林標(biāo)聲，陳冠羲，張清霽，林 彬，陳小紅,，黎 英,

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；2.龍巖學(xué)院生物科技與健康產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與 生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 龍巖 364012；3.龍巖市科技局農(nóng)村與社會(huì)發(fā)展科，福建 龍巖 364000）

客家“紅菌豆渣”主產(chǎn)于福建省武平縣，是以豆渣為原料，經(jīng)過(guò)霉制、發(fā)酵，分解出游離氨基酸，去除了豆腥味，加工制成的一種產(chǎn)品表面布滿橙紅色菌絲、風(fēng)味獨(dú)特、口感鮮美，富含膳食纖維、蛋白質(zhì)和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分的當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)美食[1]。但“紅菌豆渣”不易保存，只能在當(dāng)?shù)厥圪u，受到很多不可控的非人為因素所制約，如不能有雜菌的出現(xiàn)、不能密封保存等。紅菌只能在自然環(huán)境下生長(zhǎng)，一旦裝入瓶中，即失去鮮活的“生命”，成為死菌就不能食用[2]。此外，到目前為止，有關(guān)“紅菌豆渣”在發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化及代謝機(jī)制的科學(xué)研究較少，成為“紅菌豆渣”提高產(chǎn)量、質(zhì)量，走向標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化生產(chǎn)的重要制約因素。因此，對(duì)“紅菌豆渣”微生物發(fā)酵特性、主要營(yíng)養(yǎng)成分的變化及發(fā)酵機(jī)理機(jī)制等亟待進(jìn)一步深入分析。

本團(tuán)隊(duì)前期采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基從“紅菌豆渣”中已分離得到其主要的發(fā)酵菌株LY03，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、18S rDNA鑒定、重測(cè)序及框架圖測(cè)序，已確定其為Neurospora crassa[3]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，Neurospora crassaLY03菌株基因組中存在著豐富的纖維酶基因（cellulase），該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)對(duì)纖維構(gòu)成為主的豆渣發(fā)酵及營(yíng)養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)化具有重要的意義[4-5]。因而，本研究在不同發(fā)酵時(shí)間“紅菌豆渣”營(yíng)養(yǎng)成分分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序[6]、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術(shù)[7]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）非靶標(biāo)代謝組學(xué)[8]等現(xiàn)代生物技術(shù)尋找影響菌株發(fā)酵的主要差異表達(dá)基因、關(guān)鍵代謝物和代謝通路，探究cellulase基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對(duì)“紅菌豆渣”的發(fā)酵特性進(jìn)行深入分析，以獲得科學(xué)、量化的數(shù)據(jù)，為提高“紅菌豆渣”發(fā)酵轉(zhuǎn)化效率及探究其營(yíng)養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，使“紅菌豆渣”這一具有地方特色的發(fā)酵食品得到更為廣泛的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豆渣 市購(gòu)；Neurospora crassaLY03菌株由龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物發(fā)酵科研室分離，并于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏（保藏號(hào)：CGMCC3.19233）。

真菌總RNA提取試劑盒 美國(guó)Omega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real time PCR試劑盒、DL2000 DNA Marker 日本TaKaRa公司；引物由北京奧維森基因科技有限公司合成；雙縮脲、酪蛋白、石油醚、硼酸、苯酚、冰醋酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純；甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水等為色譜級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZF-30L-I高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；XMTD-8222電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海金宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；NanoDrop 2000分光光度計(jì)、Vanquish超高效液相色譜儀、Q Exactive HFX高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)Therno Scientific公司；Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng) 上海 天能科技有限公司；ABI7500熒光定量PCR儀 美國(guó) Applied Biosystems公司；JXFSTPRP-24研磨儀 上海凈信科技有限公司；PS-60AL超聲儀 深圳市雷德邦電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同發(fā)酵時(shí)間“紅菌豆渣”產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)成分分析

新豆渣炒熟冷卻至40 ℃；裝盒壓緊；按0.1%量撒Neurospora crassaLY03菌種孢子粉混勻，28 ℃培養(yǎng)，分別收集未接種的豆渣及發(fā)酵1、2、3 d和4 d（d1、d2、d3、d4表示，下同）的培養(yǎng)產(chǎn)品樣本各3 份進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分的分析。其中水分含量的測(cè)定采用GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》；纖維素含量的測(cè)定參照GB 29946—2013《食品添加劑 纖維素》；蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；總糖含量的測(cè)定參照蒽酮法；脂肪含量測(cè)定采用GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》；灰分含量測(cè)定參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》；總酸含量測(cè)定參照GB 12456—2021《食品中總酸的測(cè)定》。

1.3.2 不同發(fā)酵時(shí)間“紅菌豆渣”菌株總RNA樣本的提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

收集發(fā)酵d1、d2、d3和d4不同時(shí)間“紅菌豆渣”菌絲生長(zhǎng)樣本各3 份，混合均勻后采用真菌總RNA提取試劑盒提取各樣本總RNA，通過(guò)NanoDrop和Agilent 2100檢測(cè)RNA純度（OD260/280、OD260/230）及RNA片段長(zhǎng)度，各樣本檢測(cè)合格后委托北京奧維森基因科技有限公司完成文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序工作，建好的測(cè)序文庫(kù)采用Illumina HiSeq 4000高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。去除測(cè)序接頭和低質(zhì)量序列數(shù)據(jù)過(guò)濾原始數(shù)據(jù)后，采用star軟件將測(cè)序序列和轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行比對(duì)，隨后采用Cufflinks軟件組裝比對(duì)結(jié)果，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行RNA-seq相關(guān)性檢查。采用HTSeq軟件對(duì)各樣本進(jìn)行基因表達(dá)水平的分析，使用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的碎片（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，F(xiàn)PKM）值為1作為判斷基因是否表達(dá)的闕值，只分析FPKM＞1的基因）[9]，并使用DESeq進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選條件為q值小于0.05[10]。通過(guò)GOseq軟件對(duì)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）進(jìn)行基因功能（gene ontology，GO）富集分析[11]，將測(cè)序結(jié)果與京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行通路顯著性富集分析，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和分類[12]。

1.3.3 不同發(fā)酵時(shí)間“紅菌豆渣”菌株cellulose基因的real-time PCR分析

將上述研究中經(jīng)檢測(cè)合格并定量的不同發(fā)酵時(shí)間“紅菌豆渣”菌株總RNA樣本各取1.0 μg用于反轉(zhuǎn)錄成cDNA，操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄總體系20 μL，其中Master Mix 10 μL（包括5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL、gDNA Eraser 1.0 μL、Total RNA 1.0 μg，RNase-free H2O補(bǔ)至10 μL）、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、5×PrimeScript Buffer24.0 μL、RNase-free H2O 4.0 μL。將各樣本的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，設(shè)計(jì)cellulose（目的基因）及18S（內(nèi)參）兩對(duì)引物分別做PCR。

引物序列分別為：cellulose-F ：5′-ATGAGTGAATGGTGGAAAGAAG-3′；cellulose-R：5′-TCATATACTAATGCCCATCACAG-3′；18SF：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′；18S-R：5′-TTCCCCGTTACCCGTTG-3′。

PCR 反應(yīng)總體系18 μL，其中2×Master Mix 10.0 μL、Primer F（10 μmol/L）0.5 μL、Primer R（10 μmol/L）0.5 μL，加水至總體積18 μL。將18 μL混合液加到96-PCR板對(duì)應(yīng)的每個(gè)孔中，再加入對(duì)應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄成各樣本cDNA 2.0 μL，短暫離心混合后置于冰上，real-time PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，按以下程序進(jìn)行：95 ℃，30 s；40 個(gè)PCR循環(huán)（95 ℃，5 s；60 ℃，40 s（收集熒光））。建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)按如下溫度、時(shí)間進(jìn)行：95 ℃、10 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s）；并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃（儀器自動(dòng)進(jìn)行Ramp Rate為0.05 ℃/s）。選取cDNA樣本模板進(jìn)行10 倍梯度稀釋，各5 個(gè)梯度，每個(gè)樣本檢測(cè)3 個(gè)復(fù)孔，各樣本的目的基因（cellulose）和內(nèi)參（18S）分別進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，保存擴(kuò)增曲線、溶解曲線及對(duì)應(yīng)循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）[13]。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，計(jì)算公式為：ΔCt=Ctcellulose基因-C t18S內(nèi)參基因；ΔΔ Ct=Δ Ct不同發(fā)酵時(shí)間菌株樣本的cellulose基因-ΔCt發(fā)酵1d菌株樣本的cellulose基因，本實(shí)驗(yàn)選定發(fā)酵d1作為對(duì)照；2-ΔΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量，即不同發(fā)酵時(shí)間菌株樣本的cellulose基因相對(duì)于發(fā)酵d1的cellulose基因變化的倍數(shù)。測(cè)定值Ct≥2作為高表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)[14]。同時(shí)將所得real-time PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果按相同相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方式換算后進(jìn)行對(duì)比分析，驗(yàn)證cellulose基因在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中的可靠性[15]。

1.3.4 不同發(fā)酵時(shí)間“紅菌豆渣”產(chǎn)品的代謝物的提取及UPLC-MS/MS分析

分別收集未接種的豆渣及接種后發(fā)酵d1、d2、d3和d4不同時(shí)間的“紅菌豆渣”產(chǎn)品樣本各3 份，混合均勻后，每份產(chǎn)品樣本取50 mg放入1.5 mL EP管中，加入1000 μL提取液（甲醇-乙腈-水，2∶2∶1，V/V，含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物）提取。提取樣本經(jīng)研磨儀35 Hz下研磨處理4 min，再超聲處理5 min（冰水?。?，重復(fù)3 次；然后樣本放入-40 ℃靜置1 h，再采用12000 r/min高速離心機(jī)離心15 min，將離心后上清液置于LC-MS/MS進(jìn)樣瓶中進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。所有樣本另取等量上清液混合成質(zhì)控樣本上機(jī)檢測(cè)。

進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，通過(guò)Waters ACQUITY UPLC BEH Amide液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。流動(dòng)相A為水，含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水（pH 9.75），B相為乙腈[16]。采用梯度洗脫：0～0.5 min，5% A、95% B；0.5～7 min，5%～35% A、95%～65% B；7～8 min，35%～60% A、65%～40% B；8～9 min，60% A、40% B；9～9.1 min，60%～5% A，40%～95% B；9.1～12 min，5% A、95% B。流動(dòng)相流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，樣本盤溫度4 ℃，進(jìn)樣體積3 μL。

質(zhì)譜儀在控制軟件Xcalibur（Thermo）控制下進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，Xcalibur軟件持續(xù)評(píng)估全掃描MS光譜。電噴霧離子源；鞘氣流速30 arb，輔助氣流速25 arb，毛細(xì)管溫度350 ℃，全MS分辨率60000，MS/MS分辨率7500，碰撞能量歸一化模式下的碰撞能量為10、30、60 eV，離子源噴射電壓3.6 kV（正）或-3.2 kV（負(fù)）。

UPLC-MS/MS分析獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后，使用自主編寫(xiě)的R程序包（內(nèi)核為XCMS）進(jìn)行峰識(shí)別、峰提取、峰對(duì)齊和積分等處理，然后與自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋[17]。根據(jù)所得注釋結(jié)果，利用MetaboAnalyst和KEGG在線分析軟件對(duì)所獲得代謝產(chǎn)物的不同代謝途徑進(jìn)行分析，揭示Neurospora crassaLY03菌株在不同發(fā)酵時(shí)間“紅菌豆渣”產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生成的轉(zhuǎn)化機(jī)理[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時(shí)間“紅菌豆渣”產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分分析

如圖1所示，發(fā)酵d1，菌絲緩慢生長(zhǎng)，豆渣表面開(kāi)始出現(xiàn)少量菌絲；發(fā)酵d2，菌絲開(kāi)始大量生長(zhǎng)，產(chǎn)品表面已布滿橙紅色菌絲，還出現(xiàn)了少量孢子粉；發(fā)酵d3，產(chǎn)生大量孢子粉；發(fā)酵d4，菌絲開(kāi)始老化，顏色變深。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間“紅菌豆渣”產(chǎn)品Fig.1 Hongjundouzha with different fermentation times

如表1所示，未接種豆渣中主要成分為碳水化合物（纖維素、淀粉和多糖）和蛋白質(zhì)，接種菌株發(fā)酵后各營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生了明顯的變化，其中水分含量先降低后增加，纖維素、總糖含量明顯下降，蛋白質(zhì)、脂肪、灰分、總酸含量明顯增加，且發(fā)酵后產(chǎn)品各營(yíng)養(yǎng)成分含量均與發(fā)酵前差異顯著（P＜0.05）。研究表明，菌絲在生長(zhǎng)過(guò)程中，大量利用豆渣原料中的碳水化合物生成各種單糖，因而纖維、總糖含量降低；但相對(duì)而言，菌株利用蛋白能力較弱，蛋白質(zhì)分解較少，蛋白相對(duì)含量增加。同時(shí)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，豆渣中的一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被分解利用生成了醇類物質(zhì)、游離氨基酸、脂肪酸和有機(jī)酸等，這些醇類物質(zhì)與酸性物質(zhì)再通過(guò)酯化反應(yīng)生成脂類物質(zhì)，造成了產(chǎn)品中脂肪含量、有機(jī)酸含量明顯增加。此外，發(fā)酵過(guò)程中菌株生長(zhǎng)消耗原料中的有機(jī)物質(zhì)，干物質(zhì)含量降低，因而灰分所占比例增加。研究還發(fā)現(xiàn)，總體上發(fā)酵d2各項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)與發(fā)酵前、發(fā)酵d1差異顯著（P＜0.05），而與發(fā)酵后d2、d3差異不太顯著，表明發(fā)酵d2可能是“紅菌豆渣”營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時(shí)期。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間“紅菌豆渣”產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定Table 1 Nutritional components of Hongjundouzha with different fermentation times

2.2 Neurospora crassa LY03菌株在“紅菌豆渣”不同發(fā)酵時(shí)間轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1 不同發(fā)酵時(shí)間“紅菌豆渣”菌絲總RNA提取及檢測(cè)

不同發(fā)酵時(shí)間“紅菌豆渣”菌絲收集獲得的各樣本總RNA提取質(zhì)量較好，其OD260/280為2.021～2.157，OD260/230為1.2～2.316，RNA為140～562 ng/μL，樣本質(zhì)量滿足建庫(kù)測(cè)序要求。RNA樣本反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將構(gòu)建好的cDNA文庫(kù)，通過(guò)Illumina HiSeqTM4000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)去除帶有接頭（adapter）、N（不確定堿基）含量不小于10%和低質(zhì)量堿基（Q≤20）含量超過(guò)50%的reads，得到分析數(shù)據(jù)。12 個(gè)樣本均獲得了5.0 G以上容量的原始數(shù)據(jù)，鳥(niǎo)嘌呤-胞嘧啶（guanine-cytosine，GC）含量占比都在54%以上，平均錯(cuò)誤率均為0.03%，Q20與Q30分別在97%及91%以上（表2），表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所獲數(shù)據(jù)的質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析。兩樣本之間的相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.80，表明結(jié)果可靠且樣本選擇合理（圖2）。

表2 各樣本測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Sequencing data and quality test results of each sample

2.2.2 DEGs篩選

對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行表轉(zhuǎn)化處理后，根據(jù)|log2FC|大于1且q值小于0.05的原則篩選DEGs。d2 vs.d1篩選出2814 個(gè)DEGs（圖3a），有1254 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)（包括cellulose基因，ID1007），占總差異表達(dá)44.56%；1560 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，占總差異表達(dá)55.44%。d3 vs.d2篩選出69 個(gè)DEGs（圖3b），有57 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，占總差異表達(dá)82.61%；12 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)（包括cellulose基因），占總差異表達(dá)17.39%。d4 vs.d3篩選出1034 個(gè)DEGs（圖3c），有649 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，占總差異表達(dá)62.77%；385 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)（包括cellulose基因），占總差異表達(dá)37.23%。結(jié)果表明d2菌株大量生長(zhǎng)、基因表達(dá)活躍，與d1差異較大；d3相對(duì)于d2差異變化不大；d4與d3差異又增加，表明d4菌株開(kāi)始老化，基因表達(dá)差異明顯。以FPKM＞1作為判斷基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)，4 個(gè)樣本共獲得16 個(gè)共同表達(dá)基因，d2 vs.d1特有表達(dá)基因2379 個(gè)，d3 vs.d2特有表達(dá)基因20 個(gè)，d4 vs.d3特有表達(dá)基因612 個(gè)（圖3d），進(jìn)一步驗(yàn)證了豆渣發(fā)酵菌群功能發(fā)生明顯變化主要在發(fā)酵d2。

圖3 4 組樣本DEGs火山圖和Venn圖Fig.3 Volcano pot and Venn diagram of DEGs among four groups of samples

2.2.3 上調(diào)DEGs的KEEG富集

根據(jù)上調(diào)差異表達(dá)基因KEEG富集分析，分別對(duì)富集最顯著的20 條KEGG代謝通路分析，富集差異表達(dá)基因富集數(shù)目最多的信號(hào)通路均為“次生代謝物的生物合成”（圖4）。其中，d2 vs.d1中，“碳代謝和淀粉和蔗糖代謝”DEGs的富集最顯著（P＜0.05），表明d2為菌體進(jìn)行糖類代謝的主要階段（圖4a）。d3 vs.d2中，主要富集到各類的氨基酸代謝，包括“組氨酸代謝”、“色氨酸代謝”、“β-丙氨酸代謝”、“酪氨酸代謝”、“精氨酸和脯氨酸代謝”、“纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解”、“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”和“氨基酸生物合成”，表明d3為菌體進(jìn)行各類氨基酸代謝的主要階段（圖4b）。d4 vs.d3中，DEGs富集顯著的代謝途徑是“氧化磷酸化”、“淀粉和蔗糖代謝/過(guò)氧化物酶體”和“次生代謝物的生物合成”，表明d4菌絲體老化變色可能與其產(chǎn)生的氧化酶類及淀粉代謝生成的深色物質(zhì)有關(guān)[19]，該階段生成了大量的次生代謝產(chǎn)物（圖4c）。

圖4 上調(diào)DEGs的KEGG功能歸類Fig.4 KEGG functional classification of up-regulated DEGs

2.3 Neurospora crassa LY03菌株在 “紅菌豆渣”不同發(fā)酵時(shí)間cellulose基因的表達(dá)分析

1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)表明12 個(gè)樣本總RNA提取質(zhì)量較高，12 個(gè)樣本cellulose基因的real-time PCR的表達(dá)水平分析表明，各樣本溶解曲線均為單一尖銳峰，表明各擴(kuò)增產(chǎn)物單一、穩(wěn)定、復(fù)性較好，結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠。cellulose基因與18S基因的real-time PCR擴(kuò)增效率測(cè)定表明，目標(biāo)基因cellulose和內(nèi)參基因18S擴(kuò)增效率一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可應(yīng)用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。結(jié)果表明，不同發(fā)酵時(shí)間樣本的cellulose基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)2-ΔΔCt值分別為d11.00、d23.46、d32.15、d40.19（圖5），cellulose基因的表達(dá)呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)。其中，d2和d3cellulose基因的相對(duì)表達(dá)量均達(dá)到過(guò)表達(dá)水平（≥2），且均與d1相比差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。此外，cellulose基因real-time PCR測(cè)定的變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)錄組篩選出的DEGs具有可靠性。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間cellulose基因的相對(duì)表達(dá)量分析Fig.5 Analysis of relative expression of cellulose at different fermentation time

2.4 Neurospora crassa LY03菌株在“紅菌豆渣”不同發(fā)酵時(shí)間轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

2.4.1 “紅菌豆渣”不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)品代謝物的聚類分析

將“紅菌豆渣”未接種豆渣及接種后不同發(fā)酵時(shí)間共15 個(gè)產(chǎn)品樣本通過(guò)UPLC-MS/MS平臺(tái)進(jìn)行分析檢測(cè)到1910 個(gè)代謝物。主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘（orthogonal partial least squares，OPLS）分析[20]結(jié)果基本一致（圖6）。d2、d3和d4樣本能更好地聚類在一起，與d0和d1差異較大。

圖6 不同發(fā)酵時(shí)間樣本的PCA（a）和OPLS分析（b）圖Fig.6 PCA (a) and OPLS analysis (b) of samples at different fermentation times

2.4.2 “紅菌豆渣”不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)品代謝物的差異化合物熱圖分析

將不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)品的差異代謝化合物前60 位（變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）大于1，P＜0.05）進(jìn)行熱圖聚類分析（圖7）[21]，結(jié)果表明所篩選出的差異化合物主要可分為糖和糖醇、氨基酸、有機(jī)酸以及其他代謝物4 大類，其中糖和糖醇類14 個(gè)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中相對(duì)含量最高的三乙酸纖維素和纖維二糖逐漸下降，D-阿拉伯糖、山梨醇、D-木糖和L-巖藻糖相對(duì)含量逐漸上升再下降，總體上主要糖醇類相對(duì)含量變化發(fā)生在d2。氨基酸類13 個(gè)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，大部分氨基酸的相對(duì)含量明顯上升，其中d3為各氨基酸相對(duì)含量明顯增長(zhǎng)的時(shí)期，d4氨基酸含量開(kāi)始降低。有機(jī)酸類16 個(gè)，總體上發(fā)酵前期d1～d3各類有機(jī)酸相對(duì)含量均較高，發(fā)現(xiàn)許多具有保健作用的有機(jī)酸如蘋果酸、綠原酸、亞油酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸、4-羥基丁酸等，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，d4有機(jī)酸的相對(duì)含量降低。在其他代謝物類17 個(gè)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，豆渣中原有的糖苷類化合物、黃酮類化合物如大豆苷、6-染料木苷、染料木素等分解轉(zhuǎn)化成新橙皮苷、番木鱉堿、尿囊素、十四酸乙酯、溶血磷脂酰膽堿（18:4/18:1）、溶血磷脂酰膽堿（18:1）、次黃嘌呤、角鯊烯、2-羥基腺嘌呤等具有特殊生理活性的物質(zhì)，總體上d4是各次生代謝物生成的主要時(shí)期。

圖7 不同發(fā)酵時(shí)間差異代謝物相對(duì)含量的熱圖Fig.7 Heatmap of relative contents of differential metabolites at different fermentation times

2.5 Neurospora crassa LY03菌株在“紅菌豆渣”不同發(fā)酵時(shí)間轉(zhuǎn)錄組與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物關(guān)聯(lián)分析

通過(guò)KEGG富集分析，把轉(zhuǎn)錄組、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析共同富集到的通路進(jìn)行整理歸納，挑選出共同富集通路的前10[22]。結(jié)果表明，發(fā)酵前期d2關(guān)鍵基因和代謝物主要富集在“淀粉和蔗糖代謝”、“碳代謝”和“代謝途徑”（圖8a），表明該階段主要進(jìn)行糖類的代謝；d3主要進(jìn)行氨基酸和有機(jī)酸的代謝，關(guān)鍵基因和代謝物主要富集在“氨基酸生物合成”、“檸檬酸循環(huán)”和“丙酮酸代謝”（圖8b）；d4關(guān)鍵基因和代謝物主要富集在“次生代謝物的生物合成”和“氨基酸生物合成”，表明該階段主要進(jìn)行氨基酸和一些次生代謝物的合成（圖8c）。

圖8 基因與代謝物共同參與數(shù)最多的前10 個(gè)代謝通路Fig.8 Top 10 pathways with the largest number of genes and metabolites involved together

3 討論

研究不同發(fā)酵時(shí)間“紅菌豆渣”產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)成分，并對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析，結(jié)果表明“紅菌豆渣”發(fā)酵后其營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生了明顯的變化，豆渣原料中的碳水化合物、蛋白等成分轉(zhuǎn)化成了糖類、醇類物質(zhì)、脂肪酸、有機(jī)酸和游離氨基酸等，其中發(fā)酵2 d是“紅菌豆渣”營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時(shí)期。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及real-time PCR分析表明，d2基因表達(dá)最活躍，主要進(jìn)行糖類代謝，其中DEGcellulase表達(dá)最為活躍；d3主要進(jìn)行氨基酸代謝；d4主要進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的生成。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析表明，d0、d1與d2、d3、d4樣品差異較大，而d2、d3和d4樣本可以較好地聚類在一起?？傮w上，d2生成糖醇類和有機(jī)酸類化合物，d3生成氨基酸和有機(jī)酸，d4生成次生代謝產(chǎn)物及部分氨基酸，另外還生成氧化酶類產(chǎn)生深色物質(zhì)促使“紅菌豆渣”菌絲老化。轉(zhuǎn)錄組與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物關(guān)聯(lián)分析表明，轉(zhuǎn)錄組、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析共同富集通路主要是“淀粉和蔗糖代謝”、“碳代謝”、“氨基酸生物合成”和“丙酮酸代謝”。

“紅菌豆渣”發(fā)酵的主要原料為豆渣，其主要成分為碳水化合物（纖維素、淀粉、多糖等）和蛋白質(zhì)[23]。Neurospora crassa菌株是優(yōu)良的纖維素酶產(chǎn)生菌，本研究證實(shí)，豆渣接種Neurospora crassa進(jìn)行發(fā)酵，能對(duì)豆渣原料中的纖維素進(jìn)行較好地分解，產(chǎn)物為葡萄糖，其中cellulase基因的表達(dá)起了重要的作用。real-time PCR測(cè)定表明cellulose基因的表達(dá)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，其表達(dá)量變化趨勢(shì)與樣品中纖維素成分的分解變化及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。豆渣中淀粉分解產(chǎn)物為葡萄糖，而多糖則主要為水溶性、非淀粉還原性多糖[24-25]，經(jīng)“淀粉和蔗糖代謝”、“碳代謝”途徑代謝后分解成葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、巖藻糖等單糖。豆渣中碳水化合物還有糖醇和寡糖，經(jīng)代謝后分解成山梨醇、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇。各種糖類和糖醇類物質(zhì)再進(jìn)行“檸檬酸循環(huán)”、“丙酮酸代謝”、“次生代謝物的生物合成”生成多種具有保健作用的有機(jī)酸，如用于貧血癥、尿毒癥、高血壓等多種疾病治療的蘋果酸；具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降“三高”、清除自由基及增香、護(hù)色、防腐功效的綠原酸[26]；大多數(shù)人需要補(bǔ)充的多不飽和脂肪酸亞油酸、γ-亞麻酸和γ-花生四烯酸；具有預(yù)防老年癡呆癥發(fā)生、改善神經(jīng)機(jī)能、抗衰老、減肥、改善脂質(zhì)代謝等功效的4-羥基丁酸（又稱γ-羥基丁酸）[27]。豆渣中蛋白質(zhì)通過(guò)“氨基酸生物合成”途徑分解生成了谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸等各類氨基酸。此外，豆渣原料中原有的大豆苷、染料木苷、染料木素等成分通過(guò)“次生代謝物的生物合成”途徑生成一些具有特殊生理功能的活性物質(zhì)，如具有降血脂、降血糖作用的天然 黃酮化合物新橙皮苷[28]；具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶活性、增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤等多種生理功效的角鯊烯[29]及天然神經(jīng)毒素番木鱉堿[30]等，但同時(shí)也生成了一些指示食品腐敗的油脂溶血磷脂酰膽堿（18:4/18:1）和溶血磷脂酰膽堿（18:1）[31]。

4 結(jié)論

“紅菌豆渣”接種Neurospora crassa菌株進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵2 d，菌絲生長(zhǎng)旺盛，豆渣原料中的碳水化合物、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化強(qiáng)烈，cellulase基因的表達(dá)起了重要的作用；發(fā)酵3 d，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化基本平穩(wěn)，糖醇、氨基酸、脂類等風(fēng)味物質(zhì)生成，產(chǎn)品發(fā)酵成熟；發(fā)酵4 d，菌絲開(kāi)始老化，產(chǎn)生了一些具有特殊功能的生理活性物質(zhì)，但同時(shí)產(chǎn)品開(kāi)始出現(xiàn)腐敗。本研究從分子水平上全面分析“紅菌豆渣”營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制，可為提高“紅菌豆渣”的發(fā)酵效率，提升產(chǎn)品品質(zhì)，促進(jìn)其產(chǎn)品精深加工和高值化利用提供理論基礎(chǔ)。