劉湘丹，陳勛，龍雨青，王志輝，劉笑蓉，王朝暉，童巧珍，周日寶

〔摘要〕 目的 分別克隆灰氈毛忍冬與忍冬HQT2基因全長序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)量分析，以揭示HQT2在灰氈毛忍冬與忍冬綠原酸生物合成中的可能功能。方法 多糖多酚試劑盒法分別提取灰氈毛忍冬與忍冬花總RNA，通過RT-PCR和RACE技術(shù)克隆HQT2基因的全長cDNA序列，運(yùn)用相關(guān)軟件對(duì)該基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）分別測定灰氈毛忍冬與忍冬莖、葉及不同花期花中相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量；采用HPLC 測定綠原酸含量并結(jié)合表達(dá)量做相關(guān)性分析。結(jié)果 克隆得到LmHQT2（MH196564）和LjHQT2（MK294639），其開放閱讀框長度均為1 296 bp，編碼431個(gè)氨基酸，生物信息學(xué)分析預(yù)測為親水性蛋白，可能定位于細(xì)胞質(zhì)中，屬于氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶樣結(jié)構(gòu)域超家族；qRT-PCR結(jié)果顯示，HQT2基因具有組織特異性，在灰氈毛忍冬與忍冬莖、葉及不同花期花器官中表達(dá)存在差異；綠原酸含量與基因相對(duì)表達(dá)量之間呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。結(jié)論 本研究成功克隆了灰氈毛忍冬與忍冬HQT2基因并探索其在不同器官中的表達(dá)模式，推測HQT2基因在灰氈毛忍冬與忍冬的綠原酸生物合成途徑中發(fā)揮不同功能，為進(jìn)一步研究該基因的功能及探究灰氈毛忍冬和忍冬綠原酸生物合成調(diào)節(jié)機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 灰氈毛忍冬；忍冬；HQT2；基因克??；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

〔中圖分類號(hào)〕R282.2? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.07.010

Cloning and expressions of HQT2 genes in Lonicera macranthoides

Hand.-Mazz. and Lonicera japonica Thunb.

LIU Xiangdan1，2，3， CHEN Xun4， LONG Yuqing1， WANG Zhihui1，2， LIU Xiaorong1，2，

WANG Zhaohui1，2， TONG Qiaozhen1，2，3， ZHOU Ribao1，2，3*

1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory for the Germplasm Resources and Standardized Planting of Hunan's Bulk Authentic Medicinal Materials， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Provincial Key Laboratory of Chinese Medicinal Modernization， Changsha， Hunan 410208， China;

4. Nanhua Hospital of University of South China， Hengyang， Hunan 421002， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To reveal the possible functions of HQT2 gene in the chlorogenic acid biosynthesis of Lonicera macranthoides Hand.-Mazz. （L. macranthoides） and Lonicera japonica Thunb. （L. japonica） by cloning the full-length sequences of HQT2 genes from L. macranthoides and L. japonica respectively for bioinformatics and expression analysis. Methods The total RNAs of L. macranthoides and L. japonica were extracted respectively using Biospin Polysaccharide Polyphenol Plant Total RNA Extraction Kit. The full-length cDNA sequences of HQT2 genes were cloned by RT-PCR and RACE， and bioinformatics analysis was performed on them with relevant softwares. Real-time fluorescence quantitative PRC（qRT-PCR） was used to determine the relative expression levels of the genes in the stems and leaves， as well as the flowers at different flowering stages of L. macranthoides and L. japonica respectively. The content of chlorogenic acid was determined by HPLC and the correlation between it and the relative expression level of HQT2 gene was analyzed. Results The full-length cDNA sequences of LmHQT2 gene （MH196564） and LjHQT2 gene （MK294639） were cloned successfully， each of which contained a 1296 bp open reading frame （ORF） and encoded 431 amino acids. Bioinformatics predictive analysis indicated that the proteins encoded by the two genes were hydrophili， possibly located in the cytoplasm， belonging to the chloramphenicol acetyltransferase-like domain superfamily. qRT-PCR showed that HQT2 gene was tissue-specific， and its expression levels were different in the stems and leaves， as well as the floral organs at different flowering stages of L. macranthoides and L. japonica. There was a certain correlation between chlorogenic acid content and the relative expression level of this gene. Conclusion This study cloned HQT2 genes of L. macranthoides and L. japonica successfully and analyzed their expressions in the different plant organs. It is speculated that HQT2 gene plays different functions in the chlorogenic acid biosynthesis pathways of L. macranthoides and L. japonica， which provided a research basis for further study of the function of this gene and the regulation mechanism of chlorogenic acid biosynthesis in L. macranthoides and L. japonica.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.; Lonicera japonica Thunb.; HQT2; gene cloning; bioinformatics analysis; expression analysis

灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.和忍冬Lonicera japonica Thunb.均來源于為忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬屬（Lonicera Linn.）植物，其干燥花蕾或帶初開的花分別作為山銀花和金銀花入藥，在2005版《中華人民共和國藥典》開始分列，均具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱功效[1]。綠原酸是灰氈毛忍冬和忍冬共有活性成分之一，現(xiàn)代研究表明其具抗氧化、抗高血壓、抗菌、抗腫瘤、抗輻射、降血糖、降血脂、抗炎、補(bǔ)腎、保肝等多種藥理作用[2]，其為金銀花、山銀花清熱解毒的潛在功效標(biāo)志物[3]。醫(yī)藥、化工和食品等領(lǐng)域?qū)G原酸均有廣泛需求[4]，其應(yīng)用前景廣泛。研究發(fā)現(xiàn)灰氈毛忍冬花蕾中的綠原酸含量較忍冬花蕾明顯高[5]，進(jìn)行兩者綠原酸生源合成途徑關(guān)鍵基因比較研究，探究兩者綠原酸含量差異分子機(jī)制具有重要意義。

綠原酸是由咖啡酸的1位羧基和奎尼酸的3 位羥基縮合成酯的天然產(chǎn)物[4]，是重要的植物苯丙素類次生代謝產(chǎn)物之一，最初由L-苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase）生成反式肉桂酸，然后在肉桂酸-4羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase）和4-香豆酸連接酶（4-coumarate CoA ligase）作用下生成對(duì)-香豆酰輔酶A，最后在羥基肉桂酰輔酶A奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase）作用下生成綠原酸[6]。目前，有研究者對(duì)煙草[7-8]、番茄[7]、咖啡[9]、朝鮮薊[10-11]、忍冬[12]、灰氈毛忍冬[13]、白花虎眼萬年青[14]、番薯[15]等植物進(jìn)行HQT基因克隆、生物信息學(xué)以及表達(dá)模式分析的相關(guān)研究，從而證明HQT與綠原酸合成有直接關(guān)系[16]。

課題組前期構(gòu)建了灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組，通過分析挖掘到注釋為HQT的片段（Unigene9130），與NCBI中已收錄的忍冬與灰氈毛忍冬的HQT序列不同。因此，本研究以灰氈毛忍冬與忍冬花為材料，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中Unigene9130序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆兩者中HQT基因的全長cDNA序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，運(yùn)用qRT-PCR和HPLC技術(shù)進(jìn)行表達(dá)模式與綠原酸含量的相關(guān)性分析，為進(jìn)一步通過分子水平探究兩者綠原酸含量差異提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為完善綠原酸生物合成途徑和調(diào)節(jié)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1? 藥材來源

采收種于湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥植園的灰氈毛忍冬與忍冬的當(dāng)年生新鮮莖、葉及不同花期花樣品（見圖1），用裝有液氮的泡沫盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授鑒定為灰氈毛忍冬與忍冬的莖、葉、花，保存于－80 ℃超低溫冰箱。

1.2? 試劑

多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Biospin， BSC65S1，杭州博日科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit， K1622， Thermo）；快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、CW2302、2×Taq MasterMix（Dye）、CW0682、2×Pfu MasterMix（Dye）、CW0682（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；pEASY■-T1Cloning Vector，CT101、pEASY■-Blunt Cloning Vector，CB101、TranStart■ Green qPCR SuperMix UDG，AQ111（北京全式金生物科技有限公司）；RACE試劑盒（SMARTer■ RACE5'/3'Kit，634858，Clontech）。引物序列見表1，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物濃度均為10 μmol/L。

2 方法

2.1? HQT2基因的克隆

2.1.1? 總RNA提取和cDNA合成? 取適量灰氈毛忍冬與忍冬白蕾期花，按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA[17]，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，核酸蛋白分析儀檢測RNA的純度。將質(zhì)量較好的RNA，參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈。

2.1.2? HQT2基因核心片段擴(kuò)增? 根據(jù)本課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，選取注釋為HQT的序列（Unigene9130），應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物HQT2-F和HQT2-R（見表1），以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：ddH2O 9.5 μL，2×Taq MasterMix（Dye）12.5 μL，cDNA 1 μL，HQT2-F和HQT2-R各1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，切下目的條帶，快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，以pEASY■-T1 Cloning Vector為載體，與目的基因連接，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，通過含有20 mg/L的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷）、500 mmol/L的IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、100 mg/L的Amp（氨芐西林）的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑進(jìn)行菌落PCR，將陽性克隆接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，委托鉑尚生物技術(shù)有限公司對(duì)菌液進(jìn)行測序。

2.1.3? ?HQT2基因3'和5'端RACE擴(kuò)增? 根據(jù)“2.1.2”項(xiàng)核心片段測序結(jié)果，設(shè)計(jì)RACE特異性引物（見表1），按Clontech公司SMARTer■ RACE5'/3'Kit試劑盒說明書，獲得5'和3'-RACE-Ready cDNA，用Tricine-EDTA Buffer稀釋。

灰氈毛忍冬HQT2 PCR反應(yīng)體系50 μL：PCR-Grade H2O 15.5 μL，2×SeqAmp Buffer 25 μL，SeqAmp DNA Polymerase 1.0 μL，5'或3'-RACE-Ready cDNA 2.5 μL，10×UPM 5 μL，5'或3'引物1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，3'端25個(gè)循環(huán)，5'端30個(gè)循環(huán)。

忍冬HQT2第1次PCR反應(yīng)體系50 μL：PCR-Grade H2O 15.5 μL，2×SeqAmp Buffer 25 μL，SeqAmp DNA Polymerase 1.0 μL，5'或3'-RACE-Ready cDNA 2.5 μL，10×UPM 5 μl，5'或3'外引物1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)。第2次巢式PCR，取第1次PCR產(chǎn)物1 μL，加入24 μL Tricine-EDTA Buffer稀釋后作為模板，反應(yīng)體系50 μL：PCR-Grade H2O 17 μL，2×SeqAmp Buffer 25 μL，SeqAmp DNA Polymerase 1 μL，第1次PCR產(chǎn)物稀釋液5 μL，UPS 1 μL，5'或3'內(nèi)引物1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)。

擴(kuò)增目的條帶回收和測序等過程同“2.1.2”項(xiàng)，其中載體使用pEASY■-Blunt Cloning Vector。

2.1.4? HQT2基因cDNA全長序列驗(yàn)證? 利用ContingExpress對(duì)3'端和5'端進(jìn)行序列拼接，得到HQT2基因的cDNA全長，根據(jù)拼接全長設(shè)計(jì)cDNA全長驗(yàn)證引物V-HQT2-F和V-HQT2-R（見表1），以“2.1.1”項(xiàng)下cDNA為模板進(jìn)行全長驗(yàn)證。反應(yīng)體系25 μL：ddH2O 9.5 μL，2×Pfu MasterMix（Dye）12.5 μL，cDNA 1 μL，V-HQT2-F和V-HQT2-R各1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，循環(huán)35次；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增目的條帶回收和測序等過程同“2.1.2”項(xiàng)，其中載體使用pEASY■-Blunt Cloning Vector。

2.2? 生物信息學(xué)分析

采用NCBI在線軟件“ORF finder”查找HQT2的開放閱讀框（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/），通過在線軟件ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，分析目的基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)及穩(wěn)定性等參數(shù)；采用ProtScale軟件（http：//web.expasy.org/protscale/）測定蛋白質(zhì)親水性/疏水性；WOLFPSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）在線預(yù)測蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位情況；TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析；SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測信號(hào)肽；InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）軟件分別預(yù)測蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；通過NCBI的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST，篩選出同源性較高的物種，利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)，MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.3? HQT2基因的組織表達(dá)水平分析

根據(jù)HQT2基因全長序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR的特異性引物Q-HQT2-R和Q-HQT2-F（見表1），以18S rRNA做為內(nèi)參基因[18-19]。按照“2.1.1”項(xiàng)方法提取灰氈毛忍冬與忍冬莖、葉和5個(gè)不同花期花的總RNA，將RNA定量后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。反應(yīng)體系20 μL：TranStart■ Green qPCR SuperMix UDG 10 μL，cDNA 1 μL，Q-HQT2-R和Q-HQT2-F各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)條件：50 ℃2 min，94 ℃ 10 min；94 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)，做熔解曲線分析，每個(gè)樣品重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)在Bio-Rad CFX96上進(jìn)行，采用2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.4? 灰氈毛忍冬和忍冬莖、葉及不同花期花綠原酸含量測定

利用Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相儀，采用Supersil ODS-B色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），參照2020年版《中華人民共和國藥典》山銀花項(xiàng)下綠原酸含量測定方法[1]，對(duì)灰氈毛忍冬和忍冬莖、葉及不同花期花樣品進(jìn)行HPLC分析。

3 結(jié)果

3.1? HQT2基因全長獲得

3.1.1? 總RNA的提取? 灰氈毛忍冬和忍冬花的總RNA瓊脂糖凝膠電泳見圖2，可見28S和18S條帶明顯，其中28S處的亮度是18S的兩倍，說明RNA完整性較好，A260/280值為1.8～2.0，A260/230值>2.0，RNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

3.1.2? HQT2核心片段擴(kuò)增? 通過轉(zhuǎn)錄組Unigene序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR均擴(kuò)增得到目標(biāo)條帶，大約為790 bp，見圖3；經(jīng)過回收、純化、克隆、測序后，獲得灰氈毛忍冬和忍冬該片段序列均為792 bp，通過DNAMAN比對(duì)，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致。

3.1.3? HQT2基因全長cDNA的獲得? 根據(jù)核心片段序列設(shè)計(jì)RACE特異性引物，分別進(jìn)行5'端和3'端擴(kuò)增?；覛置潭?'端在953 bp左右出現(xiàn)一條亮帶，5'端在836 bp左右出現(xiàn)一條亮帶。忍冬3'端在953 bp左右出現(xiàn)一條亮帶，5'端在1 068 bp左右出現(xiàn)一條亮帶。將亮帶切下回收，轉(zhuǎn)化至載體上，挑選陽性克隆測序，將3'端、5'端和核心片段序列進(jìn)行拼接，兩者HQT2基因cDNA全長序列均為1 651 bp。設(shè)計(jì)全長驗(yàn)證引物，以“2.1.1”項(xiàng)下的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1 600 bp左右有明顯單一亮帶，將亮帶回收、純化、克隆、測序，測序結(jié)果與拼接全長序列一致，說明成功克隆出HQT2基因的cDNA全長?；覛置潭琀QT2相關(guān)結(jié)果見圖4，忍冬HQT2相關(guān)結(jié)果見圖5。

3.2? HQT2基因生物信息學(xué)分析

3.2.1? HQT2蛋白理化特性? 灰氈毛忍冬與忍冬HQT2基因全長均為1651 bp，3'端非編碼區(qū)236 bp，帶有30 bp的ployA尾，5'端非編碼區(qū)119 bp，中間具有完整的開放閱讀框1 296 bp，該序列編碼氨基酸431個(gè)，將其上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫分別命名為LmHQT2和LjHQT2，GenBank登錄號(hào)分別為MH196564和MK294639。兩者編碼氨基酸比對(duì)見圖6。

利用ExPASyProtParam在線軟件對(duì)灰氈毛忍冬與忍冬HQT2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果見表2，兩者的蛋白理化性質(zhì)差異不大，不穩(wěn)定系數(shù)均＜40，預(yù)測兩者為穩(wěn)定蛋白；兩者的平均疏水系數(shù)＜0，且通過ProtScale進(jìn)行蛋白質(zhì)親水性/疏水性分析（圖7），預(yù)測其為親水性蛋白質(zhì)。WOLF PSORT 預(yù)測HQT2蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)中。運(yùn)用在線軟件TMHMM分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的氨基酸1-431全部在膜外，不具有跨膜區(qū)域。SignalP 4.1 Server進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)HQT2不具有信號(hào)肽序列，推測其不是分泌蛋白。

3.2.2? HQT2蛋白結(jié)構(gòu)域和二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)? 應(yīng)用InterPro對(duì)LmHQT2和LjHQT2蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果見圖8。其同源超家族為氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶樣結(jié)構(gòu)域超家族（chloramphenicol acetyltransferase-like domain superfamily，注釋為3.30.559.10，位點(diǎn)1-205 aa和209-431 aa），家族屬于轉(zhuǎn)移酶（transferase，注釋PF02458，位點(diǎn)1-428 aa）。

利用SOPMA軟件對(duì)HQT2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果見表3和圖9；兩者的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件相差不大，其中α-螺旋和隨機(jī)卷曲為該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件。運(yùn)用SWISS-MODEL建模工具在線預(yù)測HQT2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖10所示，用于建立三級(jí)結(jié)構(gòu)模型的氨基酸殘基為1-429位，以[5kjt.1.A] 蛋白為模板，相似度達(dá)60%，描述為shikimate O-hydroxycinnamoyltransferase。

3.2.3? HQT2氨基酸序列同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析? 應(yīng)用NCBI中的BlastP在線軟件，對(duì)LmHQT2氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索，用DNAMAN進(jìn)行比對(duì)，其與LjHQT2同源性最高，達(dá)98.14%，與桔梗Platycodon grandiflorus（AEM63676.1）、煙草Nicotiana tabacum（NP_001312079.1）、番茄Solanum lycopersicum（NP_001234850.2）、野胡蘿卜Daucus carota subsp. carota（ANO53925.1）、番薯Ipomoea bat？鄄atas（BAJ14794.1）同源性分別為：74.04%、68.71%、67.81%、63.43%、61.72%。運(yùn)用DNAMAN對(duì)LmHQT2及LjHQT2和上述植物HQT2蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果如圖11。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)以上煙草、番茄和番薯的HQT基因被證實(shí)在綠原酸的合成中發(fā)揮重要作用[7-8，15]，因以上物種HQT基因都具有PLN02663羥基肉桂酰輔酶A結(jié)構(gòu)域，故具有相似的功能。從圖11編碼蛋白結(jié)構(gòu)比對(duì)來看，N端差異較大，這可能與N端多為物種特異性信號(hào)肽有關(guān)。

為研究HQT2氨基酸序列與其他植物的進(jìn)化關(guān)系，在NCBI的BlastP選取與其氨基酸相似的11條氨基酸序列，運(yùn)用MEGA7構(gòu)建NJ進(jìn)化樹，結(jié)果見圖12。系統(tǒng)進(jìn)化樹主要分為3個(gè)大的分支，灰氈毛忍冬（MH196564）與忍冬（MK294639）、毛白楊（AFZ78609.1）、番薯（BAJ14794.1）、中?？Х龋ˋBO77957.1）、野胡蘿卜（ANO53925.1）、矮牽牛（AVA30527.1）聚為一個(gè)大類，與同科同屬的忍冬親緣關(guān)系最近。

3.3? HQT2基因組織特異性表達(dá)

灰氈毛忍冬和忍冬莖、葉、花樣品表達(dá)量結(jié)果見圖13?；覛置潭煌ㄆ诨悠分星嗬倨谙鄬?duì)表達(dá)量最高，幼蕾期次之，與其他花期存在顯著差異（P＜0.01），白蕾期最低。不同器官中，以白蕾期花為參照，相對(duì)表達(dá)量為葉＞莖＞白蕾期，其中在葉的相對(duì)表達(dá)量最高，是莖的1.96倍，是白蕾期的4.97倍。

忍冬不同花期花樣品中幼蕾期相對(duì)表達(dá)量最高，白蕾期次之，與其他花期表達(dá)量存在顯著差異（P＜0.01），銀花期最低。不同器官中，以白蕾期花為參照，相對(duì)表達(dá)量為白蕾期＞葉＞莖，其在白蕾期的相對(duì)表達(dá)量最高，是葉的2.59倍，是莖的6.68倍。

由圖13可見，HQT2基因在忍冬與灰氈毛忍冬的不同花期和不同器官中，具有不同的相對(duì)表達(dá)量與變化規(guī)律。不同花期中，灰氈毛忍冬的幼蕾期與青蕾期相對(duì)表達(dá)量較高，而忍冬為幼蕾期與白蕾期較高，兩者的銀花期與金花期相對(duì)量差異較?。徊煌鞴僦?，兩者的花莖葉相對(duì)表達(dá)均有差異，但莖與葉走勢一致。

3.4? 灰氈毛忍冬、忍冬莖、葉及不同花期花的綠原酸含量

灰氈毛忍冬和忍冬莖、葉及不同花期花樣品綠原酸含量結(jié)果見圖14?；覛置潭芯G原酸含量各個(gè)花期、莖和葉均高于忍冬?；覛置潭腿潭o中綠原酸含量均為最低，銀花期是灰氈毛忍冬綠原酸含量最高期，而青蕾期是忍冬綠原酸含量最高期。綠原酸含量的總體趨勢為灰氈毛忍冬中先降后升再降，忍冬中則表現(xiàn)為先升后降。

4 討論

綠原酸為忍冬與灰氈毛忍冬共有活性成分之一。HQT為綠原酸生物合成途徑中最后一步的關(guān)鍵酶，能催化咖啡酰輔酶A和奎尼酸進(jìn)行酯交換生成綠原酸[18]。

本研究成功克隆灰氈毛忍冬與忍冬HQT2基因，并分別命名為LmHQT2和LjHQT2；兩者基因全長均為1 651 bp，有22個(gè)堿基位點(diǎn)存在差異，具有完整的開放閱讀框1296 bp，氨基酸431個(gè)，有8個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在差異；預(yù)測其為親水性蛋白，不是分泌蛋白，可能定位于細(xì)胞質(zhì)中。該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域從第1位到第431位氨基酸結(jié)束，預(yù)測屬于轉(zhuǎn)移酶超家族。兩者的二級(jí)結(jié)構(gòu)中元件相差不大，α螺旋和隨機(jī)卷曲為該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件，三級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致。同源性對(duì)比，兩者氨基酸相似度達(dá)98.14%，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析兩者的親緣關(guān)系最近。

文獻(xiàn)研究表明，灰氈毛忍冬花較忍冬花中綠原酸含量高[19-20]，兩品種不同花期花中綠原酸含量存在差異。為探究兩品種不同花期花的綠原酸含量與HQT2表達(dá)量相關(guān)性，本研究運(yùn)用qRT-PCR對(duì)不同花期花進(jìn)行表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)HQT2在兩者的不同花期花中表達(dá)量均存在差異，在灰氈毛忍冬中呈現(xiàn)先低再高后再低的趨勢，忍冬中先高后低再高再低的趨勢。同時(shí)文獻(xiàn)研究表明灰氈毛忍冬與忍冬的不同器官綠原酸含量也存在差異[21-22]，本研究對(duì)比了HQT2在不同器官中相對(duì)表達(dá)量，灰氈毛忍冬為葉＞莖＞白蕾期花，忍冬為白蕾期花＞葉＞莖，說明該基因在不同物種不同部位基因的表達(dá)量具有組織特異性。

結(jié)合分析灰氈毛忍冬和忍冬不同花期花及莖、葉綠原酸含量結(jié)果可知，灰氈毛忍冬和忍冬綠原酸含量和基因表達(dá)模式有一定的相關(guān)性。忍冬前三個(gè)花期中HQT2的相對(duì)表達(dá)量與綠原酸含量呈相反趨勢，而在后兩個(gè)花期和莖、葉呈相似趨勢，而灰氈毛忍冬中并不存在顯著相關(guān)性，僅在莖和葉中有相同趨勢，這表明HQT2在忍冬和灰氈毛忍冬中參與綠原酸的合成中發(fā)揮的功能可能不一致。

NIGGEWEG等[7]在煙草中分離了HQT的cDNA，在番茄中HQT超表達(dá)可導(dǎo)致葉片中綠原酸含量增加85%，而HQT沉默則導(dǎo)致葉片中綠原酸含量降低98%。CL？魪等[23]研究也發(fā)現(xiàn)，HQT基因過表達(dá)的番茄葉綠原酸含量提高，是野生型的2.5倍，基因沉默的番茄葉綠原酸含量降低。SONNANTE等[11]發(fā)現(xiàn)朝鮮薊中HQT1、HQT2與綠原酸的合成顯著相關(guān)。PENG[12]與張靜茹[24]等從忍冬中克隆HQT1基因，將HQT1基因轉(zhuǎn)入Rosetta（DE3）大腸埃希菌與忍冬愈傷組織中，過表達(dá)后綠原酸的含量明顯提高。CHEN等[25]克隆了灰氈毛忍冬HQT1基因的CDS序列，構(gòu)建超表達(dá)體系，轉(zhuǎn)基因植株葉中的綠原酸含量提高了大約60%。上述研究表明，HQT在不同物種綠原酸生物合成中均起了關(guān)鍵的作用。筆者比較了LmHQT1[25]與本研究克隆的LmHQT2氨基酸序列，兩者相似度達(dá)79%，蛋白理化特性與結(jié)構(gòu)相似度高；同時(shí)利用BlastP進(jìn)行其他植物HQT與LmHQT2/LjHQT2比對(duì)，其相似度較高，可預(yù)測本研究克隆得到的HQT2基因可能為灰氈毛忍冬/忍冬HQT中的一員。后期項(xiàng)目組將構(gòu)建HQT2基因的灰氈毛忍冬與忍冬過表達(dá)載體，進(jìn)行HQT2基因功能驗(yàn)證，為灰氈毛忍冬和忍冬次生代謝產(chǎn)物綠原酸積累的分子調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

本研究為灰氈毛忍冬和忍冬HQT2基因的功能預(yù)測奠定了基礎(chǔ)，豐富了NCBI中HQT基因序列，同時(shí)對(duì)完善灰氈毛忍冬和忍冬綠原酸生物合成和調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典： 一部[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020： 32， 230.

[2] 張浩超， 郝寶燕， 孫皓熠， 等. 綠原酸研究進(jìn)展[J]. 食品與藥品， 2017， 19（3）： 222-227.

[3] 彭? 莎， 霍曉乾， 霍夢琪， 等. 基于系統(tǒng)中藥學(xué)的金銀花清熱解毒功效標(biāo)志物研究[J]. 中國中藥雜志， 2020， 45（14）： 3275-3281.

[4] 王玲娜， 姚佳歡， 馬超美. 綠原酸的研究進(jìn)展[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2017， 36（11）： 1121-1130.

[5] 周日寶， 童巧珍. 灰氈毛忍冬與正品金銀花的綠原酸含量比較[J]. 中藥材， 2003， 26（6）： 399-400.

[6] YUAN Y， WANG Z Y， JIANG C， et al. Exploiting genes and functional diversity of chlorogenic acid and luteolin biosyntheses in Lonicera japonica and their substitutes[J]. Gene， 2014， 534（2）： 408-416.

[7] NIGGEWEG R， MICHAEL A J， MARTIN C. Engineering plants with increased levels of the antioxidant chlorogenic acid[J]. Nature Biotechnology， 2004， 22（6）： 746-754.

[8] CARDENAS C L， COSTA M A， LASKAR D D， et al. RNA imodulation of chlorogenic acid and lignin deposition in Nicotiana tabacum and insufficient compensatory metabolic cross-talk[J]. Journal of Natural Products， 2021， 84（3）： 694-706.

[9] LEPELLEY M， CHEMINADE G， TREMILLON N， et al. Chlorogenic acid synthesis in coffee： An analysis of CGA content and real-time RT-PCR expression of HCT， HQT， C3H1， and CCoAOMT1 genes during grain development in C. canephora[J]. Plant Science， 2007， 172（5）： 978-996.

[10] COMINO C， HEHN A， MOGLIA A， et al. The isolation and mapping of a novel hydroxycinnamoyltransferase in the globe artichoke chlorogenic acid pathway[J]. BMC Plant Biology， 2009， 9： 30.

[11] SONNANTE G， D'AMORE R， BLANCO E， et al. Novel hydroxycinnamoyl-coenzyme A quinate transferase genes from artichoke are involved in the synthesis of chlorogenic acid[J]. Plant Physiology， 2010， 153（3）： 1224-1238.

[12] PENG X X， LI W D， WANG W Q， et al. Cloning and characterization of a cDNA coding a hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase involved in chlorogenic acid biosynthesis in Lonicera japonica[J]. Planta Medica， 2010， 76（16）： 1921-1926.

[13] 陳澤雄. 灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz）中綠原酸生物合成途徑及調(diào)控技術(shù)研究[D]. 重慶： 重慶大學(xué)， 2016.

[14] 姜福星， 廖宇嘉， 吳? 生， 等. 白花虎眼萬年青綠原酸合成酶基因QtHQT的克隆及表達(dá)分析[J]. 分子植物育種， 2016， 14（12）： 3325-3333.

[15] XU J， ZHU J H， LIN Y H， et al. Comparative transcriptome and weighted correlation network analyses reveal candidate genes involved in chlorogenic acid biosynthesis in sweet potato[J]. Scientific Reports， 2022， 12（1）： 2770.

[16] 何? 柳， 陳士林. 植物中綠原酸合成途徑研究進(jìn)展[J]. 藥物生物技術(shù)， 2013， 20（5）： 463-466.

[17] 劉湘丹， 徐玉琴， 王? 珊， 等. 適用于基因全長克隆的灰氈毛忍冬不同器官總RNA提取方法篩選[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015， 35（12）： 60-63.

[18] 楊銀菊， 陳愛國， 劉光亮， 等. 煙草綠原酸生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2018（13）： 5-8， 10.

[19] 李隆云， 張? 應(yīng)， 馬? 鵬， 等. 山銀花（灰氈毛忍冬）適宜采收期研究[J]. 中國中藥雜志， 2014， 39（16）： 3060-3064.

[20] 楊欣欣， 包永睿， 王? 帥， 等. 不同采收期金銀花藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥， 2015， 26（6）： 1466-1468.

[21] 鄧玲姣， 周曉舟， 黃素梅， 等. 忻城縣金銀花及其莖、葉中綠原酸含量測定[J]. 廣西農(nóng)學(xué)報(bào)， 2007， 22（5）： 34-36.

[22] 吳飛燕， 卿志星， 曾建國. HPLC測定灰氈毛忍冬不同部位中綠原酸和木犀草苷的含量[J]. 中國現(xiàn)代中藥， 2014， 16（8）： 614-617.

[23] CL？魪 C， HILL L M， NIGGEWEG R， et al. Modulation of chlorogenic acid biosynthesis in Solanum lycopersicum; consequences for phenolic accumulation and UV-tolerance[J]. Phytochemistry， 2008， 69（11）： 2149-2156.

[24] 張靜茹， 吳敏琳， 李衛(wèi)東， 等. 金銀花HQT基因在真核植物細(xì)胞中對(duì)綠原酸生物合成的調(diào)控[J]. 中草藥， 2016， 47（20）： 3683-3687.

[25] CHEN Z X， LIU G H， LIU Y Q， et al. Overexpression of the LmHQT1 gene increases chlorogenic acid production in Lonicera macranthoides Hand-Mazz[J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2017， 39（1）： 27.

（本文編輯? 蘇? 維）