黃文源，張 盈，魏 進，龍家寰，張昌朋，李 明，段婷婷,

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，貴州 貴陽 550006；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江 杭州 310021）

柑橘（Citrus reticulataBlanco.）為蕓香科柑橘屬植物，是我國種植面積與產(chǎn)量最大的栽培水果和重要的經(jīng)濟作物[1-2]。柑橘種植過程中易受到多種蟲害，造成產(chǎn)量與品質(zhì)的下降[3]，使用殺蟲劑是防治蟲害最有效的手 段[4]。啶蟲脒是第一代氯代煙堿型殺蟲劑，具有高效、廣譜及良好的內(nèi)吸性、觸殺和胃毒作用，對同翅目、鞘翅目、雙翅目和鱗翅目等害蟲防控效果理想[5]；吡丙醚是一種昆蟲生長調(diào)節(jié)劑，具有光穩(wěn)定性好、高效、用藥量少、對作物安全等特性，對同翅目、纓翅目、雙翅目、鱗翅目等害蟲防控效果理想[6]。啶蟲脒與吡丙醚在柑橘上登記用于防治蚜蟲、介殼蟲、粉虱、木虱等蟲害[7]，二者作用機制不同，不易產(chǎn)生交互抗性，已有農(nóng)藥公司在開展啶蟲脒與吡丙醚復配的可分散液劑登記工作，它們在柑橘上的應用將更為廣泛。

農(nóng)副產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留問題日漸成為危害公眾安全與健康的重要問題之一[8]。已有研究表明，啶蟲脒亞致死劑量對小鼠的肝臟和腎臟具有毒性風險[9]，長期環(huán)境或偶然接觸啶蟲脒會改變大鼠肝臟組織的血液學、生化和結構輪廓，導致小鼠神經(jīng)、肝腎、免疫學、遺傳毒性和生殖效應[10]，過量攝入可導致心動過速、低血壓、呼吸衰竭、低血鉀、低鈣血癥、散瞳、昏迷等[11]。吡丙醚暴露可導致斑馬魚DNA損傷、細胞凋亡、心肌變薄、心包水腫和充血[12]，可誘導人外周血淋巴細胞發(fā)生改變表現(xiàn)出細胞毒性作用，并具有遺傳毒性和致突變性[13]。因此，啶蟲脒與吡丙醚在柑橘上使用后的殘留及膳食風險等食品質(zhì)量安全問題值得關注。

近年來，有關啶蟲脒在農(nóng)作物中的殘留研究涉及芹菜、草莓、葡萄、甘藍和水稻等[14-18]，殘留檢測方法有液相色譜[18]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]、表面增強拉曼光譜技術[19]和電化學法[20]等；吡丙醚涉及茶葉、番茄、辣椒和花椒等作物[21-23]，殘留檢測方法有高效液相色譜法[24]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]和分光光度法[25]等。目前，僅有少量啶蟲脒和吡丙醚在柑橘上殘留的研究報道[26-27]，而啶蟲脒與吡丙醚復配使用在柑橘中的殘留和消解動態(tài)還不明確。因此，研究它們在柑橘中使用后的殘留行為和殘留情況，評估膳食攝入風險，對于保證柑橘的生產(chǎn)和食品安全意義重大。

本實驗采用QuEChERS方法凈化技術結合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測柑橘中的啶蟲脒與吡丙醚，在13 個柑橘主產(chǎn)區(qū)開展規(guī)范殘留實驗，獲得柑橘樣品中的啶蟲脒與吡丙醚的殘留消解動態(tài)和最終殘留量，以此為基礎評估啶蟲脒與吡丙醚的膳食暴露風險，以期為啶蟲脒與吡丙醚在柑橘上的科學合理使用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啶蟲脒（純度99.2%）、吡丙醚（純度99.4%）標準品 北京勤誠亦信科技開發(fā)有限公司；27%（310 g/L）啶蟲脒-吡丙醚可分散液劑 安道麥（北京）農(nóng)業(yè)技術有限公司；乙腈（分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰乙酸（分析純）天津市光復科技發(fā)展有限公司；乙腈（色譜純）德國默克股份兩合公司；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純）天津科密歐化學試劑有限公司；甲酸（色譜純）賽默飛世爾科技（中國）有限公司；N-丙基乙二胺、石墨化碳、0.22 μm有機濾膜 天津博納艾杰爾科技有限公司；水為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

TSQ-VANTAGE型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、Syncronis C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.1 μm）美國ThermoFisher Scientific公司；KQ-800E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；WBL2510A型攪拌機 廣東美的生活電器制造有限公司；TG16型臺式高速離 心機 長沙邁佳森離儀器設備有限公司；TG16-11型臺式高速離心機 湖南平凡科技有限公司；CK2000型高通量組織研磨器 北京托摩根生物科技有限公司；SK-1型漩渦混合器 江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HGC-24A型干式加熱氮吹儀 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；BSA224S-CW型電子分析天平 德國Sartorius公司；TD5002C型電子天平 天津天馬衡基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 田間實驗

根據(jù)NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》[28]的要求進行，在湖南衡陽、湖南長沙、湖北宜昌、湖北武漢、云南玉溪、廣西南寧、廣東廣州、重慶北碚區(qū)、福建永泰、浙江義烏、貴州都勻、貴州貴陽和海南瓊中13 個柑橘主產(chǎn)區(qū)進行消解動態(tài)實驗和最終殘留實驗。在柑橘葉面均勻噴霧施用27%（310 g/L）啶蟲脒-吡丙醚可分散液劑，首次施藥為柑橘收獲前21 d，施藥2 次；間隔7 d，施藥劑量為500 g/hm2（2000 倍液）。另設清水空白對照區(qū)。于末次施藥后第7、10天采集最終殘留實驗樣品。選取貴州貴陽、貴州都勻、湖北武漢、重慶北碚和湖南長沙5 地開展消解動態(tài)實驗，分別于末次施藥后2 h、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d隨機采集試驗區(qū)消解動態(tài)實驗樣品。

樣品采集、制備、貯存等均按照NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》[28]的要求進行。采用隨機的方法在試驗區(qū)內(nèi)從不少于4 棵樹上采集不少于2 kg（不少于12 個柑橘）樣品2 份，帶回實驗室及時處理。樣品預處理：柑橘果肉樣品需除去果皮和果梗后，取不相鄰果瓣充分混勻；柑橘全果樣品需除去果梗后，切成1～2 cm碎塊并混勻，四分法縮分保留300～400 g，于冰柜內(nèi)-20 ℃低溫保存，待用。

1.3.2 殘留量檢測分析

1.3.2.1 樣品提取與凈化

準確稱取5.0 g粉碎勻質(zhì)樣品（柑橘果肉/全果）于50 mL離心管中，加入25 mL含有1%冰乙酸的乙腈（V/V），1000 次/min振蕩提取10 min，加入3 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂，1000 次/min振蕩提取5 min，5000 r/min 離心5 min。取1.5 mL上清液于裝有150 mg無水硫酸鎂、100 mgN-丙基乙二胺和20 mg石墨化碳的2.5 mL離心管中，渦旋30 s，5000 r/min離心5 min，取0.75 mL上清液加入0.75 mL蒸餾水，混勻后過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.2.2 儀器條件

色譜條件：Syncronis C18色譜柱（100 mm× 2.1 mm，2.1 μm）；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；流動相為0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），流速0.25 mL/min。梯度洗脫程序：0.0～0.8 min，75% A、25% B；0.8～1.0 min，75%～3%A、25%～97% B；1.0～4.0 min，3% A、97% B；4.0～4.5 min，3%～75%A、97%～25% B；4.5～6.0 min，75%A、25% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子模式；霧化氣為氮氣；鞘氣流速9.0 L/min，輔助氣流速3.0 L/min；噴霧電壓3000 V；毛細管溫度330 ℃；離子傳輸管溫度330 ℃。啶蟲脒定性離子對：m/z222.6/89.7，碰撞能量31 eV；定量離子對：m/z222.6/125.6，碰撞能量19 eV，透鏡電壓60 V。吡丙醚定性離子對：m/z321.6/95.6，碰撞能量22 eV；定量離子對：m/z321.6/184.5，碰撞能量15 eV，透鏡電壓58 V。

1.3.2.3 標準溶液配制、標準曲線繪制與基質(zhì)效應

標準溶液配制：分別準確稱取標準品啶蟲脒（0.0101±0.0001）g和吡丙醚（0.0101±0.0001）g，用乙腈分別溶解并定容至10 mL得到2 種農(nóng)藥的1000 mg/L 單標儲備液；-18 ℃密封保存?zhèn)溆?。分別移取一定量的上述標準儲備液制成25 mg/L混合標準儲備液，-18 ℃密封保存?zhèn)溆?。實驗中，臨用前根據(jù)需要逐級稀釋為不同質(zhì)量濃度的混合標準工作液。

標準曲線繪制：取空白樣品，經(jīng)前處理得到柑橘全果、果肉空白基質(zhì)，用柑橘全果、果肉空白基質(zhì)稀釋混合標準儲備液分別配制0.001、0.005、0.01、0.1、0.25、0.5 mg/L系列基質(zhì)標準溶液，溶劑標準曲線選用乙腈溶液稀釋，其余步驟同空白基質(zhì)標準曲線的配制。

基質(zhì)效應：采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測定時，樣品中的內(nèi)源或外源性物質(zhì)會影響分析物的離子化或去溶劑化過程，使目標物的質(zhì)譜響應增加或降低，從而產(chǎn)生基質(zhì)效應[29]，會對分析準確性產(chǎn)生影響。參考An Xiaokang等[30]的方法進行基質(zhì)效應評價，按下式計算：

式中：Sm為基質(zhì)匹配標準曲線的斜率；Ss為溶劑標準曲線的斜率。|基質(zhì)效應|＜20%為弱基質(zhì)效應，可以忽略；20%≤|基質(zhì)效應|≤50%為中等基質(zhì)效應；|基質(zhì)效應|＞50% 是強基質(zhì)效應。|基質(zhì)效應|≥20%需采用基質(zhì)標準曲線進行補償[31]。

1.3.2.4 添加回收實驗

GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[32]規(guī)定柑橘中啶蟲脒最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）為0.5 mg/kg、吡丙醚為2.0 mg/kg。設定0.01、0.5、2.5 mg/kg 3 個添加濃度在柑橘全果、果肉空白樣品中開展添加回收率實驗，每個濃度重復5 次，計算回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.3 膳食攝入風險評估

急性膳食暴露風險是基于一餐或1 d內(nèi)的膳食暴露量，當其農(nóng)藥殘留量超過一定水平時可能導致的健康風險[33]。采用國際短期膳食攝入量（international estimation of short-term dietary intake，IESTI）和急性膳食暴露風險（用ARfD表示）按下式計算啶蟲脒和吡丙醚在柑橘中的急性膳食攝入風險（acute risk quotient，RQ）值[34]：

式中：LP為大份餐（kg/d），即某類食品一餐的最大消費量，一般以日消費量的97.5百分位點值為準，數(shù)據(jù)來自世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)庫[35]；bw為消費者平均 體質(zhì)量/kg，數(shù)據(jù)來自國家體育總局[36]；HR為最高殘留量/（mg/kg）；ARfD為急性毒性參考劑量，啶蟲脒為0.025 mg/kg、吡丙醚為1.0 mg/kg[37]。

慢性膳食暴露風險是基于整個生命周期的膳食暴露量，某種農(nóng)藥殘留量超過一定水平而可能造成的健康風險[33,38]。綜合農(nóng)藥在食品中的含量水平、不同亞人群或個人的潛在暴露等因素，計算在居民膳食中目標化合物的暴露量，可得到精準的膳食暴露風險評估結果[33]。以國家估算每日攝入量（national estimated daily intake，NEDI）和慢性膳食暴露風險（用ADI表示），按下式計算啶蟲脒和吡丙醚在柑橘中的慢性膳食攝入風險（%ADI）值[27]：

式中：STMR 為農(nóng)產(chǎn)品的規(guī)范實驗殘留均值/（mg/kg）；F為農(nóng)產(chǎn)品的消費量/（kg/d），數(shù)據(jù)來自《中國居民營養(yǎng)和健康狀況調(diào)查報告》[39]；bw為消費者平均體質(zhì)量/kg；ADI為每日允許攝入量，啶蟲脒為0.025 mg/kg、吡丙醚為0.5 mg/kg[37]。

RQ和%ADI值越大表示風險越大，當RQ和%ADI＞100%時，表示風險為不可接受水平；RQ和%ADI≤100%時，則表示風險為可接受水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

殘留檢測數(shù)據(jù)的采集與處理采用Themo LCquan軟件。繪圖采用OriginPro 2021軟件。參考世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)處理指南[40]，對于樣品中殘留量低于定量限（limit of quantitation，LOQ）的數(shù)值，以1/2 LOQ進行作圖和計算風險。

2 結果與分析

2.1 方法的線性關系與基質(zhì)效應

如表1所示，在0.001～0.5 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，啶蟲脒和吡丙醚在溶劑、柑橘全果、柑橘果肉中的質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關系，決定系數(shù)（R2）大于0.99。吡丙醚在柑橘果肉中基質(zhì)效應為-6.5%，表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應，可以忽略。啶蟲脒在柑橘全果、柑橘果肉中的基質(zhì)效應分別為-33.3%和-21.0%，吡丙醚在柑橘全果中的基質(zhì)效應為-34.7%，均表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應，需采用基質(zhì)標準曲線補償基質(zhì)效應帶來的影響。因此，為最大程度保證分析的準確性，在樣品檢測分析中采用基質(zhì)匹配標準溶液曲線定量分析。

表1 啶蟲脒和吡丙醚在不同基質(zhì)中的線性方程、R2及基質(zhì)效應Table 1 Calibration equations,correlation coefficients R2 and matrix effects for acetamiprid and pyriproxyfen in different matrices

2.2 方法的準確度與LOQ

在空白柑橘全果和果肉中添加啶蟲脒和吡丙醚混合標準溶液，如表2所示，在0.01、0.5、2.5 mg/kg添加水平下，啶蟲脒在柑橘全果和果肉中的添加回收率為83.0%～91.4%和96.2%～104.3%，RSD為5.1%～10.0%和3.8%～6.9%；吡丙醚添加回收率為74.8%～78.3%和90.5%～98.7%，RSD為2.0%～3.3%和2.2%～6.0%，均滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。采用歐盟規(guī)定的以最低添加量作為LOQ[41]，啶蟲脒和吡丙醚在柑橘全果和果肉基質(zhì)中的LOQ均為0.01 mg/kg。

表2 啶蟲脒與吡丙醚在柑橘中的平均添加回收率和RSD（n＝5）Table 2 Average recoveries and RSDs of acetamiprid and pyriproxyfen in citrus (n =5)

2.3 啶蟲脒和吡丙醚在柑橘中的消解動態(tài)

由圖1可知，啶蟲脒和吡丙醚在柑橘上的殘留量隨著時間的推移，整體呈逐漸減少趨勢。啶蟲脒和吡丙醚在貴州貴陽、貴州都勻、湖北武漢、重慶北碚和湖南長沙5 地柑橘全果中的消解動態(tài)符合一級動力學方程。柑橘中啶蟲脒降解半衰期為5.1～15.8 d，吡丙醚在柑橘全果中的殘留降解半衰期為4.5～21.2 d，與已有報道結果 一致[26-27]。啶蟲脒和吡丙醚在柑橘上消解較快，屬于易降解農(nóng)藥（半衰期＜30 d）。

圖1 啶蟲脒（A）和吡丙醚（B）在柑橘中的消解動態(tài)Fig.1 Degradation curves of acetamiprid (A) and pyriproxyfen (B) in citrus fruit

2.4 啶蟲脒與吡丙醚在柑橘中的最終殘留

最終殘留結果顯示（圖2），27%啶蟲脒-吡丙醚可分散液劑施藥劑量為500 g/hm2（2000 倍液），末次施藥7 d后啶蟲脒和吡丙醚在柑橘全果中殘留量分別為0.02～0.45 mg/kg和0.03～0.68 mg/kg之間，在果肉中分別為0.01（低于定量限）～0.20 mg/kg 和0.01（低于定量限）～0.17 mg/kg。GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[32]規(guī)定啶蟲脒在柑橘中的MRL值為0.5 mg/kg，吡丙醚為2.0 mg/kg[32]，末次施藥7 d后，全部樣品中啶蟲脒和吡丙醚殘留量均低于我國MRL值。表明以上述方式施藥，安全間隔期為7 d，收獲的柑橘符合我國國家標準[32]。

圖2 啶蟲脒（A）與吡丙醚（B）13 個試驗點柑橘樣品中的最終殘留量Fig.2 Terminal residues of acetamiprid (A) and pyriproxyfen (B) in citrus samples from 13 sampling sites

2.5 膳食攝入風險評估

2.5.1 急性膳食暴露風險評估

研究針對柑橘整個果實和去皮后果肉中農(nóng)藥殘留狀況，分別評估不同人群的急性膳食暴露風險，如表3所示。采收間隔為7 d和10 d時，啶蟲脒在柑橘全果中的RQ值為13.9%～53.0%和12.3%～47.1%，果肉中的RQ值為6.2%～23.6%和5.2%～20.0%，急性膳食暴露風險均為可接受水平；采收間隔為7 d和10 d時吡丙醚在柑橘全果中的RQ值為0.5%～2.0%和0.4%～1.6%，吡丙醚在果肉中的RQ值均不大于0.1%，急性膳食暴露風險均為可接受水平。Li Yanjie等[42]認為引入加工因子使得風險評估結果更切合實際，從風險評估結果可看出，柑橘去皮能夠顯著降低農(nóng)藥殘留膳食風險[43]。急性膳食暴露風險隨著采樣間隔時間的延長而降低，不同年齡段、性別人群的膳食攝入風險存在差異，兒童青少年人群的風險高于其他人群，值得關注。啶蟲脒和吡丙醚在柑橘中殘留量相差不大，而造成膳食攝入風險差距較大，農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留風險水平跟殘留量與農(nóng)藥自身的毒理學特性都有密切關系[44]。

表3 柑橘中啶蟲脒與吡丙醚的急性膳食暴露評估結果Table 3 Short-term dietary exposure risk assessment of acetamiprid and pyriproxyfen in citrus fruit

2.5.2 慢性膳食暴露風險評估

柑橘中啶蟲脒和吡丙醚對不同年齡段人群的慢性膳食暴露風險評估結果如表4所示。距末次施藥后7 d，全果中啶蟲脒和吡丙醚%ADI值為0.3%～1.7%和0.2%～1.1%，10 d為0.3%～1.7%和0.2%～1.0%，風險為可接受水平；藥后7 d和10 d啶蟲脒果肉中的%ADI值為0.1%～0.4%和0.1%～0.5%，吡丙醚在果肉中風險均不大于0.1%，慢性膳食暴露風險均為可接受水平。對3～69 歲人群，啶蟲脒和吡丙醚在柑橘中的慢性膳食暴露風險均為小于100%，為可接受風險。與急性膳食暴露風險評估結果相似，不同年齡段、性別人群通過膳食攝入的風險存在差異。

表4 不同人年齡段人群慢性膳食暴露風險評估結果Table 4 Long-term dietary exposure risk assessment of acetamiprid and pyriproxyfen in citrus fruit

3 結論

研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定了13 個柑橘主產(chǎn)區(qū)域柑橘中的啶蟲脒和吡丙醚的消解動態(tài)及最終殘留量。柑橘樣品以1%冰乙酸-乙腈提取，N-丙基乙二胺和石墨化碳凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，方法準確度、精密度均符合殘留檢測分析的要求。27%（310 g/L）啶蟲脒-吡丙醚可分散液劑以500 g/hm2（2000 倍液）劑量在柑橘上施藥2 次，間隔7 d，啶蟲脒在柑橘中的消解半衰期為5.1～15.8 d；吡丙醚在柑橘中的消解半衰期為4.5～21.2 d。啶蟲脒和吡丙醚在柑橘全果中的收獲期殘留量隨間隔時間的延長而減少。末次施藥7 d采集的柑橘中的啶蟲脒和吡丙醚的殘留量分別小于0.45 mg/kg和0.68 mg/kg，均低于我國MRL值[32]。

膳食風險評估結果顯示，收獲期柑橘中啶蟲脒和吡丙醚殘留對我國不同年齡段人群的急性膳食暴露風險分別為5.2%～53.0%和0.0%～2.0%，慢性膳食暴露風險評估結果為0.1%～1.7%和0.0%～1.1%，風險均小于100%，不會對我國人群健康產(chǎn)生不可接受的風險。

研究結果表明，27%（310 g/L）啶蟲脒-吡丙醚可分散液劑在柑橘上以500 g/hm2（2000 倍液）施用2 次，間隔7 d，收獲期殘留量符合我國標準，從膳食攝入風險的角度安全。研究豐富了兩種農(nóng)藥在果樹上的消解動態(tài)和最終殘留數(shù)據(jù)，并提供了膳食暴露風險評估結果，對啶蟲脒和吡丙醚在柑橘樹上的科學合理使用具有一定意義與參考價值。