許景成，徐知明，張玉娟

（深圳市通量檢測科技有限公司，廣東深圳 518102）

隨著人們物質(zhì)生活水平的日益提升和媒體對食品安全問題的頻頻曝光，消費(fèi)者對食品安全越來越關(guān)注，而飲用水安全作為食品安全的重要組成部分，應(yīng)引起相關(guān)部門的重視。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的一項(xiàng)調(diào)查，飲用水與全球80%的疾病有關(guān)，每年約有1.2 億人因飲用水污染和衛(wèi)生條件惡劣而患病。此外，飲用水污染會(huì)導(dǎo)致霍亂、腹瀉、甲型肝炎、傷寒和小兒麻痹癥等傳染性疾病的爆發(fā)。我國仍有2.8 億人使用受污染的飲用水[1]。水源水從凈化到使用的過程時(shí)間長，極易受到微生物的污染，易導(dǎo)致感染性腸道疾病。

1 飲用水的微生物污染研究現(xiàn)狀

致病性微生物污染問題是目前食品行業(yè)最大的食品安全問題。在我國，多數(shù)食品中毒由致病性微生物引起。近年來，各食品生產(chǎn)企業(yè)的調(diào)查研究顯示食品微生物污染的源頭首先指向飲用水[2]。國家市場監(jiān)督管理總局、國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)聯(lián)合頒布的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5749 —2022）基于我國近些年的飲用水監(jiān)測、檢測和調(diào)查數(shù)據(jù)，在國內(nèi)外關(guān)于污染物健康效應(yīng)最新研究成果的基礎(chǔ)上，采用了健康風(fēng)險(xiǎn)評估的技術(shù)方法，同時(shí)考慮了我國的實(shí)際情況和管理要求，修訂了飲用水的監(jiān)測指標(biāo)和限量值，水質(zhì)指標(biāo)數(shù)量從106 項(xiàng)調(diào)整到97 項(xiàng)，其中常規(guī)指標(biāo)43 項(xiàng)、擴(kuò)展指標(biāo)54 項(xiàng)，微生物指標(biāo)增至6 項(xiàng)，增加了大腸埃希氏菌、耐熱大腸菌群、賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲指標(biāo)，要求不得檢出總大腸菌群和大腸埃希氏菌，菌落總數(shù)不得超過100 CFU·mL-1[3]。

飲用水的質(zhì)量安全問題一直是國內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)。當(dāng)前飲用水的質(zhì)量主要與化學(xué)風(fēng)險(xiǎn)和微生物風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，化學(xué)風(fēng)險(xiǎn)主要包括一些重金屬（如砷、鉻、氟、鉛）、硝酸根離子、總可溶性固形物和一些有機(jī)污染物。世界衛(wèi)生組織制定的《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》中指出，與化學(xué)風(fēng)險(xiǎn)相比，微生物風(fēng)險(xiǎn)是飲用水安全的主要問題，應(yīng)該作為關(guān)注重點(diǎn)[4]。然而國內(nèi)對飲用水的檢測多聚焦于礦物質(zhì)元素含量、農(nóng)藥殘留、消毒副產(chǎn)物殘留和有機(jī)物含量等的檢測，對于飲用水中微生物的檢測技術(shù)與方法的研究略有缺乏。

2 致病微生物的危害

飲用水污染常見的致病微生物有銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、嗜肺軍團(tuán)菌和分枝桿菌等。其中銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌以及霍亂弧菌為飲用水常測指標(biāo)。

2.1 銅綠假單胞菌的危害

銅綠假單胞菌可通過水源、土壤、器皿和接觸等方式傳播，是水質(zhì)污染的指示菌，對化學(xué)試劑的抵抗力比普通革蘭氏陰性菌強(qiáng)，具有多重耐藥特征，感染率較高。銅綠假單胞菌含有多種毒力因子，主要包括多種外毒素（綠膿素、黏附素和肉毒素等）和內(nèi)毒素等致病因子，該菌可以感染多種身體組織或器官，如皮膚和軟組織、血液系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)。銅綠假單胞菌是一種食源性致病細(xì)菌，可引起急性腸道疾病和皮膚炎癥[5]。

2.2 腸道病原體的危害

在水源中傳播的病原體中，腸道病原體（如大腸桿菌、沙門氏菌和霍亂弧菌）是最常見的病原體，人類常通過攝入受污染的水和食物而感染。據(jù)報(bào)道，致病性大腸桿菌在地下水源中的流行比在地表水源中更加廣泛；霍亂弧菌在地表和地下水源中均存在，這些腸道細(xì)菌是各種疾病及其并發(fā)癥的病原體。

大腸桿菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素、黏附素以及腸毒素等均可能導(dǎo)致腹瀉，感染嚴(yán)重者可能伴有溶血尿毒綜合征，有致命的危險(xiǎn)，其危害較大，可用于監(jiān)測飲用水源和再生加工用水水質(zhì)。沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，是全球細(xì)菌性胃腸炎的主要病因之一。沙門氏菌的致病性是大量毒力相關(guān)因子相互作用的結(jié)果，主要有毒力島毒力因子、質(zhì)粒毒力因子、結(jié)構(gòu)性毒力因子（包括菌毛和鞭毛）、腸毒素毒力因子等[6]。霍亂弧菌是革蘭氏陰性菌，其對營養(yǎng)的要求不高，但對環(huán)境因素比較敏感，如對熱、干燥、日光和常用消毒劑等較為敏感[7]。產(chǎn)毒素霍亂弧菌現(xiàn)被認(rèn)為是許多水體環(huán)境中低等植物區(qū)系原來存在的成員，可長期存活并繁殖而不失去毒力決定簇。研究表明，在霍亂流行期間，水生環(huán)境可能是霍亂弧菌的來源，霍亂弧菌可產(chǎn)生腸毒素，人們攝入含有霍亂弧菌的飲用水后，可引起霍亂的暴發(fā)[8]。

3 飲用水中一般微生物的常見檢測

細(xì)菌數(shù)量的增加是生物安全風(fēng)險(xiǎn)上升的明顯標(biāo)志，可以用特定細(xì)菌、細(xì)菌群或總細(xì)菌群落的變化來衡量。特異性檢測傳統(tǒng)上是在選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。傳統(tǒng)培養(yǎng)法是基于對純培養(yǎng)物的分離，并通過對分離物的形態(tài)、代謝和生化特征進(jìn)行鑒定，或通過顯微鏡檢查等更簡單的染色反應(yīng)來鑒定具有某種特性的細(xì)菌。傳統(tǒng)方法有濾膜法、多管發(fā)酵法、酶底物法、免疫磁分離熒光抗體法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光技術(shù)與流式細(xì)胞術(shù)、高通量測序等方法也逐漸被應(yīng)用到微生物的檢測中。

3.1 傳統(tǒng)檢測技術(shù)

3.1.1 濾膜法和多管發(fā)酵法

濾膜法適用于雜質(zhì)含量較少的飲用水檢驗(yàn)，操作簡單，但檢驗(yàn)準(zhǔn)確率相對較低。多管發(fā)酵法適用于不同類型飲用水樣本的檢驗(yàn)，該方法主要采用最大可能數(shù)法對微生物檢驗(yàn)情況進(jìn)行表示，有利于監(jiān)測總大腸菌群密度情況，以及對水質(zhì)安全性進(jìn)行評定。多管發(fā)酵法對飲用水中某些微生物（如大腸桿菌、雜菌與耐熱大腸菌群）的檢出率比濾膜法更高，但多管發(fā)酵法的操作步驟復(fù)雜、檢測時(shí)間長[9]。

3.1.2 酶底物法

酶底物法常用于檢測大腸埃希氏菌，在選擇性培養(yǎng)基中以β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)細(xì)菌釋放色原體，使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，再用分光光度計(jì)測得的OD值變化檢測水中的總大腸菌落。

3.1.3 免疫磁分離熒光抗體法

免疫磁分離熒光抗體法適用于飲用水中賈第鞭毛蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊（簡稱“兩蟲”）的測定。由于“兩蟲”的體積小，耐氯性強(qiáng)，且在水環(huán)境中孢囊和卵囊的存活期和潛伏期均較長，常規(guī)方法無法將其滅活，導(dǎo)致其存在水平較高。因此，常采用Filta-Max 法過濾、淘洗、濃縮、免疫磁珠分離、免疫熒光分析和微分干涉鏡檢等技術(shù)進(jìn)行分析和檢測，具有過濾速度快，回收率高且穩(wěn)定的特點(diǎn)，但成本費(fèi)用較高，操作步驟煩瑣，加上“兩蟲”的傳染性高，需要研究人員熟練操作。

3.2 新發(fā)展技術(shù)

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法可檢測出的微生物數(shù)量僅占總數(shù)的0.1%，大部分微生物無法依靠培養(yǎng)的方式獲得。傳統(tǒng)培養(yǎng)法具有操作煩瑣、耗時(shí)長等弊端。因此，為更加深入地了解飲用水中的微生物群落結(jié)構(gòu)并探究不同群落間的相互作用，必須依靠更加先進(jìn)的分子生物學(xué)工具。在培養(yǎng)、血清學(xué)和分子方法等診斷技術(shù)中，分子方法診斷速度最快，且具有高靈敏度、特異性和安全性。

3.2.1 熒光技術(shù)與流式細(xì)胞術(shù)

基于熒光染色的流式細(xì)胞術(shù)是流式細(xì)胞術(shù)根據(jù)熒光測量快速表征和定量不同的菌群，通過檢測特定波長范圍的通道測量熒光強(qiáng)度，可快速針對懸浮于液相環(huán)境中的單個(gè)細(xì)菌或微球進(jìn)行多參數(shù)定性和定量分析，以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的絕對計(jì)數(shù)與不可培養(yǎng)計(jì)數(shù)。該技術(shù)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)研究中，如對微生物污染的水進(jìn)行細(xì)菌的快速計(jì)數(shù)、聯(lián)合使用熒光染色的特異性配體鑒別目標(biāo)細(xì)菌、通過制備配體功能化微球建立多重檢測方法等。

3.2.2 高通量測序

高通量測序技術(shù)可分析復(fù)雜細(xì)菌群落。應(yīng)用該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)一次并行并對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進(jìn)行序列測定，從而對樣品進(jìn)行分類學(xué)鑒定，并提供有關(guān)微生物群落結(jié)構(gòu)的詳細(xì)定性和定量信息。該方法也可用于研究飲用水中的細(xì)菌多樣性和豐度，以觀察微生物群落變化、檢測致病菌、觀察生物膜的形成與變化等。該法靈敏度較高，是對傳統(tǒng)測序技術(shù)的一次革命性變革[10]。

3.2.3 PCR 技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是檢測各種樣品中多種微生物的最廣泛使用的分子方法之一。水是傳播沙門氏菌、霍亂弧菌和大腸桿菌等致病菌的來源之一，PCR 技術(shù)因其快速、特異、靈敏、需樣品量少等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于檢測和鑒別水中的沙門氏菌、霍亂弧菌和大腸桿菌等。

4 飲用水中VBNC 狀態(tài)細(xì)菌的檢測

飲用水中的細(xì)菌可在消毒等因素誘導(dǎo)下進(jìn)入活的不可培養(yǎng)（Viable But Non-Culture，VBNC）狀態(tài)。VBNC 狀態(tài)的細(xì)菌可在適當(dāng)?shù)臈l件下復(fù)蘇，對飲用水安全造成危害。例如，當(dāng)外界環(huán)境不利于生長時(shí)，霍亂弧菌會(huì)進(jìn)入VBNC 狀態(tài)，此時(shí)霍亂弧菌無法在培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)胞分裂而生長，但其代謝活動(dòng)仍在繼續(xù)，并且仍可以致病[11]。

普通的直接活菌計(jì)數(shù)法無法檢測到VBNC 狀態(tài)的細(xì)菌，導(dǎo)致測得細(xì)菌總數(shù)偏低。使用抗生素作用于VBNC 細(xì)菌，由于其具有的抗生素耐受性，使其伸長，可在顯微鏡下篩選讀數(shù)，但此方法存在特異性、靈敏度較低等缺點(diǎn)。目前，常用單疊氮丙啶-熒光定量PCR、反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR 與應(yīng)用最大或然數(shù)聯(lián)用、流式細(xì)胞儀技術(shù)和適宜的細(xì)胞活性染料、5-氰基-2,3-二聚氯四唑聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)和D2O 標(biāo)記拉曼光譜聯(lián)用等技術(shù)測定不同活性狀態(tài)下的細(xì)菌數(shù)量和濃度[12-13]。

5 結(jié)語

我國飲用水微生物污染問題仍然存在，亟待解決。相關(guān)部門應(yīng)重視并加強(qiáng)監(jiān)督監(jiān)測，結(jié)合我國的水源水質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)、水質(zhì)凈化和水質(zhì)檢驗(yàn)技術(shù)水平、污染物健康效應(yīng)等制定飲用水水源標(biāo)準(zhǔn)，強(qiáng)化源頭管控要求，提高飲用水衛(wèi)生保障水平，保障食品安全。