樣品置于4 ℃搖床（120 r/min）作用12 h 后取樣，采用瓊脂擴(kuò)散法（打孔）測(cè)定乳酸鏈球菌素的抑菌活性，記錄抑菌圈直徑，每個(gè)樣品做3 次平行。

1.2.2.5 亞油酸對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響向無(wú)菌水中加入亞油酸，保持55～65 ℃熱水浴高速攪拌（1 500 r/min）10 min，配制5 mg/mL 的亞油酸乳濁液，繼續(xù)稀釋獲得0.4，0.3，0.2，0.1，0.05 mg/mL 的亞油酸乳濁液，將不同質(zhì)量濃度的亞油酸乳濁液與5 mg/mL 的乳酸鏈球菌素溶液等量混合，以乳酸鏈球菌素與等量無(wú)菌水混合為空白對(duì)照，乳酸鏈球菌素最終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，亞油酸的最終質(zhì)量濃度分別為0.2，0.15，0.1，0.05，0.025，0 mg/mL。將所有樣品置于4 ℃搖床（120 r/min）作用12 h 后取樣，采用瓊脂擴(kuò)散法（打孔）測(cè)定乳酸鏈球菌素的抑菌活性，記錄抑菌圈直徑，每個(gè)樣品做3 次平行。

1.2.2.6 游離氨基酸對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響 根據(jù)肌肉中游離氨基酸的種類(lèi)及含量，選擇賴(lài)氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、甘氨酸（Gly）、精氨酸（Arg）、半胱氨酸（Cys）8 種L 型氨基酸，配制氨基酸溶液，分別與乳酸鏈球菌素等體積混合，乳酸鏈球菌素最終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，賴(lài)氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.05，0.5，5，20，40 mg/mL，亮氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.05，0.5，1，5，10 mg/mL，異亮氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.05，0.1，0.5，1，15 mg/mL，纈氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.01，0.1，1，10，30 mg/mL，蛋氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.05，0.5，1，10，25 mg/mL，甘氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.05，0.1，1，10，60 mg/mL，精氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.05，0.1，1，10，45 mg/mL，半胱氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.05，0.1，0.5，1，5 mg/mL。將所有樣品置于4 ℃搖床（120 r/min）混合作用12 h 后取樣，采用瓊脂擴(kuò)散法（打孔）測(cè)定乳酸鏈球菌素的抑菌活性，記錄抑菌圈直徑，每個(gè)樣品做3 次平行。

1.2.2.7 糖原對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響根據(jù)肌肉中碳水化合物的含量配制一系列質(zhì)量濃度梯度（10，4，2，1，0.2 mg/mL）的糖原溶液，與5 mg/mL 的乳酸鏈球菌素溶液等體積混合，以乳酸鏈球菌素與等量無(wú)菌水混合為空白對(duì)照，乳酸鏈球菌素最終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，糖原的最終質(zhì)量濃度為5，2，1，0.5，0.1，0 mg/mL。將樣品置于4℃搖床（120 r/min）作用12 h 后取樣，采用瓊脂擴(kuò)散法（打孔）測(cè)定乳酸鏈球菌素的抑菌活性，記錄抑菌圈直徑，每個(gè)樣品做3 次平行。

1.2.3 肉中組分對(duì)香芹酚抑菌活性的影響

1.2.3.1 香芹酚在肉糜中的抑菌效果 用無(wú)菌水配制100，50，30，10，5，1 mg/mL 的香芹酚儲(chǔ)備液。將從超市采購(gòu)的新鮮豬里脊肉，用無(wú)菌刀具切去表層，放入預(yù)先滅菌處理的絞肉機(jī)中絞碎。稱(chēng)取3份200 g 肉糜，分別加入20 mL 的100，50，30，10，5，1 mg/mL 香芹酚儲(chǔ)備液，攪拌混勻，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌樣品袋中，向200 g 豬肉中加入20 mL 的無(wú)菌水作為空白對(duì)照。香芹酚的最終含量分別是10，5，3，1，0.5，0.1，0 mg/g。將全部樣品轉(zhuǎn)移至25 ℃下貯存，在0，6，12，24，48 h 分別取樣25 g 置于無(wú)菌均質(zhì)袋中，向每份樣品中加入225 mL 無(wú)菌生理鹽水，均質(zhì)后得到1∶10 的樣液，繼續(xù)稀釋至合適梯度，用PCA 平板測(cè)定菌落總數(shù)。

1.2.3.2 MIC 的測(cè)定 將活化好的單核增生李斯特氏菌在TSB 培養(yǎng)基中稀釋至2×106CFU/mL。用無(wú)菌緩沖蛋白胨水（BWP）配制初始質(zhì)量濃度為20 mg/mL 的香芹酚溶液，用漩渦振蕩器混勻，繼續(xù)用無(wú)菌緩沖蛋白胨水稀釋香芹酚溶液至2，1，0.5，0.25 mg/mL。將稀釋好的菌液和二倍稀釋后的香芹酚溶液按體積比1∶1 混合均勻，以菌液和無(wú)菌蛋白胨水的混合體系作為空白對(duì)照，體系中香芹酚的最終質(zhì)量濃度為1，0.5，0.25，0.125，0 mg/mL。每個(gè)試樣分別取200 μL 加入到96 孔板中，用酶標(biāo)儀記錄OD600nm初始值，將所有試樣在37 ℃下培養(yǎng)24 h 后再次測(cè)定OD600nm，OD600nm無(wú)明顯變化的最低抑菌劑濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.3.3 肌紅蛋白對(duì)香芹酚抑菌活性的影響 用無(wú)菌水配制1 mg/mL 香芹酚乳濁液，分別稱(chēng)取一定質(zhì)量肌紅蛋白于無(wú)菌管中，再分別加入1 mg/mL香芹酚溶液，混合均勻，使肌紅蛋白質(zhì)量濃度分別為20，14，8，2 mg/mL，置于4 ℃作用12 h。取不同質(zhì)量濃度的肌紅蛋白和香芹酚的混合液各1 mL，分別加入1 mL 菌懸液，混合均勻，以菌液加香芹酚溶液的樣品為空白對(duì)照，以菌液加無(wú)菌水的樣品為陽(yáng)性對(duì)照。肌紅蛋白的最終質(zhì)量濃度為10，7，4，1，0 mg/mL，香芹酚的質(zhì)量濃度（MIC）是0.5 mg/mL。將樣品置于37 ℃下培養(yǎng)，分別在0，3，6，9，12 h 取樣100 μL，用無(wú)菌緩沖蛋白胨水10 倍稀釋至合適濃度，涂布于TSA 培養(yǎng)基上，置于37℃下培養(yǎng)24 h，記錄活菌總數(shù)。

1.2.3.4 肌原纖維蛋白對(duì)香芹酚抑菌活性的影響用無(wú)菌水配制7.3，3.65，1.825 mg/mL 的肌原纖維蛋白，與2 mg/mL 香芹酚溶液等量混合制成混合反應(yīng)液，置于4 ℃下作用12 h。分別取混合液各1 mL，分別加入1 mL 菌懸液，混合均勻，以菌液加香芹酚溶液的樣品為空白對(duì)照，以菌液加無(wú)菌水的樣品為陽(yáng)性對(duì)照。肌纖蛋白的最終質(zhì)量濃度分別為1.825，0.9，0.45，0 mg/mL，香芹酚的MIC 是0.5 mg/mL。將樣品置于37 ℃下培養(yǎng)，在0，3，6，9，12 h 分別取樣測(cè)定活菌總數(shù)。

1.2.3.5 亞油酸對(duì)香芹酚抑菌活性的影響 向無(wú)菌水中加入亞油酸，保持55～65 ℃熱水浴高速攪拌（1 500 r/min）10 min，配制5 mg/mL 的亞油酸乳濁液，繼續(xù)稀釋獲得0.8，0.4，0.2 mg/mL 的亞油酸乳濁液，將不同質(zhì)量濃度的亞油酸乳濁液與2 mg/mL 香芹酚溶液等量混合，將所有混合反應(yīng)液置于4 ℃下作用12 h。分別取混合液各1 mL，分別加入1 mL 菌懸液，混合均勻，以菌液加香芹酚溶液的樣品為空白對(duì)照，以菌液加無(wú)菌水的樣品為陽(yáng)性對(duì)照。亞油酸的最終質(zhì)量濃度為0.2，0.1，0.05，0 mg/mL，香芹酚的MIC 為0.5 mg/mL。將樣品置于37 ℃下培養(yǎng)，分別在0，3，6，9，12 h 取樣測(cè)定活菌總數(shù)。

1.2.3.6 游離氨基酸對(duì)香芹酚抑菌活性的影響配制賴(lài)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨酸、半胱氨酸的溶液，分別與2 mg/mL 香芹酚溶液在4 ℃下混合作用12 h，分別取不同混合液各1 mL，分別加入1 mL 菌懸液，混合均勻，以菌液加香芹酚溶液的樣品為空白對(duì)照，以菌液加無(wú)菌水的樣品為陽(yáng)性對(duì)照。游離氨基酸的質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，香芹酚的MIC 是0.5 mg/mL。將樣品置于37 ℃下培養(yǎng)12 h 后，測(cè)定活菌總數(shù)。

1.2.3.7 糖原對(duì)香芹酚抑菌活性的影響 配制一系列不同質(zhì)量濃度（10，4，2，1，0.2 mg/mL）的糖原溶液，與2 mg/mL 香芹酚溶液以1∶1 的體積比混合，在4 ℃下作用12 h，取各混合液1 mL，加入1 mL 菌懸液，混合均勻，以菌液加香芹酚溶液的樣品為空白對(duì)照，以菌液加無(wú)菌水的樣品為陽(yáng)性對(duì)照。糖原的最終質(zhì)量濃度為5，2，1，0.5，0.1，0 mg/mL，香芹酚的MIC 為0.5 mg/mL。將樣品置于37℃下培養(yǎng)12 h 后，測(cè)定活菌總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉中組分對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響

2.1.1 乳酸鏈球菌素的抑菌活性 以單核增生李斯特菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑來(lái)表征乳酸鏈球菌素的抑菌活性。如圖1所示，乳酸鏈球菌素具有良好的抑菌作用，隨著乳酸鏈球菌素質(zhì)量濃度逐漸增大，抑菌圈直徑逐漸增大，當(dāng)乳酸鏈球菌素的質(zhì)量濃度為0.625 mg/mL時(shí)，仍然具有抑菌效果，推斷乳酸鏈球菌素的最小抑菌濃度小于0.625 mg/mL。當(dāng)乳酸鏈球菌素的質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到了20 mm，因此選擇2.5 mg/mL 的乳酸鏈球菌素，采用瓊脂擴(kuò)散法考察肉中組分對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響。

圖1 乳酸鏈球菌素的抑菌活性Fig.1 The antibacterial activity of nisin

2.1.2 肉湯對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響 通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑和菌落總數(shù)分別考察了鮮肉組分是否會(huì)對(duì)乳酸鏈球菌素的活性產(chǎn)生影響。如圖2a 所示，與乳酸鏈球菌素對(duì)照組相比，肉湯與乳酸鏈球菌素混合的試驗(yàn)組無(wú)抑菌圈，乳酸鏈球菌素已無(wú)抑菌效果；如圖2b 所示，乳酸鏈球菌素的對(duì)照組中無(wú)菌生長(zhǎng)，而肉汁與乳酸鏈球菌素混合的試驗(yàn)組的菌落總數(shù)大幅度升高，達(dá)到了107CFU/mL。結(jié)果表明，肉汁影響了乳酸鏈球菌素的抑菌活性，與溶液中的乳酸鏈球菌素相比，肉湯中的乳酸鏈球菌素的抑菌活性下降，這可能是由于肉湯中復(fù)雜的組分與乳酸鏈球菌素之間存在某些效應(yīng)，抑制了乳酸鏈球菌素抑菌活性的發(fā)揮。

圖2 肉湯對(duì)乳酸鏈球菌素的抑菌活性的影響Fig.2 The effect of broth on the antibacterial activity of nisin

2.1.3 肌紅蛋白對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響肌紅蛋白是決定肉的顏色的重要組分，通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑的變化探索了其對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響。如圖3 所示，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，乳酸鏈球菌素的抑菌圈直徑逐漸減小，乳酸鏈球菌素的抑菌活性受到了抑制；而且，肌紅蛋白的質(zhì)量濃度與乳酸鏈球菌素的抑菌活性呈反比，肌紅蛋白的質(zhì)量濃度越大，乳酸鏈球菌素的抑菌活性越弱。圖3a 為作用24 h 后乳酸鏈球菌素的抑菌圈直徑圖，可以觀察到抑菌圈明顯減小，當(dāng)肌紅蛋白的質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，乳酸鏈球菌素幾乎無(wú)抑菌圈，肌紅蛋白削弱了乳酸鏈球菌素的抑菌活性，影響效果顯著。

圖3 肌紅蛋白對(duì)乳酸鏈球菌素的抑菌活性的影響Fig.3 The effect of myoglobin on the antibacterial activity of nisin

2.1.4 肌原纖維蛋白對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響 肌原纖維蛋白是肉中含量最多的一類(lèi)蛋白，約占蛋白組分的50%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑探索肌原纖維蛋白對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肌原纖維蛋白對(duì)乳酸鏈球菌素的抑菌活性有不利影響。如圖4 所示，作用12 h 后，乳酸鏈球菌素的抑菌圈明顯減小，肌原纖維蛋白的質(zhì)量濃度越大，對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響效果越大，抑菌圈越?。划?dāng)加入的肌原纖維蛋白的質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時(shí)，乳酸鏈球菌素已無(wú)抑菌圈。

圖4 肌原纖維蛋白對(duì)乳酸鏈球菌素的抑菌活性的影響Fig.4 The effect of myofibrillar protein on the antibacterial activity of nisin

2.1.5 亞油酸對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響亞油酸在肌肉組織中含量大約占10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），是肌肉脂肪組織中含量最高的多不飽和脂肪酸，通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑探索亞油酸對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響。結(jié)果顯示，亞油酸會(huì)減弱乳酸鏈球菌素的抑菌活性。如圖5 所示，乳酸鏈球菌素與亞油酸作用12 h 后，乳酸鏈球菌素的抑菌圈直徑逐漸減小，并且與亞油酸的質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)，質(zhì)量濃度越大時(shí)抑菌圈直徑越小，直至沒(méi)有明顯的抑菌區(qū)域。

圖5 亞油酸對(duì)乳酸鏈球菌素的抑菌活性的影響Fig.5 The effect of linoleic acid on the antibacterial activity of nisin

2.1.6 游離氨基酸和糖原對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響 肌肉組織中含有多種游離氨基酸，氨基酸種類(lèi)和含量是評(píng)價(jià)肌肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，同時(shí)，一些呈味氨基酸也是肉制品風(fēng)味的重要來(lái)源；而肌肉組織中的碳水化合物主要是肌糖原，含量在1.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）左右。通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑探索多種游離氨基酸和糖原對(duì)乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響，結(jié)果顯示，游離氨基酸和糖原對(duì)乳酸鏈球菌素的抑菌活性無(wú)明顯影響。如圖6～7 所示，乳酸鏈球菌素的抑菌圈直徑大小基本一樣，沒(méi)有隨氨基酸種類(lèi)與質(zhì)量濃度的不同而發(fā)生變化，也沒(méi)有隨糖原質(zhì)量濃度的不同而發(fā)生變化，說(shuō)明游離氨基酸和糖原不是影響乳酸鏈球菌素抑菌活性的組分。

圖6 多種游離氨基酸對(duì)乳酸鏈球菌素的抑菌活性的影響Fig.6 The effect of several free linoleic acids the on antibacterial activity of nisin

圖7 糖原對(duì)乳酸鏈球菌素的抑菌活性的影響Fig.7 The effect of glycogen on the antibacterial activity of nisin

圖8 在常溫條件下不同質(zhì)量濃度的香芹酚處理豬肉糜的菌落總數(shù)變化Fig.8 Changes of total number of bacteria in pork ground treated with different mass concentrations of carvacrol at room temperature

2.2 肉中組分對(duì)香芹酚抑菌活性的影響

2.2.1 香芹酚在肉糜中的抑菌效果 用不同質(zhì)量濃度的香芹酚處理豬肉糜，在常溫條件（25 ℃）下貯藏，通過(guò)測(cè)定菌落總數(shù)的變化來(lái)評(píng)價(jià)香芹酚的抑菌效果。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，10 mg/mL 的香芹酚可以保證肉糜在48 h 內(nèi)無(wú)微生物生長(zhǎng)；5 mg/mL 的香芹酚可以很好地抑制微生物生長(zhǎng)，在48 h 時(shí)菌落總數(shù)在104CFU/g 左右；3 mg/mL 的香芹酚可以控制微生物在48 h 內(nèi)菌落總數(shù)在106CFU/g 左右，在24 h 時(shí)菌落總數(shù)在102CFU/g 左右；當(dāng)香芹酚質(zhì)量濃度在1 mg/mL 及以下時(shí)，不能很好的抑制微生物生長(zhǎng)，24 h 時(shí)菌落總數(shù)接近106CFU/g。

2.2.2 香芹酚對(duì)抗單核增生李斯特氏菌的MIC測(cè)定了單核增生李斯特氏菌在不同質(zhì)量濃度的香芹酚處理下的生長(zhǎng)狀況，從圖9 可以看出，當(dāng)初始菌落數(shù)約為2×106CFU/mL 時(shí)，不同濃度的香芹酚對(duì)指示菌有一定的抑制作用，當(dāng)香芹酚的質(zhì)量濃度在0.25 mg/mL 及以下時(shí)，不能抑制香芹酚生長(zhǎng)，當(dāng)大于0.5 mg/mL 及以上時(shí)，抑制效果明顯，因此推斷香芹酚對(duì)單核增生李斯特氏菌的MIC 為0.5 mg/mL。

圖9 單核增生李斯特氏菌在不同香芹酚處理下的生長(zhǎng)曲線Fig.9 Growth curves of L.monocytogenes treated with different carvacrol

2.2.3 肌紅蛋白對(duì)香芹酚抑菌活性的影響 在接入2×106CFU/mL 指示菌的TSB 肉湯中加入0.5 mg/mL 的香芹酚，再加入不同質(zhì)量濃度的肌紅蛋白，通過(guò)測(cè)定體系中菌落總數(shù)變化來(lái)探究肌紅蛋白對(duì)香芹酚抑菌活性的影響。結(jié)果顯示，肌紅蛋白對(duì)香芹酚的抑菌活性產(chǎn)生了不利影響。如圖10 所示，0 h 時(shí)，加入4 mg/mL 及更高質(zhì)量濃度肌紅蛋白的體系中有菌生長(zhǎng)，而菌落數(shù)仍然小于陽(yáng)性對(duì)照組，而加入1 mg/mL 和不加肌紅蛋白的體系無(wú)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明足夠大濃度的肌紅蛋白對(duì)香芹酚的抑菌活性造成了不利影響。這種不利影響在3 h的取樣結(jié)果中依然可以體現(xiàn)。通過(guò)6 h 取樣結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)香芹酚逐漸發(fā)揮了最大的抑菌能力，基本無(wú)活菌存在，而在添加10 mg/mL肌紅蛋白的體系中依然有2.5 lg（CFU/mL）的菌。從9 h 的取樣結(jié)果發(fā)現(xiàn)，香芹酚的抑菌能力逐漸失效，菌落總數(shù)增長(zhǎng)，而添加肌紅蛋白的體系中菌落總數(shù)均大于空白對(duì)照組，且隨肌紅蛋白質(zhì)量濃度的增大而增加。以上結(jié)果表明，在模擬肉湯環(huán)境中，質(zhì)量濃度較大的肌紅蛋白會(huì)使香芹酚的抑菌活性下降。然而，老齡牛肉中肌紅蛋白的含量是16～20 mg/g，老齡豬肉中含量為8～12 mg/g，老齡羊肉中含量為12～18 mg/g[28]，因此，在實(shí)際應(yīng)用中，肉中的肌紅蛋白可能會(huì)削弱香芹酚的抑菌效果。

圖10 肌紅蛋白對(duì)香芹酚抑菌活性的影響Fig.10 The effect of myoglobin on the antibacterial activity of carvacrol

2.2.4 肌原纖維蛋白對(duì)香芹酚抑菌活性的影響在接入2×106CFU/mL 指示菌的TSB 肉湯中加入0.5 mg/mL 的香芹酚與不同質(zhì)量濃度的肌原纖維蛋白，通過(guò)測(cè)定體系中菌落總數(shù)變化來(lái)探究肌原纖維蛋白對(duì)香芹酚抑菌活性的影響。結(jié)果顯示，肌原纖維蛋白對(duì)香芹酚抑菌活性產(chǎn)生了一定的抑制作用。如圖11 所示，在0，3 h 的樣品中發(fā)現(xiàn)，加入1.825 mg/mL 與0.9 mg/mL 肌纖維蛋白的體系中有指示菌生長(zhǎng)，而加入0.45 mg/mL 與不加肌纖維蛋白的體系沒(méi)有菌生長(zhǎng)，這表明肌纖維蛋白的對(duì)香芹酚的抑菌活性產(chǎn)生了抑制作用。同樣在6，9，12 h 的結(jié)果中也能觀察到抑制作用，且肌原纖維蛋白的質(zhì)量濃度越大，對(duì)香芹酚的影響越大。

圖11 肌原纖維蛋白對(duì)香芹酚抑菌活性的影響Fig.11 The effect of myofibrillar protein on the antibacterial activity of carvacrol

2.2.5 亞油酸對(duì)香芹酚抑菌活性的影響 在接入2×106CFU/mL 指示菌的TSB 肉湯中加入0.5 mg/mL 的香芹酚與不同質(zhì)量濃度的亞油酸，通過(guò)測(cè)定體系中菌落總數(shù)變化來(lái)探究亞油酸對(duì)香芹酚抑菌活性的影響。結(jié)果顯示，亞油酸對(duì)香芹酚的抑菌活性存在不利影響。如圖12 所示，前6 h 加入不同質(zhì)量濃度的亞油酸組分與空白對(duì)照的抑菌效果基本保持一致，而9，12 h 取樣結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，加入0.1 mg/mL 與0.2 mg/mL 亞油酸的體系中，菌落總數(shù)大于空白對(duì)照，說(shuō)明亞油酸對(duì)香芹酚的抑菌活性產(chǎn)生了抑制，且抑制作用強(qiáng)弱與亞油酸質(zhì)量濃度存在正相關(guān)關(guān)系。

圖12 亞油酸對(duì)香芹酚抑菌活性的影響Fig.12 The effect of linoleic acid on the antibacterial activity of carvacrol

2.2.6 游離氨基酸和糖原對(duì)香芹酚抑菌活性的影響 通過(guò)測(cè)定體系中菌落總數(shù)的變化探究多種游離氨基酸和糖原對(duì)香芹酚抑菌活性的影響，結(jié)果顯示，游離氨基酸和糖原對(duì)乳酸鏈球菌素的抑菌活性無(wú)明顯影響。如圖13 所示，加入游離氨基酸的試驗(yàn)組中菌落總數(shù)與空白對(duì)照基本保持一致，沒(méi)有明顯的上升趨勢(shì)。如圖14 顯示，在加入不同質(zhì)量濃度的糖原體系中，與空白對(duì)照相比也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)菌落總數(shù)的上升，說(shuō)明游離氨基酸和糖原并不是影響香芹酚抑菌活性的組分。

圖13 多種游離氨基酸對(duì)香芹酚抑菌活性的影響Fig.13 The effect of several free linoleic acids on the antibacterial activity of carvacrol

圖14 糖原對(duì)香芹酚抑菌活性的影響Fig.14 The effect of glycogen on the antibacterial activity of carvacrol

3 討論與結(jié)論

本研究在單一變量的模擬環(huán)境中，明確了肉中哪些組分對(duì)乳酸鏈球菌素和香芹酚的抑菌活性產(chǎn)生影響。其中，蛋白組分包括水溶性的肌紅蛋白和水不溶性的肌原纖維蛋白都對(duì)乳酸鏈球菌素和香芹酚的抑菌活性產(chǎn)生了不利影響；其次，亞油酸對(duì)乳酸鏈球菌素和香芹酚的抑菌活性也產(chǎn)生了一定的抑制作用；另外，多種游離氨基酸和糖原對(duì)乳酸鏈球菌素和香芹酚的抑菌活性未見(jiàn)明顯影響。有文獻(xiàn)探明食物中的酪蛋白、卵磷脂對(duì)乳酸鏈球菌素的抑菌活性有負(fù)面影響[29]。黃現(xiàn)青等[30]發(fā)現(xiàn)高濃度亞油酸對(duì)脂肽類(lèi)抗菌肽（Surfactin）滅活芽孢具有負(fù)面影響，本試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。有大量文獻(xiàn)研究[31-32]表明食物蛋白組分與添加劑中活性分子之間存在相互作用，形成沉淀物、凝聚體或復(fù)合物，改變蛋白結(jié)構(gòu)的同時(shí)也可能會(huì)影響小分子的活性。例如，牛乳中的乳清蛋白與表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）發(fā)生共價(jià)結(jié)合，改性后的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，具有更好的發(fā)泡和乳化性能[33]，且復(fù)合物抗氧化活性明顯增強(qiáng)[34]。然而，乳清蛋白與ε-聚賴(lài)氨酸之間主要通過(guò)靜電相互作用形成凝聚物，不僅影響食品體系的穩(wěn)定性，而且削弱了ε-聚賴(lài)氨酸的抑菌效果[35]。重要的是，已有文獻(xiàn)報(bào)道香芹酚與肌原纖維蛋白、牛血清蛋白之間存在結(jié)合相互作用[36-37]?；谝陨涎芯客茰y(cè)，乳酸鏈球菌素和香芹酚與肌紅蛋白和肌原纖維蛋白可能存在相互作用，導(dǎo)致抑菌活性減弱。雖然關(guān)于天然活性分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用研究成果很多，但是它們與脂類(lèi)組分之間的非共價(jià)相互作用研究卻較少，關(guān)于脂肪組分對(duì)乳酸鏈球菌素和香芹酚抑菌活性影響的具體機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道，還需進(jìn)一步研究。不過(guò)也有文獻(xiàn)綜述提及類(lèi)黃酮類(lèi)分子與脂質(zhì)雙分子層存在相互作用，將多酚包埋于納米脂質(zhì)體中制備運(yùn)載體系等[38-39]。因此，亞油酸作為一種油性分子可能對(duì)乳酸鏈球菌素和香芹酚產(chǎn)生一定的吸附作用，附著在分子表面，使之無(wú)法有效擴(kuò)散，不能與菌體直接接觸，從而使其抑菌效果下降，也有可能是亞油酸與抑菌劑分子發(fā)生疏水性結(jié)合，從而影響了結(jié)構(gòu)微環(huán)境導(dǎo)致其抑菌活性改變。

本研究明確了肉中多種組分對(duì)乳酸鏈球菌素和香芹酚的抑菌活性存在不利影響，對(duì)指導(dǎo)理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐具有重要意義。綜上，接下來(lái)將構(gòu)建單一模擬體系，針對(duì)肌紅蛋白、亞油酸與乳酸鏈球菌素、香芹酚之間的具體互作機(jī)制展開(kāi)研究，以期豐富應(yīng)用這類(lèi)天然抑菌劑的理論研究。