黃浦洋 江強(qiáng) 黃巧霞 符圣亮 王聰

(儋州市人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科,海南 儋州 571700)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種炎癥性疾病,其特征是炎癥細(xì)胞滲透到滑液中,導(dǎo)致滑膜、關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)骨骼變性〔1,2〕。由于久坐的生活方式和對(duì)RA的認(rèn)識(shí)不足,中國(guó)RA(尤其是女性)的患病率正在增加〔3〕。Toll樣受體(TLR)4是一種非特異性免疫的蛋白質(zhì)分子,其可調(diào)控下游因子絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)參與病理生理過(guò)程中的炎癥反應(yīng)。Huang等〔4〕研究顯示,抑制TLR4/MAPK信號(hào)通路表達(dá)可減輕急性肺損傷小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)。Wu等〔5〕研究報(bào)道,TLR4/MAPK通路下調(diào)可減輕四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝臟炎癥反應(yīng),減少病原菌。柚皮素是一種二氫黃酮類(lèi)化合物,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用〔6〕。有研究報(bào)道,柚皮素可減輕丙烯酰胺腎毒性大鼠腎組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),改善腎組織細(xì)胞凋亡,從而保護(hù)大鼠腎功能〔7〕。Wang等〔8〕研究表明,柚皮素可改善單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織病理結(jié)構(gòu),降低炎癥因子表達(dá),從而發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化的作用。但柚皮素是否對(duì)RA有治療作用尚未有研究。故本研究擬通過(guò)TLR4/MAPK信號(hào)通路探究柚皮素對(duì)RA大鼠的作用效果,以期為RA的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 雄性SD大鼠(清潔級(jí),10周齡,體質(zhì)量247～270 g),購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(云)2021-0002。在自然通風(fēng)、12 h明暗循環(huán)、(26±2)℃環(huán)境中飼養(yǎng)1 w。本研究經(jīng)儋州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要藥物、試劑和儀器 柚皮素(批號(hào)480-41-1,原料藥,純度99.98%,上海純優(yōu)生物科技有限公司);甲氨蝶呤片(批號(hào)20211209,吉林省通化茂祥制藥有限公司);牛Ⅱ型膠原液體、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)盒、TRIzol試劑、蛋白提取試劑盒、羊抗鼠二抗(批號(hào)分別為JK56958S、JK52147S、JK25968S、JK48968S、JK20159S、JK90157、JK20671,北京中生瑞泰科技有限公司);白細(xì)胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色劑、MAPK單克隆抗體(批號(hào)分別為M-19152、M-19131、M-50174,北京金道欣生物技術(shù)有限公司);IL-1β ELISA試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、TLR4單克隆抗體、β-actin單克隆抗體(批號(hào)分別為21-1712、21-19143、21-06072、22-09124,武漢諾見(jiàn)生物技術(shù)有限公司);酶標(biāo)儀、顯微鏡(型號(hào)分別為Synergy H4、MWP-101,上海然哲儀器設(shè)備有限公司);熒光定量PCR儀(型號(hào)Q380,上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司);化學(xué)發(fā)光圖像分析儀(型號(hào)ChampChemi 610,南京世研儀器設(shè)備有限公司)。

1.3動(dòng)物建模、分組及給藥 根據(jù)文獻(xiàn)〔9〕中的方法進(jìn)行RA大鼠造模:將濃度為2 mg/ml的牛Ⅱ型膠原液體與完全弗氏佐劑按等比例混合成混懸液A,與不完全弗氏佐劑按等比例混合成混懸液B。采用乙醚麻醉大鼠后,第1天從尾根部注射混懸液A 0.1 ml,第7天從尾根部注射混懸液B 0.1 ml,第14天觀察到大鼠踝關(guān)節(jié)明顯紅腫且體積增大,則表明造模成功〔9〕。成功造模56只大鼠,隨機(jī)分成模型組、甲氨蝶呤組(1 mg/kg)〔10〕、柚皮素低劑量組(50 mg/kg)、柚皮素高劑量組(100 mg/kg)〔11〕,每組14只。另取14只健康大鼠分別于第1天和第7天尾根部各注射0.1 ml生理鹽水設(shè)為對(duì)照組。造模成功后,甲氨蝶呤組、柚皮素低、高劑量組分別灌胃1 mg/kg的甲氨蝶呤、50、100 mg/kg的柚皮素(濃度分別為0.1 mg/ml的甲氨蝶呤混懸液、5、10 mg/ml的柚皮素混懸液,灌胃體積10 ml/kg);模型組和對(duì)照組灌胃10 ml/kg的生理鹽水,1次/d,連續(xù)給藥4 w。

1.4關(guān)節(jié)腫脹度檢測(cè) 分別于造模前、給藥結(jié)束后第1天,采用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠左側(cè)后足爪體積,方法如下:以大鼠左側(cè)后足踝關(guān)節(jié)上0.8 cm為基準(zhǔn),將0.8 cm以下的部位全部浸沒(méi)在水槽中,讀取大鼠左側(cè)后足體積(取測(cè)量5次的平均值),計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度〔關(guān)節(jié)腫脹度=(給藥結(jié)束后第1天體積值-造模前體積值)/造模前體積值×100%〕。

1.5關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分 分別于造模成功后第1天、給藥結(jié)束后第1天對(duì)大鼠雙側(cè)后足爪關(guān)節(jié)腫脹進(jìn)行評(píng)分,標(biāo)準(zhǔn)如下〔12〕:正常無(wú)紅腫計(jì)0分;趾關(guān)節(jié)紅腫計(jì)1分;足趾和趾關(guān)節(jié)腫脹計(jì)2分;踝關(guān)節(jié)以下部位腫脹發(fā)紅計(jì)3分;整只足爪腫脹計(jì)4分。統(tǒng)計(jì)兩只后足爪腫脹情況,將兩只后足爪評(píng)分之和計(jì)為總評(píng)分,最高為8分,得分越高表示腫脹程度越嚴(yán)重。

1.6血清炎性指標(biāo)檢測(cè) 于給藥結(jié)束后第1天用戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血3 ml,分離血清,采用ELISA檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.7踝關(guān)節(jié)組織病理觀察 斷頭處死大鼠,獲取右側(cè)后足踝關(guān)節(jié)組織,清洗后經(jīng)乙二胺四乙酸脫鈣,石蠟包埋、切片(4 μm厚),HE染色后顯微鏡觀察病理變化。

1.8踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK mRNA表達(dá)檢測(cè) 取右側(cè)后足踝關(guān)節(jié)滑膜組織,將其勻漿,利用TRIzol試劑提取滑膜組織中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。PCR條件如下:95 ℃持續(xù)48 s,42個(gè)循環(huán)(95 ℃持續(xù)5 s,60 ℃持續(xù)34 s,73 ℃持續(xù)21 s),引物由北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司合成。序列如下:TLR4上游引物:5′-CACACCCCAGCCATGTACG-3′,下游5′-ATGTCACGCACGATTTCAC-3′;MAPK上游引物:5′-TGTCCAGAATTGCAGGTCTTTG-3′,下游:5′-ATCCCGCTTAAGAATAGGTAGGT-3′;β-actin上游引物:5′-AAGGAGGTGGCTATGACAGAG-3′,下游:5′-GTGAGTGCGTTAGGCCCAT-3′。以2-ΔΔCt法計(jì)算TLR4、MAPK mRNA表達(dá)水平。

1.9踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK蛋白表達(dá)檢測(cè) 取1.8中勻漿的踝關(guān)節(jié)滑膜組織,蛋白提取試劑盒提取滑膜組織中的總蛋白,進(jìn)行蛋白濃度定量后,上樣100 μg總蛋白進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜操作,12%脫脂奶封閉膜3 h,加入TLR4(1∶700)、MAPK(1∶900)、β-actin(1∶1 100)單克隆抗體,在5 ℃環(huán)境下孵育24 h,洗膜后添加羊抗鼠二抗(1∶2 100)于26 ℃孵育4.5 h,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光圖像分析儀對(duì)蛋白條帶進(jìn)行可視化,并使用Image-Pro Plus軟件對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行定量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1柚皮素對(duì)關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分的影響 與對(duì)照組比較,模型組關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分顯著升高(P<0.05);與模型組比較,甲氨蝶呤組、柚皮素低、高劑量組關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分顯著降低(P<0.05);柚皮素高劑量組關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分顯著低于柚皮素低劑量組(P<0.05);甲氨蝶呤組和柚皮素高劑量組關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分、血清TNF-α、IL-6、IL-1β比較

2.2柚皮素對(duì)血清炎性指標(biāo)的影響 與對(duì)照組比較,模型組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,甲氨蝶呤組、柚皮素低、高劑量組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低(P<0.05);柚皮素高劑量組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著低于柚皮素低劑量組(P<0.05);甲氨蝶呤組和柚皮素高劑量組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3柚皮素對(duì)踝關(guān)節(jié)組織病理的影響 對(duì)照組踝關(guān)節(jié)表現(xiàn)出正常的關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu),沒(méi)有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);模型組踝關(guān)節(jié)軟骨層明顯增厚,表現(xiàn)出彌漫性中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),關(guān)節(jié)軟骨侵蝕和滑膜炎(箭頭所示);甲氨蝶呤組及柚皮素高劑量組踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整,無(wú)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥表現(xiàn);柚皮素低劑量組踝關(guān)節(jié)具有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(箭頭所示),軟骨結(jié)構(gòu)疏松紊亂。見(jiàn)圖1。

圖1 各組踝關(guān)節(jié)組織病理結(jié)構(gòu)(HE染色,×200)

2.4柚皮素對(duì)踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,模型組踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,甲氨蝶呤組、柚皮素低、高劑量組踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);柚皮素高劑量組踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK mRNA表達(dá)水平顯著低于柚皮素低劑量組(P<0.05);甲氨蝶呤組和柚皮素高劑量組踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

2.5柚皮素對(duì)踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK蛋白表達(dá)影響 與對(duì)照組比較,模型組踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,甲氨蝶呤組、柚皮素低、高劑量組踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);柚皮素高劑量組踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK蛋白表達(dá)水平顯著低于柚皮素低劑量組(P<0.05);甲氨蝶呤組和柚皮素高劑量組踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

1～5:對(duì)照組、模型組、甲氨蝶呤組、柚皮素低劑量組、柚皮素高劑量組圖2 各組踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK蛋白表達(dá)

3 討 論

RA是一種自身免疫性關(guān)節(jié)疾病,其特征是滑膜炎癥和增生、關(guān)節(jié)軟骨退化和結(jié)構(gòu)性骨侵蝕,導(dǎo)致進(jìn)行性殘疾。有證據(jù)表明,RA的發(fā)病機(jī)制涉及多種免疫、環(huán)境和遺傳因素〔13〕。但是該疾病嚴(yán)重程度及炎性和破壞性介質(zhì)表達(dá)增加的根本原因仍然未知。RA的當(dāng)前治療策略包括使用非甾體抗炎藥、改善病情的抗風(fēng)濕藥及使用皮質(zhì)類(lèi)固醇和抑制主要促炎細(xì)胞因子合成的生物化合物。這些藥物可長(zhǎng)期緩解RA癥狀,但在治療中斷后,仍可導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)〔14〕。疾病復(fù)發(fā)是治療RA的潛在障礙之一,為了在RA治療中獲得更多益處,需要開(kāi)發(fā)新藥以獲得長(zhǎng)期緩解。

柚皮素具有優(yōu)秀的抗風(fēng)濕、抗炎作用。Zhang等〔15〕研究發(fā)現(xiàn),柚皮素可通過(guò)減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜損傷,有效改善RA大鼠治療效果。Hua等〔16〕研究表明,柚皮素可改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠代謝參數(shù),抑制肝脂肪變性,減少肝纖維化和細(xì)胞衰老,抑制肝臟炎癥。Yang等〔17〕發(fā)現(xiàn),柚皮素可降低多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織炎癥,改善氧化微環(huán)境和胰島素抵抗,發(fā)揮對(duì)多囊卵巢綜合征的治療作用。本研究表明,柚皮素可改善RA大鼠關(guān)節(jié)腫脹和踝關(guān)節(jié)病理狀況,抑制炎癥反應(yīng),與上述研究結(jié)果一致。

TLR4/MAPK信號(hào)通路是炎癥和各種免疫疾病發(fā)展中的關(guān)鍵角色。Li等〔18〕研究發(fā)現(xiàn),抑制TLR4/MAPK信號(hào)通路可減輕脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠炎癥反應(yīng),提高大鼠存活率。Hassanein等〔19〕研究表明,反式阿魏酸可抑制TLR4/MAPK炎癥信號(hào)通路,減輕順鉑誘導(dǎo)的睪丸損傷大鼠睪丸組織氧化應(yīng)激過(guò)程,增強(qiáng)其體外細(xì)胞抗毒活性,對(duì)順鉑誘導(dǎo)的睪丸損傷顯示出潛在的保護(hù)作用。Li等〔20〕報(bào)道,抑制TLR4/MAPK通路可減輕RA大鼠癥狀(如腫脹、發(fā)紅和滑膜炎),降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分,并下調(diào)血清IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1和TNF-α等促炎細(xì)胞因子水平。本研究表明,柚皮素可抑制RA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4/MAPK信號(hào)通路表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),TLR4信號(hào)通路可影響重癥急性胰腺炎患者血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平,TLR4信號(hào)通路活性與TNF-α、IL-1β和IL-6呈正相關(guān)〔21〕。結(jié)合本研究結(jié)果,推測(cè)柚皮素對(duì)RA大鼠的治療作用,可能與其抑制TLR4/MAPK信號(hào)通路激活有關(guān)。

綜上所述,柚皮素對(duì)RA大鼠的治療作用明顯,可改善RA大鼠關(guān)節(jié)腫脹和踝關(guān)節(jié)病理狀況,抑制炎癥反應(yīng),其機(jī)制可能與柚皮素抑制RA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MAPK mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制TLR4/MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)。