◎ 郝長(zhǎng)偉，柴發(fā)永

（1.包頭東寶生物技術(shù)股份有限公司，內(nèi)蒙古 包頭 014030；2.山東省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250014）

越橘是杜鵑花科植物，屬于低糖水果，味道酸甜可口，可鮮食，亦可制作果醬等食品。越橘中含有豐富的花青素，是一種天然抗氧化劑，具有抗氧化、保護(hù)視力、修復(fù)肌膚、調(diào)節(jié)血脂、抗癌癥等多種功效，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，是食品加工等領(lǐng)域的熱門原料[1]。但鮮有文章報(bào)道越橘花青素的純化工藝及其食用安全性，本試驗(yàn)采用大孔樹脂吸附法對(duì)越橘花青素進(jìn)行分離純化，通過單因素試驗(yàn)確定其最佳工藝條件，并進(jìn)行大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)，為高純度、高收率的越橘花青素純化工藝及其食用安全性研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

越橘鮮果，莊河市光華村巴爾虎屯種植基地；乙醇、甲醇、HCl、NaOH均為分析純；超純水；SPF級(jí)SD大鼠80只，雌雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

飛燕草素標(biāo)準(zhǔn)品（四川省維克奇生物科技有限公司），DM21大孔樹脂（山東魯抗立科藥物科技有限公司），AB-8大孔樹脂（天津南開大學(xué)化工廠），XAD-7HP大孔樹脂（北京慧德易科技有限責(zé)任公司），AB204-S型電子分析天平（德國Sartorius），HH-S8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司），SHZ-D Ⅲ型水浴恒溫振蕩器（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），SJ-4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），TU-18010紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），BD-SW50光學(xué)顯微鏡（深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司），URIT-8036全自動(dòng)生化分析儀（成都一科儀器設(shè)備有限公司），N-1300S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 越橘花青素粗提液的制備

取適量越橘鮮果，壓榨后分離出果渣，加入50%乙醇，料液比為1∶6，提取溫度62 ℃，提取2次，每次2 h，合并提取液，4 000 r·min-1離心15 min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮提取液，除去乙醇，用蒸餾水定容，得越橘花青素粗提液。

1.2.2 吸光度的測(cè)定

精密稱取飛燕草素對(duì)照品5 mg，加入2%鹽酸-甲醇定容至25 mL，精密稱取1 mL溶液于25 mL容量瓶中，用2%鹽酸-甲醇定容至刻度線，即為對(duì)照品溶液。精密稱取對(duì)照品溶液，加2%鹽酸-甲醇稀釋至飛燕草素質(zhì)量濃度為1.10 μg·mL-1、3.31 μg·mL-1、5.52 μg·mL-1、6.62 μg·mL-1、8.83 μg·mL-1。以2%鹽酸-甲醇溶液為空白，采用紫外可見分光光度法，測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處吸光度。以飛燕草素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得回歸方程y=0.099 6x+0.035 6，R2=0.999 1，線性關(guān)系良好。以2%鹽酸-甲醇作為空白試劑，取適量待測(cè)溶液，測(cè)定540 nm處吸光度。

1.2.3 大孔樹脂預(yù)處理

將大孔樹脂浸入95%乙醇溶液，室溫下浸泡24 h，去除樹脂表面吸附的雜質(zhì)和污染物，用蒸餾水清洗至pH值中性且無醇味，加入3% HCl水溶液室溫下浸泡3 h，用蒸餾水洗至pH值中性，徹底去除殘留的酸性物質(zhì)；加入3% NaOH溶液室溫下浸泡3 h，用蒸餾水洗至pH值中性，備用。

1.2.4 大孔樹脂靜態(tài)吸附、解吸性能研究

分別稱取2 g預(yù)處理好的XAD-7HP、AB-8、DM21大孔樹脂放入150 mL錐形瓶中，加入10 mL越橘花青素粗提液（吸光度值為A0），并封口置于搖床中，25 ℃恒溫振蕩12 h，測(cè)定溶液吸光度值A(chǔ)1，并計(jì)算3種大孔樹脂對(duì)越橘花青素的飽和吸附率。

分別取一定量已飽和的大孔樹脂，加入50 mL 80%酸性乙醇溶液，于25 ℃下振蕩解吸12 h，使吸附在大孔樹脂中的越橘花青素逐漸解吸，測(cè)定解吸后的溶液吸光度值A(chǔ)2，并計(jì)算3種大孔樹脂對(duì)越橘花青素的解吸率。

以大孔樹脂對(duì)越橘花青素的飽和吸附率和解吸率為指標(biāo)，考察大孔樹脂靜態(tài)吸附、解吸性能，篩選出最佳的大孔樹脂。吸附率和解吸率計(jì)算如式（1）和式（2）所示。

1.2.5 大孔樹脂靜態(tài)吸附、解吸試驗(yàn)

稱取最佳大孔樹脂2 g，濾紙拭干表面水分，置于錐形瓶中，加入50 mL越橘花青素粗提液，封口振蕩，測(cè)定24 h溶液吸光度，計(jì)算吸附率，繪制靜態(tài)吸附平衡曲線。

取上述已吸附飽和的大孔樹脂于錐形瓶中，加入80%酸性乙醇溶液50 mL，封口振蕩，測(cè)定24 h溶液吸光度，計(jì)算解吸率，繪制靜態(tài)解吸平衡曲線。

1.2.6 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附、解吸試驗(yàn)

（1）上樣液濃度的研究。分別取5份越橘花青素粗提液，加蒸餾水稀釋至質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.4 mg·mL-1、1.8 mg·mL-1，控制吸附流速相同，測(cè)定動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)前后溶液吸光度值A(chǔ)，計(jì)算吸附率。

（2）上樣液pH值的研究。分別取5份2 mL越橘花青素粗提液置于10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，調(diào)節(jié)溶液pH值分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0，控制流速相同，測(cè)定動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)前后溶液吸光度值A(chǔ)，計(jì)算吸附率。

（3）吸附流速的研究。分別取5份2 mL越橘花青素粗提液置于10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，控制溶液吸附流速分別為0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1、2.0 mL·min-1、2.5 mL·min-1，測(cè)定動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)前后溶液吸光度值A(chǔ)，計(jì)算吸附率。

（4）洗脫液濃度的研究。分別稱取5份2 g已吸附飽和的大孔樹脂濕法裝柱，控制洗脫流速相同，加蒸餾水沖洗，另取相同用量的50%、60%、70%、80%、90%乙醇沖洗柱子，測(cè)定動(dòng)態(tài)解吸試驗(yàn)前后溶液吸光度值A(chǔ)，計(jì)算解吸率。

（5）洗脫液用量的研究。稱取2 g已吸附飽和的大孔樹脂濕法裝柱，控制洗脫流速相同，加蒸餾水沖洗，另取乙醇沖洗柱子，每使用1 BV乙醇時(shí)收集1次洗脫液，進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸試驗(yàn)，記錄溶液吸光度值A(chǔ)的變化。

（6）洗脫流速的研究。分別稱取5份2 g已吸附飽和的大孔樹脂濕法裝柱，加蒸餾水沖洗，另取乙醇沖洗柱子，分別控制5個(gè)柱子洗脫流速為1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1、2.0 mL·min-1、2.5 mL·min-1、3.0 mL·min-1，測(cè)定動(dòng)態(tài)解吸試驗(yàn)前后溶液吸光度值A(chǔ)，計(jì)算解吸率。

1.2.7 最佳純化工藝參數(shù)驗(yàn)證

根據(jù)試驗(yàn)篩選出的最佳純化工藝參數(shù)，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，以吸附率和解吸率為指標(biāo)，進(jìn)行純化工藝驗(yàn)證，并測(cè)定花青素含量。

1.2.8 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

80只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)均分為對(duì)照組，越橘花青素低、中、高劑量組（1 g·kg-1、2 g·kg-1、4 g·kg-1）4組，低、中、高劑量組大鼠摻飼料喂食上述純化工藝而得的越橘花青素，對(duì)照組給予正常飲食，連續(xù)30 d。記錄各組大鼠一般情況、中毒及死亡情況。試驗(yàn)結(jié)束后禁食16 h，取血測(cè)定血液指標(biāo)、血清生化指標(biāo)；處死大鼠，稱量肝、腎、脾、睪丸，計(jì)算臟器系數(shù)，取對(duì)照組和越橘花青素高劑量組大鼠主要臟器，進(jìn)行病理學(xué)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附、解吸性能分析

如表1結(jié)果顯示，吸附率、解吸率均為XAD-7HP＜AB-8＜DM21，其中DM21大孔樹脂對(duì)越橘花青素的吸附率、解吸率均在80%以上，故選DM21作為純化樹脂。

表1 3種大孔樹脂靜態(tài)吸附、解吸性能比較表

2.2 DM21大孔樹脂對(duì)越橘花青素的靜態(tài)試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 越橘花青素靜態(tài)吸附平衡曲線

由圖1可知，2.5 h時(shí)吸附率達(dá)到81.54%，3 h時(shí)吸附率達(dá)到81.88%，3～24 h吸附率基本恒定。考慮到生產(chǎn)效率，選擇最佳吸附時(shí)間為2.5 h。

圖1 靜態(tài)吸附平衡曲線圖

2.2.2 越橘花青素靜態(tài)解吸平衡曲線

由圖2可知，2 h時(shí)解吸率最大（93.45%），選擇最佳解吸時(shí)間為2 h。

圖2 靜態(tài)解吸平衡曲線圖

2.3 DM21大孔樹脂對(duì)越橘花青素的動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 上樣液濃度對(duì)大孔樹脂吸附率的影響

由圖3可知，上樣液濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)吸附率最大。上樣液濃度繼續(xù)增加，部分雜質(zhì)被大孔樹脂吸附，影響大孔樹脂吸附花青素能力，降低了吸附率。因此，最佳上樣液濃度為1.0 mg·mL-1。

圖3 上樣液濃度對(duì)大孔樹脂吸附率的影響圖

2.3.2 上樣液pH值對(duì)大孔樹脂吸附率的影響

由圖4可知，當(dāng)pH值為1.0～3.0時(shí)，大孔樹脂吸附率逐漸增加，增加趨勢(shì)較小，當(dāng)pH值超過3.0時(shí)，吸附率顯著下降，可能由于酸性環(huán)境減弱，樣液中部分花青素在吸附前已分解，導(dǎo)致花青素含量減少，吸附率降低[3-4]。故調(diào)節(jié)上樣液pH值為3.0后再進(jìn)行吸附。

圖4 上樣液pH值對(duì)大孔樹脂吸附率的影響圖

2.3.3 吸附流速對(duì)大孔樹脂吸附率的影響

由圖5可知，當(dāng)吸附流速到達(dá)1.5 mL·min-1時(shí)，吸附率最高。吸附流速繼續(xù)增加，吸附率降低，可能是吸附流速過快，上樣液中花青素與大孔樹脂接觸不充分，易出現(xiàn)過早泄露情況，導(dǎo)致吸附率降低[5]。因此，選擇流速為1.5 mL·min-1進(jìn)行吸附。

圖5 吸附流速對(duì)大孔樹脂吸附率的影響圖

2.3.4 洗脫液濃度對(duì)大孔樹脂解吸率的影響

由圖6可知，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，解吸率出現(xiàn)最大值。研究顯示，花青素與乙醇溶液、大孔樹脂之間均存在分子間作用力，兩個(gè)作用力處于平衡狀態(tài)時(shí)，大孔樹脂吸附的花青素易被洗脫至乙醇溶液中[4]。因此，選擇80%乙醇作為洗脫液。

圖6 洗脫液濃度對(duì)大孔樹脂解吸率的影響圖

2.3.5 洗脫液用量對(duì)大孔樹脂解吸率的影響

由圖7可知，從3 BV起始，隨著洗脫液用量繼續(xù)增加，溶液吸光度值趨向平穩(wěn)狀態(tài)。因此，選擇洗脫液用量為3 BV。

圖7 洗脫液用量對(duì)大孔樹脂解吸率的影響圖

2.3.6 洗脫流速對(duì)大孔樹脂解吸率的影響

由圖8可知，隨著洗脫流速的增加，解吸率先升高后降低。主要因?yàn)橄疵摿魉龠^快，洗脫液無法充分接觸大孔樹脂，花青素析出量減少，導(dǎo)致解吸率降低[5]。因此，選擇2.0 mL·min-1作為洗脫速率。

圖8 洗脫流速對(duì)大孔樹脂解吸率的影響圖

2.4 最佳純化工藝參數(shù)驗(yàn)證

選用DM21大孔樹脂進(jìn)行吸附，上樣液濃度為1.0 mg·mL-1，pH值為3.0，吸附流速為1.5 mL·min-1，吸附2.5 h；選擇80%乙醇作為洗脫液，洗脫流速為2.0 mL·min-1，洗脫液用量為3 BV（即60 mL），洗脫2 h。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝驗(yàn)證，并測(cè)定花青素含量，結(jié)果見表2。

表2 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表

2.5 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 大鼠一般情況、中毒及死亡情況

試驗(yàn)期間，各組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好，未見異常體征，行為活動(dòng)正常，攝食攝水如常，無中毒及死亡情況。

2.5.2 大鼠血液、血清指標(biāo)及主要臟器系數(shù)結(jié)果

與對(duì)照組相比，給予大鼠不同劑量越橘花青素30 d后，越橘花青素各劑量組大鼠血液學(xué)指標(biāo)（紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、血小板、血細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞）、血清生化指標(biāo)（谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白、總膽固醇、甘油三酯、血糖、肌酐和尿素氮）及臟器系數(shù)（肝重、肝/體重、腎重、腎/體重、脾重、脾/體重、睪丸重和睪丸/體重）均無顯著性差異。

2.5.3 病理學(xué)組織檢查結(jié)果

各組大鼠主要臟器外形、體積、色澤、構(gòu)造均未見異常；顯微鏡下觀察，各組大鼠主要臟器組織未見明顯病理變化。

3 結(jié)論與討論

大孔樹脂是一種經(jīng)濟(jì)、可持續(xù)和環(huán)保的分離純化技術(shù)，對(duì)不同種類的花青素具有選擇性吸附，可以在純化過程中達(dá)到高效、高選擇性和高質(zhì)量的目標(biāo)[6]。本試驗(yàn)選用最佳吸附樹脂DM21進(jìn)行越橘花青素純化試驗(yàn)，得到最佳純化工藝：上樣液濃度1.0 mg·mL-1、上樣液pH=3.0、吸附流速1.5 mL·min-1、吸附2.5 h；洗脫劑濃度80%、洗脫液用量為3 BV（60 mL）、洗脫流速2.0 mL·min-1、洗脫2 h。經(jīng)驗(yàn)證，純化工藝穩(wěn)定，越橘花青素含量最高可達(dá)27.1%。經(jīng)大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)，越橘花青素各劑量組與對(duì)照組比較，各檢驗(yàn)項(xiàng)目均無顯著性差異，主要臟器組織無明顯損傷性病理變化，說明越橘花青素?zé)o毒性作用。越橘花青素是目前發(fā)現(xiàn)最有效的植物抗氧化劑，應(yīng)用前景廣闊，值得進(jìn)一步深入研究。