張雪嬌,王 月,范 濤,成 昭

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,陜西 西安 710021)

重樓是一種傳統(tǒng)中藥材,通常以根莖入藥,具有消腫止痛、涼肝定驚等功效,常用于治療蛇蟲(chóng)咬傷、跌撲傷痛、疔瘡癰腫等癥。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),重樓的主要活性成分甾體皂苷具有抗菌消炎、鎮(zhèn)痛止血及抗腫瘤等藥理活性[1],其中重樓皂苷Ⅰ的抗腫瘤活性已成為研究熱點(diǎn)。鄧碧凡等[2]通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧條件下的喉癌Hep-2細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用;陳舒怡等[3]研究發(fā)現(xiàn),重樓皂苷Ⅰ可通過(guò)線粒體破碎快速誘導(dǎo)肺癌NCI-H661細(xì)胞的凋亡;龐曉輝等[4]研究發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞經(jīng)重樓皂苷Ⅰ處理后,其Bax和Caspass-3蛋白表達(dá)水平有所升高,進(jìn)而介導(dǎo)癌細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞的凋亡。

重樓皂苷Ⅰ的提取一般采用有機(jī)溶劑回流法,以乙醇為提取溶劑,易操作、成本低,但提取率較低[5-6]。童立雷等[7]利用纖維素酶對(duì)植物細(xì)胞壁的破碎作用,以70%乙醇為提取溶劑,采用超聲輔助酶法提取重樓總皂苷,并通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝;劉江等[8]采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了南重樓中4種重樓皂苷的超聲提取工藝,并對(duì)優(yōu)化工藝進(jìn)行了方法學(xué)考察。近年來(lái),微波法越來(lái)越多地應(yīng)用于中藥活性成分的提取[9-10]。因此,作者采用微波法提取重樓皂苷Ⅰ,并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝,為重樓藥材的深入開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

重樓,采自陜西漢中鎮(zhèn)巴山區(qū),經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室張彥副教授鑒定為百合科重樓屬植物的干燥根莖。

重樓皂苷Ⅰ對(duì)照品(>98%),優(yōu)級(jí)純,寶雞辰光生物科技有限公司;95%乙醇、無(wú)水甲醇,分析純,天津歐博凱化工有限公司;甲醇、乙腈,優(yōu)級(jí)純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

Agilent 1260型高效液相色譜儀(C18色譜柱,250 mm×4.6 mm),美國(guó)Agilent科技有限公司;XH-300A型電腦微波超聲波組合合成萃取儀,北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;ALC-210.4型電子天平,北京賽多利斯科技儀器有限公司;微孔濾膜(0.45 μm),天津杉羽科技有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵,鞏義予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 重樓皂苷Ⅰ的提取

重樓自然晾干,50 ℃烘至恒重,粉碎過(guò)篩,得粗粉,置于干燥器儲(chǔ)存?zhèn)溆?。稱取1.00 g重樓粗粉置于50 mL潔凈干燥的三頸燒瓶中,加入一定量的乙醇,在萃取儀中提取一定時(shí)間,冷卻至室溫,抽濾,濾液用乙醇定容至50 mL容量瓶中,即得重樓皂苷Ⅰ提取液。

1.3 重樓皂苷Ⅰ的微波提取工藝優(yōu)化

采用單因素實(shí)驗(yàn),分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、微波溫度、微波時(shí)間和料液比對(duì)重樓皂苷Ⅰ提取率的影響。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,固定微波功率為300 W,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、微波溫度(B)、微波時(shí)間(C)和料液比(D)為考察因素,以重樓皂苷Ⅰ提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步優(yōu)化重樓皂苷Ⅰ的微波提取工藝。

1.4 重樓皂苷Ⅰ提取率的測(cè)定

1.4.1 色譜條件

Agilent C18色譜柱;流動(dòng)相為乙腈-水(30∶70,體積比);檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm;體積流量1 mL·min-1;柱溫30 ℃。

1.4.2 重樓皂苷Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取重樓皂苷Ⅰ對(duì)照品2.0 mg,用甲醇溶解后定容于5 mL容量瓶中,搖勻,得濃度為0.40 mg·mL-1的重樓皂苷Ⅰ對(duì)照溶液。分別準(zhǔn)確吸取4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL重樓皂苷Ⅰ對(duì)照溶液,按1.4.1色譜條件進(jìn)樣分析,記錄峰面積,以重樓皂苷Ⅰ含量(x,μg)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),擬合得線性回歸方程:y=437.88x+39.4,R2=0.9965。表明重樓皂苷Ⅰ含量在 1.60～8.00 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 重樓皂苷Ⅰ的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of polyphyllin Ⅰ

1.4.3 重樓皂苷Ⅰ提取率的計(jì)算

移取適量重樓皂苷Ⅰ提取液,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾;準(zhǔn)確吸取10 μL,按1.4.1色譜條件進(jìn)樣分析,記錄峰面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算重樓皂苷Ⅰ含量,按下式計(jì)算重樓皂苷Ⅰ提取率(η):

式中:m為重樓皂苷Ⅰ的質(zhì)量,μg;V為重樓皂苷Ⅰ提取液體積,mL;m粉為重樓粗粉的質(zhì)量,g。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC圖譜

準(zhǔn)確吸取10 μL重樓皂苷Ⅰ對(duì)照溶液,按1.4.1色譜條件進(jìn)樣分析,HPLC圖譜如圖2所示。

圖2 重樓皂苷Ⅰ對(duì)照溶液的HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectrum of polyphyllin Ⅰ control solution

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

固定微波功率250 W、微波溫度60 ℃、微波時(shí)間30 min、料液比1∶20(g∶mL,下同),考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(45%、55%、65%、75%、95%)對(duì)重樓皂苷Ⅰ提取率的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)重樓皂苷Ⅰ提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of polyphyllin Ⅰ

由圖3可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,重樓皂苷Ⅰ提取率先升高后降低;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%時(shí),提取率達(dá)到最高?？赡苁且?yàn)?乙醇體積分?jǐn)?shù)較大時(shí),重樓粗粉中其它成分的溶出量增加,導(dǎo)致提取率降低。

因此,選擇45%、55%、65%作為正交實(shí)驗(yàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)的3個(gè)水平。

2.2.2 微波功率的選擇

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、微波溫度60 ℃、微波時(shí)間30 min、料液比1∶20,考察微波功率(150 W、200 W、250 W、300 W、350 W)對(duì)重樓皂苷Ⅰ提取率的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 微波功率對(duì)重樓皂苷Ⅰ提取率的影響Fig.4 Effect of microwave power on extraction rate of polyphyllin Ⅰ

由圖4可知,隨著微波功率的增大,重樓皂苷Ⅰ提取率先升高后降低;當(dāng)微波功率為300 W時(shí),提取率達(dá)到最高?？赡苁且?yàn)?增大微波功率加速了對(duì)細(xì)胞壁的破碎作用,提高了活性成分的溶出率,提取率相應(yīng)升高;但微波功率過(guò)大時(shí),會(huì)引起植物組織內(nèi)部的微小導(dǎo)管因凝固而閉塞[11],使活性成分的溶出受到抑制,導(dǎo)致提取率降低。當(dāng)微波功率從250 W增至300 W時(shí),提取率變化不明顯,但微波功率較大時(shí)更有利于活性成分的溶出。因此,選擇最佳微波功率為300 W。

2.2.3 微波溫度的選擇

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、微波功率300 W、微波時(shí)間30 min、料液比1∶20,考察微波溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)對(duì)重樓皂苷Ⅰ提取率的影響,結(jié)果如圖5所示。

圖5 微波溫度對(duì)重樓皂苷Ⅰ提取率的影響Fig.5 Effect of microwave temperature on extraction rate of polyphyllin Ⅰ

由圖5可知,隨著微波溫度的升高,重樓皂苷Ⅰ提取率先升高后降低;當(dāng)微波溫度為70 ℃時(shí),提取率達(dá)到最高。這是因?yàn)?升高溫度有利于提取溶劑對(duì)活性成分的溶解和擴(kuò)散;但溫度過(guò)高時(shí),不但會(huì)影響活性成分的穩(wěn)定性,而且會(huì)使重樓粗粉中其它成分的溶出量增加。因此,選擇60 ℃、70 ℃、80 ℃作為正交實(shí)驗(yàn)微波溫度的3個(gè)水平。

2.2.4 微波時(shí)間的選擇

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、微波功率300 W、微波溫度60 ℃、料液比1∶20,考察微波時(shí)間(15 min、20 min、25 min、30 min、35 min)對(duì)重樓皂苷Ⅰ提取率的影響,結(jié)果如圖6所示。

圖6 微波時(shí)間對(duì)重樓皂苷Ⅰ提取率的影響Fig.6 Effect of microwave time on extraction rate of polyphyllin Ⅰ

由圖6可知,隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng),重樓皂苷Ⅰ提取率先升高后略微降低;當(dāng)微波時(shí)間為30 min時(shí),提取率達(dá)到最高。這是因?yàn)?延長(zhǎng)微波時(shí)間有利于植物細(xì)胞的破碎,進(jìn)而有利于活性成分的溶出;但微波時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),其它成分的溶出量也增多。因此,選擇25 min、30 min、35 min作為正交實(shí)驗(yàn)微波時(shí)間的3個(gè)水平。

2.2.5 料液比的選擇

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、微波功率300 W、微波溫度60 ℃、微波時(shí)間30 min,考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)對(duì)重樓皂苷Ⅰ提取率的影響,結(jié)果如圖7所示。

圖7 料液比對(duì)重樓皂苷Ⅰ提取率的影響Fig.7 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polyphyllinⅠ

由圖7可知,隨著料液比的減小,即溶劑用量的增加,重樓皂苷Ⅰ提取率先升高后降低;當(dāng)料液比為1∶15 時(shí),提取率達(dá)到最高。這是因?yàn)?當(dāng)溶劑用量增加時(shí),活性成分?jǐn)U散到溶劑中的機(jī)會(huì)增多,提取率相應(yīng)升高。因此,選擇1∶10 、1∶15 、1∶20作為正交實(shí)驗(yàn)料液比的3個(gè)水平。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表1,方差分析見(jiàn)表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表2 方差分析

由表1、表2可知,各因素對(duì)重樓皂苷Ⅰ提取率影響的大小順序?yàn)?微波溫度(B)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)>料液比(D)>微波時(shí)間(C)。微波溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)重樓皂苷Ⅰ提取率的影響顯著,而料液比和微波時(shí)間的影響不顯著。最佳提取工藝組合為A1B3C3D2,即乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、微波溫度80 ℃、微波時(shí)間35 min、料液比1∶15。

2.4 工藝驗(yàn)證

在上述最佳工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),重樓皂苷Ⅰ提取率分別為5.46%、5.39%、5.58%,平均提取率為5.47%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.75%,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

通過(guò)HPLC法測(cè)定重樓皂苷Ⅰ含量,以重樓皂苷Ⅰ提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了重樓中活性成分重樓皂苷Ⅰ的微波提取工藝。確定最佳提取工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、微波功率300 W、微波溫度80 ℃、微波時(shí)間35 min、料液比1∶15(g∶mL),在此條件下,重樓皂苷Ⅰ提取率達(dá)到5.47%。該方法操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、高效,可用于重樓皂苷Ⅰ的提取。