楊艷歌，王迎春，劉鳴暢，牛 娜，黃文勝，吳占文，王 帥，康 婕，吳亞君,

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.深圳海關(guān)食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045；3.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710048）

蜂蜜一直以抗菌、修復(fù)、調(diào)養(yǎng)而聞名于世，體外研究和局部使用均已證明蜂蜜對(duì)許多病原微生物具有抗菌修復(fù)作用，這種抗菌活性是滲透（吸水）、酸度、過(guò)氧化氫和植物化學(xué)因子（如多酚）等作用的結(jié)果[1-4]。少數(shù)蜂蜜品種體外抗菌活性高于過(guò)氧化氫的存在，這種活性不依賴(lài)于蜂蜜中的過(guò)氧化氫，被稱(chēng)為非過(guò)氧化氫抗菌活性（non-peroxide antibacterial activity，NPA）[5-7]。由新西蘭麥盧卡樹(shù)（Leptospermum scoparium）產(chǎn)生的一種單花蜜——麥盧卡蜂蜜就是這類(lèi)蜂蜜中最突出的一種，這是由于其花蜜中存在二羥基丙酮（dihydroxyacetone，DHA），可通過(guò)非酶脫水形成了殺菌劑甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）的緣故[8-11]。另外，有研究證實(shí)麥盧卡蜂蜜還具有抗氧化[12-13]、抗腫瘤以及抑制腫瘤細(xì)胞增殖[14-15]、幫助傷口愈合[16]和消炎[17-18]等特性。因此麥盧卡蜂蜜被認(rèn)為具有較高藥用價(jià)值而被喻為新西蘭的“國(guó)寶”，并在全世界范圍內(nèi)受到追捧[19]，這也導(dǎo)致其售價(jià)遠(yuǎn)高于其他蜂蜜，并且還在不斷攀升，已成為蜂蜜中的奢侈品[20-21]。一些不法分子為謀取暴利，將麥盧卡蜂蜜摻假摻雜卡奴卡或其他蜂蜜，作為單一麥盧卡蜂蜜進(jìn)行交易[22]。并且據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，新西蘭每年生產(chǎn)約1700 t麥盧卡蜂蜜，然而全球每年的消費(fèi)量約為1萬(wàn) t[23]，也就是全世界銷(xiāo)售的麥盧卡蜂蜜遠(yuǎn)超過(guò)新西蘭蜂蜜的產(chǎn)量，因此其真實(shí)性也受到全社會(huì)的關(guān)注[24]。

通過(guò)花粉、風(fēng)味和顏色分析和/或通過(guò)電導(dǎo)率測(cè)量等傳統(tǒng)的蜂蜜純度測(cè)定方法不適用于麥盧卡蜂蜜的真實(shí)性鑒別[25]，因?yàn)橥ㄟ^(guò)顯微鏡觀察同時(shí)收獲的麥盧卡和卡奴卡花粉粒，發(fā)現(xiàn)外觀幾乎相同[26]，因此無(wú)法通過(guò)花粉分析區(qū)分這兩個(gè)品種。然而麥盧卡蜂蜜和卡奴卡蜂蜜的花期相似，在田間也很難區(qū)分，而卡奴卡峰蜜既不含DHA[27]也不含MGO[28]，也幾乎不顯示非過(guò)氧化物活性[29]。因此，檢測(cè)麥盧卡蜂蜜中是否含有卡奴卡成分對(duì)于確定其純度非常重要。以往通過(guò)檢測(cè)特征標(biāo)志物MGO鑒別麥盧卡蜂蜜，以及依賴(lài)于MGO的含量對(duì)麥盧卡蜂蜜認(rèn)證定級(jí)的方法也不可行[30]，因?yàn)橐环矫嬖旒僬呖梢酝ㄟ^(guò)直接添加MGO或其前體DHA到卡奴卡蜂蜜中進(jìn)行摻偽而升級(jí)為“麥盧卡”蜂蜜[31]，另一方面DHA在長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存和加熱過(guò)程中會(huì)被非酶轉(zhuǎn)化為MGO，而導(dǎo)致MGO增加[17,32]。為此，新西蘭農(nóng)業(yè)部（Ministry for Primary Industries，MPI）在2014年發(fā)起了“麥盧卡蜂蜜科學(xué)計(jì)劃”項(xiàng)目[25]，并確定了用4 種化學(xué)物和一個(gè)DNA標(biāo)記物5 種屬性綜合判別的方式，以區(qū)分麥盧卡蜂蜜和非麥盧卡蜂蜜、單花麥盧卡蜂蜜以及多花麥盧卡蜂蜜[33-34]。然而該規(guī)定的檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，并且其DNA標(biāo)記物方法未公開(kāi)檢測(cè)的引物探針序列，每此實(shí)驗(yàn)需要采購(gòu)其規(guī)定的DNA提取試劑盒和實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）檢測(cè)試劑盒，因此開(kāi)發(fā)廉價(jià)、快速的麥盧卡蜂蜜鑒定方法具有重要意義[35]。

此外，MPI規(guī)定的DNA標(biāo)記物方法是對(duì)蜂蜜花粉沉淀提取DNA進(jìn)行檢測(cè)，事實(shí)上以往基于DNA區(qū)分蜂蜜物種來(lái)源的方法一般都是對(duì)蜂蜜的花粉沉淀進(jìn)行DNA提取[36-37]。這是由于研究者一般認(rèn)為蜂蜜本身不含植物DNA，提取蜂蜜的DNA實(shí)際上是蜜蜂采蜜過(guò)程中帶入的花粉粒DNA[38]。但僅進(jìn)行此檢測(cè)很難區(qū)分造假者有意將蜂花粉摻入糖漿造假蜂蜜的方式。因此Wu Yajun等[39]建議在對(duì)蜂蜜進(jìn)行植物源分辨時(shí)，建議增加蜂蜜上清液的DNA提取方法，從而進(jìn)行更加客觀的判斷。

為此本研究開(kāi)展了以下實(shí)驗(yàn)：1）比較市場(chǎng)常見(jiàn)的試劑盒、傳統(tǒng)CTAB法以及MPI指定的DNA提取試劑盒對(duì)麥盧卡蜂蜜花粉沉淀的DNA提取效果；2）建立麥盧卡蜂蜜上清液DNA提取方法，以彌補(bǔ)以往研究?jī)H對(duì)麥盧卡蜂蜜花粉沉淀進(jìn)行鑒別的不足；3）建立植物內(nèi)參照、麥盧卡、卡奴卡3 種物種源性成分鑒別的real-time PCR方法，分析方法的特異性、靈敏度與檢出限；4）比較本研究與MPI規(guī)定的方法對(duì)蜂蜜樣品的檢測(cè)效果。通過(guò)以上4 個(gè)方面的研究，建立了高效提取麥盧卡蜂蜜沉淀和上清液DNA的方法；提供了可快速、靈敏、準(zhǔn)確鑒別麥盧卡蜂蜜植物源性成分的方法；并通過(guò)對(duì)比，證實(shí)了建立方法的可行性、準(zhǔn)確性與等效性，以期為快速檢測(cè)麥盧卡蜂蜜的真?zhèn)翁峁┘夹g(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

油菜花粉、柳樹(shù)花粉、獼猴桃花粉、蕎麥花粉、荷花花粉、茶花花粉、玫瑰花粉、虞美人花粉由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所提供；洋槐、紫云英、枸杞、荊條、荔枝、龍眼、巨桉、棗、椴樹(shù)、向日葵、棉花、蘋(píng)果、橘、芝麻、黃瓜、小麥、桑、蠶豆、冬青、木蘭、橄欖、桂花、國(guó)槐、甘薯、郁金香、芒果、葡萄、草莓、薰衣草、百合、菊花、杜鵑、水仙、番茄、銀杏、松、綠藻樣品為本實(shí)驗(yàn)室收集；麥盧卡蜂蜜及卡奴卡蜂蜜樣品為MPI提供。

1.1.2 試劑

Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒 中國(guó)臺(tái)灣Geneaid技術(shù)有限公司；NucleoSpin?Food 德國(guó)Macherey-Nagel公司；植物基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Promega Wizard? Magnetic食品DNA純化系統(tǒng) 美國(guó)Promega公司；ManKanTM蜂蜜real-time PCR試劑盒、ManKan? DNA標(biāo)準(zhǔn)品、ManKan?蜂蜜陽(yáng)性質(zhì)控 新西蘭dnature診斷研究有限公司；TaqMan Fast Advanced Master Mix 美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.1.3 引物探針

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索獲得麥盧卡、卡奴卡以及其他常見(jiàn)蜂蜜植物物種的NADH和ITS基因序列。利用Clustal X軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用Primer Premier 5.0軟件在NADH保守區(qū)域設(shè)計(jì)內(nèi)參照（顯花植物通用）引物探針，在ITS種間差異區(qū)域分別設(shè)計(jì)麥盧卡和卡奴卡的特異性引物探針。篩選好的引物和探針信息如表1所示，所有引物探針均在上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

表1 麥盧卡蜂蜜植物源檢測(cè)引物探針信息Table 1 Primers used for the identification of plant-derived ingredients in mānuka honey

1.2 儀器與設(shè)備

7500 real-time PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems 公司；Pico17離心機(jī)（離心力≥12000×g）美國(guó)Thermo公司；TissueLyser II組織研磨儀 德國(guó)QIAGEN 公司；核酸蛋白分析儀 日本島津公司；渦旋儀 德國(guó) IKA公司；恒溫混勻儀、微量移液器 德國(guó)Eppendorf 公司；離心管、八連排PCR管 美國(guó)Axygen公司；電子天平 德國(guó)Sartorius公司；恒溫水浴鍋 北京六一生物科技有限公司；磁力架 美國(guó)Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

按照MPI[34]的步驟對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行處理，部分步驟稍作改良。將蜂蜜樣品50 ℃水浴10 min左右至充分融化，上下顛倒混勻；統(tǒng)一稱(chēng)取1.4 g蜂蜜樣品于2 mL離心管中，加入900 μL無(wú)菌ddH2O，65 ℃、1200 r/min振蕩孵育10 min；15000×g離心5 min，上清液于4 ℃貯存；沉淀部分用1 mL無(wú)菌水洗脫，15000×g離心5 min，并重復(fù)洗脫一次。

花粉樣品采用組織研磨機(jī)研磨1 min；水果樣品直接粉碎，10000×g離心，取沉淀物部分；其他根莖葉類(lèi)植物樣品液氮速凍采用組織研磨機(jī)粉碎。

1.3.2 DNA提取

1.3.2.1 蜂蜜沉淀DNA提取

分別用NucleoSpin食品基因組DNA提取試劑盒、天根植物基因組DNA提取試劑盒、傳統(tǒng)的CTAB法，以及MPI推薦的Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒，進(jìn)行蜂蜜沉淀DNA提取效果比較。Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒的操作步驟按照MPI的文件[34]操作，NucleoSpin食品基因組DNA提取試劑盒、天根植物基因組DNA提取試劑盒、CTAB法統(tǒng)一加入650 μL提取緩沖液，以及10 μL 10 mg/mL蛋白酶K溶液。統(tǒng)一置于65 ℃、800 r/min 恒溫混勻儀中溫育1～2 h，15000×g離心5 min，轉(zhuǎn)移上層清液至50 mL離心管中。CTAB法其余步驟按照 GB/T 19495.3—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法》CTAB-2方法操作[40]，NucleoSpin食品基因組DNA提取試劑盒、天根植物基因組DNA提取試劑盒其余步驟按照各說(shuō)明書(shū)操作，獲取的DNA統(tǒng)一用50 μL無(wú)菌ddH2O溶解。分別用本研究建立的植物內(nèi)參照方法和ManKan蜂蜜real-time PCR試劑盒方法進(jìn)行檢測(cè)，以ManKanTM蜂蜜質(zhì)控DNA為陽(yáng)性，每份DNA重復(fù)擴(kuò)增3 次，比較上述4 種DNA提取方法的擴(kuò)增效率，-20 ℃保存DNA。

1.3.2.2 蜂蜜上清液DNA提取

取20 mL蜂蜜上清液分裝到2 個(gè)50 mL離心管中，每管分別加入裂解液A 4 mL、裂解液B 2 mL，充分混勻，靜置10 min。加入5 mL沉淀溶液，振蕩混勻。加入150 μL磁珠和0.9 倍溶液體積的異丙醇，室溫靜置1 h，期間不時(shí)顛倒，置磁力架上5 min，小心去除水相，其余步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，DNA用50 μL無(wú)菌ddH2O溶解。用ManKan蜂蜜real-time PCR試劑盒進(jìn)行DNA擴(kuò)增效果比較，每份DNA重復(fù)擴(kuò)增3 次，以無(wú)菌ddH2O為空白對(duì)照，-20 ℃保存DNA。

1.3.2.3 其他植物樣品DNA提取

除蜂蜜外的其他植物樣品取100～500 mg，均采用Nucleospin食品基因組DNA提取試劑盒提取DNA，用核酸蛋白定量?jī)x測(cè)量DNA濃度，-20 ℃保存DNA。

1.3.3 real-time PCR

本研究建立的方法采用25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)：12.5 μLTaqMan Fast Advanced Master Mix，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10 μmol/L探針0.5 μL，模板DNA 5 μL，用無(wú)菌水補(bǔ)至總體積25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃去除RNA 2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40 個(gè)循環(huán)。熒光基團(tuán)設(shè)為FAM，猝滅基團(tuán)設(shè)為none，閾值為儀器自動(dòng)生成。

MPI方法采用其規(guī)定ManKan蜂蜜real-time PCR試劑盒[34]進(jìn)行檢測(cè)，采用10 μL反應(yīng)體系：20×Oligo mix 0.5 μL，5×Master mix 2 μL，PCR級(jí)別水5.5 μL，模板DNA 2 μL。在real-time PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；96 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)，ROX基底熒光校正設(shè)為none，內(nèi)參照、卡奴卡和麥盧卡檢測(cè)熒光分別設(shè)為ROX、VIC和FAM。

1.3.4 引物探針通用性和特異性檢測(cè)

以47 種植物的DNA（5 ng/μL）進(jìn)行檢測(cè)，其中45 種為顯花植物：麥盧卡、卡奴卡、油菜、柳樹(shù)、獼猴桃、蕎麥、荷花、茶花、玫瑰、虞美人、洋槐、紫云英、枸杞、荊條、荔枝、龍眼、巨桉、棗、椴樹(shù)、向日葵、棉花、蘋(píng)果、橘、芝麻、黃瓜、小麥、桑、蠶豆、冬青、木蘭、橄欖、桂花、國(guó)槐、甘薯、郁金香、芒果、葡萄、草莓、薰衣草、百合、菊花、杜鵑、水仙、番茄，3 種為非顯花植物：銀杏、松和綠藻，以無(wú)菌水為空白對(duì)照，進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品2 個(gè)平行重復(fù)。

1.3.5 絕對(duì)靈敏度分析

分別將麥盧卡和卡奴卡DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)蛊滟|(zhì)量濃度分別為100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL，共6 個(gè)梯度，用篩選好的特異性引物探針進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3 個(gè)平行，標(biāo)準(zhǔn)曲線由儀器自動(dòng)生成。

1.3.6 檢出限分析

將卡奴卡蜂蜜和麥盧卡蜂蜜互摻，分別按照含量比為0.1∶99.9、1∶99、10∶90、50∶50模擬制備混合摻雜蜂蜜樣品，混勻后分別提取混合蜂蜜樣品上清液和沉淀的DNA，分別以卡奴卡蜂蜜和麥盧卡蜂蜜DNA為陽(yáng)性，以ddH2O為空白對(duì)照，進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增檢出限分析，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3 個(gè)平行。

1.3.7 蜂蜜樣品檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

對(duì)MPI提供的15 份蜂蜜樣品分別采用MPI指定的Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒和NucleoSpin食品基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行蜂蜜沉淀的DNA提取，同時(shí)采用Promega Wizard? Magnetic食品DNA純化系統(tǒng)對(duì)蜂蜜上清液進(jìn)行DNA提取。采用本研究建立的植物內(nèi)參照、麥盧卡、卡奴卡物種源性成分real-time PCR檢測(cè)方法，以及MPI指定的real-time PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了檢測(cè)，以ddH2O為空白對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3 個(gè)平行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

將儀器導(dǎo)出檢測(cè)數(shù)據(jù)錄入在Excel表格中，在Excel中計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制三線表和柱形圖，柱形圖用不同圖案填充，以重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差添加誤差線。擴(kuò)增圖譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線儀器由儀器自動(dòng)生成并導(dǎo)出。

2 結(jié)果與分析

2.1 real-time PCR方法建立

2.1.1 引物探針篩選

為了對(duì)蜂蜜樣品的DNA進(jìn)行質(zhì)量控制，根據(jù)常見(jiàn)的蜂蜜為顯花植物的特性，設(shè)計(jì)顯花植物通用引物探針，對(duì)48 種植物進(jìn)行real-time PCR通用性檢測(cè)，結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)的ndhB基因顯花植物引物探針可以對(duì)45 種顯花植物擴(kuò)增，擴(kuò)增Ct值在14～28之間，表明通用性和覆蓋性較好；銀杏、松和綠藻無(wú)擴(kuò)增，表明對(duì)裸子植物和原始植物特異性較好，故依此引物探針作為內(nèi)參照進(jìn)行蜂蜜樣品DNA提取效果的質(zhì)控檢測(cè)，結(jié)果如圖1A所示。

圖1 引物探針通用性和特異性分析Fig.1 Generality and specificity of primers and probes

以上述47 種植物為檢測(cè)對(duì)象，分別對(duì)設(shè)計(jì)的麥盧卡和卡奴卡引物探針進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示這兩組引物探針?lè)謩e僅能對(duì)麥盧卡（圖1B）和卡奴卡（圖1C）進(jìn)行有效擴(kuò)增，Ct值分別為18.14±0.02和19.41±0.04，二者之間無(wú)交叉擴(kuò)增，其他植物源成分無(wú)非特異擴(kuò)增，說(shuō)明設(shè)計(jì)的兩組引物探針的特異性較好，可以進(jìn)行蜂蜜樣品中麥盧卡和卡奴卡成分的檢測(cè)。

2.1.2 靈敏度分析

將6 個(gè)質(zhì)量濃度梯度的麥盧卡和卡奴卡DNA進(jìn)行絕對(duì)靈敏度檢測(cè)，結(jié)果顯示6 個(gè)梯度均有明顯的擴(kuò)增，當(dāng)DNA質(zhì)量濃度為1 pg/μL時(shí)，尚有良好的擴(kuò)增，此時(shí)平均Ct值分別為35.66±0.13、37.02±0.42、36.27±0.29，因此初步確定內(nèi)參照、麥盧卡和卡奴卡的絕對(duì)靈敏度均為1 pg/μL，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)儀器自動(dòng)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y內(nèi)參照=-3.315X＋23.662、Y麥盧卡=-3.434X＋25.800、Y卡奴卡=-3.880X＋23.533，內(nèi)參照、麥盧卡和卡奴卡引物探針靈敏度檢測(cè)的擴(kuò)增效率分別達(dá)100.298%、95.507%、81.019%，線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999、0.998和0.995，說(shuō)明線性關(guān)系良好，結(jié)果可信。因此確定本研究設(shè)計(jì)的內(nèi)參照、麥盧卡和卡奴卡引物探針檢測(cè)的絕對(duì)靈敏度最低可達(dá)1 pg/μL。與MPI報(bào)道的檢出限為3 fg/μL，Ct值為36的靈敏度相近。

圖2 方法靈敏度檢測(cè)的擴(kuò)增曲線Fig.2 Sensitivity analysis of the established method

2.2 DNA提取方法

2.2.1 蜂蜜沉淀DNA提取方法比較

高效的DNA提取方法是保證real-time PCR檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的前提。實(shí)驗(yàn)選用3 種提取方法：CTAB法、NucleoSpin食品基因組DNA提取試劑盒、天根植物基因組DNA提取試劑盒以及傳統(tǒng)的CTAB法，與MPI規(guī)定的Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行麥盧卡蜂蜜花粉沉淀DNA提取效果比較。從操作步驟和時(shí)間看，CTAB操作步驟最繁瑣、耗時(shí)最長(zhǎng)，天根、NucleoSpin和Geneaid提取流程相近，步驟較簡(jiǎn)單、耗時(shí)較短，對(duì)4 種方法提取流程的比較如圖3所示。從擴(kuò)增效率看，CTAB擴(kuò)增效果最低，NucleoSpin的擴(kuò)增效果最好，其次是Geneaid，再次是天根，擴(kuò)增效果的比較如圖4所示。綜上，NucleoSpin操作步驟最簡(jiǎn)便，耗時(shí)時(shí)間較短，提取效率較Geneaid高，因此對(duì)麥盧卡蜂蜜的DNA提取不用局限于MPI的規(guī)定，檢測(cè)過(guò)程中選擇滿(mǎn)足需求的DNA提取方法即可。

圖4 不同方法提取的麥盧卡蜂蜜沉淀DNA的擴(kuò)增效果Fig.4 Amplification efficiency of DNA from mānuka honey sediment by different DNA extraction methods

2.2.2 蜂蜜上清液DNA提取

MPI僅規(guī)定了麥盧卡蜂蜜花粉沉淀進(jìn)行DNA提取的方式，但考慮到造假者有可能添加麥盧卡花粉到非麥盧卡蜂蜜進(jìn)行冒充，為對(duì)這種情況進(jìn)行鑒別，本研究又針對(duì)麥盧卡蜂蜜上清液建立了DNA提取方法。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)采用Promega WizardTMMagnetic食品DNA純化系統(tǒng)可對(duì)麥盧卡蜂蜜上清液進(jìn)行DNA提取，并采用該方法對(duì)MPI提供的15 份蜂蜜樣品上清液進(jìn)行DNA提取，并與MPI規(guī)定的Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒的沉淀效果進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)建立的蜂蜜上清液DNA提取方法可以成功將所有蜂蜜DNA提出，可以滿(mǎn)足檢測(cè)要求，但與沉淀的擴(kuò)增效果相比，上清液擴(kuò)增效果略低于沉淀，擴(kuò)增Ct值在24～36之間，沉淀DNA擴(kuò)增Ct值在22～32之間，擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示。

圖5 麥盧卡蜂蜜上清液（A）和沉淀（B）DNA擴(kuò)增效果分析Fig.5 Amplification efficiency of DNA from mānuka honey supernatant (A) and sediment (B)

2.3 蜂蜜實(shí)際檢出限分析

為分析本研究建立的方法對(duì)麥盧卡及卡奴卡蜂蜜檢測(cè)的實(shí)際檢出限，分別提取模擬制備的混合蜂蜜樣品的上清液和沉淀DNA，并進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論上清液還是沉淀，本研究建立的內(nèi)參照、麥盧卡、卡奴卡成分檢出限均可達(dá)0.1%。

圖6 混合麥盧卡蜂蜜檢出限分析Fig.6 Detection limits of mixed mānuka honey

2.4 MPI提供蜂蜜樣品的檢測(cè)結(jié)果比較

采用本研究建立的方法以及MPI規(guī)定的麥盧卡蜂蜜DNA檢測(cè)方法，對(duì)MPI提供的15 份蜂蜜進(jìn)行DNA提取和擴(kuò)增效果比較，詳情見(jiàn)表2。檢測(cè)結(jié)果顯示3 種DNA提取方法均可獲得質(zhì)量良好的DNA，本研究建立的方法以及MPI規(guī)定的麥盧卡蜂蜜DNA檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果一致，包括以下幾種情況：1）3 份檢出卡奴卡成分，其中1 份未檢出麥盧卡成分，另2 份樣品采用MPI方法平均Ct值為33.84±1.20和34.46±2.54，接近于MPI文件要求的Ct≤36.00的檢測(cè)閾值，但其相對(duì)分析誤差（relative percent difference，RPD）分別為5%和14.76%，MPI文件規(guī)定測(cè)試結(jié)果RPD應(yīng)小于5%[22]，因此該結(jié)果應(yīng)判為陰性。采用本研究方法，沉淀和上清液均未檢出麥盧卡，因此這2 份樣品非麥盧卡蜂蜜。2）1 份檢出植物成分，但既未檢出麥盧卡成分也未檢出卡奴卡成分，為其他植物蜂蜜。3）9 份同時(shí)檢出麥盧卡分和卡奴卡成分，為多花麥盧卡蜂蜜。4）2 份檢出麥盧卡分而未檢出卡奴卡，應(yīng)為單花麥盧卡蜂蜜。綜上，這15 份樣品中，13.33%為麥盧卡單花蜜，66.67%為雜花蜜，13.33%為卡奴卡蜂蜜，6.67%為其他植物蜂蜜。

表2 對(duì)MPI提供的蜂蜜樣品的檢測(cè)結(jié)果分析Table 2 Results of MPI detection of honey samples

3 討論

3.1 MPI麥盧卡蜂蜜DNA檢測(cè)方法使用過(guò)程中的問(wèn)題

在參與MPI麥盧卡蜂蜜DNA檢測(cè)方法驗(yàn)證的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)一些問(wèn)題：一是，DNA提取試劑盒和PCR試劑盒均需購(gòu)買(mǎi)推薦廠商的商品，費(fèi)用較昂貴，一個(gè)PCR擴(kuò)增試劑盒報(bào)價(jià)999 美元（不含關(guān)稅等），且這2 個(gè)商品非通用試劑，只能用于麥盧卡蜂蜜檢測(cè)的，因此通常情況下國(guó)內(nèi)沒(méi)有現(xiàn)貨，每次購(gòu)買(mǎi)貨期較長(zhǎng)，影響了檢測(cè)時(shí)效性。二是，未提供內(nèi)參照、麥盧卡、卡奴卡3 種成分檢測(cè)的引物探針序列，每次檢測(cè)都需要購(gòu)買(mǎi)指定的試劑盒，而無(wú)法自行合成，因此在使用的過(guò)程中受到諸多限制。三是，僅對(duì)蜂蜜花粉沉淀進(jìn)行的檢測(cè)，無(wú)法分辨以摻入花粉造假蜂蜜的方式。

3.2 麥盧卡蜂蜜DNA提取方法分析

為此，本研究首先比較常見(jiàn)的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口食品DNA提取試劑盒，以及傳統(tǒng)CTAB法對(duì)麥盧卡蜂蜜的提取效果，并與MPI規(guī)定的Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒的提取效果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示雖然擴(kuò)增效果NucleoSpin食品基因組DNA提取試劑盒＞Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒＞天根植物基因組DNA提取試 劑盒＞CTAB法，但4 種方法都能提出DNA，即在對(duì)麥盧卡蜂蜜檢測(cè)的過(guò)程中并非必須用其指定的或進(jìn)口的試劑盒，國(guó)產(chǎn)試劑盒和傳統(tǒng)CTAB法也可滿(mǎn)足要求，若想獲取高質(zhì)量濃度的DNA，在使用的過(guò)程中可通過(guò)采用增加蜂蜜樣品量，富集花粉沉淀的方法獲取DNA，從而提高檢測(cè)效率。

同時(shí)，本研究對(duì)蜂蜜沉淀進(jìn)行DNA提取的過(guò)程中，還對(duì)部分步驟進(jìn)行改良，即增加了對(duì)花粉沉淀水洗的過(guò)程。這是因?yàn)榛蚪MDNA也是糖，將蜂蜜中富集的沉淀增加水洗的過(guò)程，可以盡可能去除蜂蜜中的糖分，以避免在DNA提取的過(guò)程中造成干擾，從而提高DNA的提取效率。

3.3 蜂蜜上清液DNA提取方法的優(yōu)勢(shì)和不足

此外，為謀取利益，造假者可能將麥盧卡花粉添加到非麥盧卡蜂蜜中以假冒麥盧卡蜂蜜，所以?xún)H僅對(duì)蜂蜜中的花粉沉淀進(jìn)行檢測(cè)尚有不足。為此，本研究還建立了麥盧卡蜂蜜上清液DNA提取方法，并通過(guò)對(duì)15 份蜂蜜樣品的實(shí)際檢測(cè)，證實(shí)本方法可以有效提出蜂蜜上清液DNA。但同時(shí)研究結(jié)果顯示，利用磁珠法提取的蜂蜜上清液的DNA擴(kuò)增效率低于花粉沉淀，推測(cè)原因可能是蜂蜜樣品中含有較多的糖分，會(huì)對(duì)磁珠溶液的分散體系造成影響，從而干擾了磁珠對(duì)DNA的吸附效率。但蜂蜜上清液DNA提取方法的建立彌補(bǔ)了以往蜂蜜蜜源植物成分溯源時(shí)僅對(duì)花粉沉淀進(jìn)行檢測(cè)的不足，從而能夠分辨通過(guò)摻入花粉到糖漿中的造假蜂蜜。

4 結(jié)論

本研究建立了麥盧卡蜂蜜沉淀和上清液DNA提取方法，并建立了內(nèi)參照、麥盧卡和卡奴卡植物源性成分real-time PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，內(nèi)參照引物探針對(duì)顯花植物的通用性、覆蓋性和特異性較好，可作為內(nèi)參照進(jìn)行蜂蜜樣品DNA提取的質(zhì)控檢測(cè)。麥盧卡和卡奴卡成分鑒別方法的特異性良好、靈敏度高，絕對(duì)靈敏度最低可達(dá)1 pg/μL，對(duì)混合樣品的檢出限可達(dá)0.1%。同時(shí)與MPI方法比較，證實(shí)了本研究方法的可行性、準(zhǔn)確性和等效性。本研究建立的方法不僅可以用于麥盧卡蜂蜜的植物源靈敏、快速、高效的檢測(cè)，還能鑒別以麥盧卡花粉造假麥盧卡蜂蜜的方式，同時(shí)還可解決以往對(duì)麥盧卡蜂蜜DNA檢測(cè)需要依賴(lài)MPI官方指定檢測(cè)方法的問(wèn)題，為對(duì)國(guó)境口岸麥盧卡蜂蜜的質(zhì)量監(jiān)控提供了良好的技術(shù)支撐。