陳小舉，張鳳琴

（巢湖學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 巢湖 238000）

在食品、藥品等行業(yè)中，琥珀酸與乳酸及其衍生物有著廣泛應(yīng)用。以琥珀酸與乳酸為前體可以合成具有廣闊應(yīng)用前景的可降解生物材料，因此，市場(chǎng)對(duì)琥珀酸與乳酸的需求旺盛。利用微生物發(fā)酵可再生資源生產(chǎn)琥珀酸與乳酸被認(rèn)為是減少石化資源消耗和減少碳排放的有效手段，也是最具發(fā)展?jié)摿Φ木G色工藝模式之一[1-4]。

鈍齒棒桿菌（Corynebacterium crenatum）是生產(chǎn)精氨酸、谷氨酸等氨基酸的主要菌株之一。鈍齒棒桿菌產(chǎn)氨基酸的發(fā)酵工藝多是有氧液體深層發(fā)酵，且對(duì)溶氧水平有較嚴(yán)格的要求[5]。將鈍齒棒桿菌培養(yǎng)環(huán)境改為無(wú)氧時(shí)，琥珀酸與乳酸是其主要代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，C4途徑是鈍齒棒桿菌厭氧合成琥珀酸的主要途徑，即由磷酸烯醇式丙酮酸至草酰乙酸，然后經(jīng)蘋果酸與富馬酸生成琥珀酸[6]（圖1）。理論上，轉(zhuǎn)化1 mol磷酸烯醇式丙酮酸可以生成1 mol琥珀酸，并需要2 mol還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）。糖酵解途徑（Embden Meyerhof pathway，EMP）是鈍齒棒桿菌代謝葡萄糖的主要途徑，此途徑每生成1 mol磷酸烯醇式丙酮酸僅伴隨生成1 mol NADH，僅能滿足由草酰乙酸至蘋果酸或者由富馬酸至琥珀酸所需的NADH。因此，厭氧發(fā)酵時(shí)，鈍齒棒桿菌將70%左右的葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，而琥珀酸的代謝通量相對(duì)較低，不利于聯(lián)產(chǎn)乳酸與琥珀酸[7-8]。

圖1 鈍齒棒桿菌在厭氧條件下的代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Metabolic network of C.crenatum under anaerobic conditions

如果要提高琥珀酸生成比例，利用代謝調(diào)控增加琥珀酸生產(chǎn)菌胞內(nèi)的H還原力水平是可行的方法。比如，Zheng Pu等[9]利用基因組改組技術(shù)增加Actinobacillus succiniogenes胞內(nèi)NADH通量，將琥珀酸產(chǎn)量提高了73%；Zhou Zhihui等[10]發(fā)現(xiàn)表達(dá)外源pntAB基因可以明顯增加谷氨酸棒桿菌胞內(nèi)的NADH通量與琥珀酸產(chǎn)量。另一提高琥珀酸產(chǎn)量的有效措施是通過添加電子供體、NAD前體物質(zhì)調(diào)控胞內(nèi)NADH/NAD＋值。如姜岷等[11]通過流加還原劑改變發(fā)酵培養(yǎng)基的氧化還原電位水平，實(shí)現(xiàn)了對(duì)A.succinogenes胞內(nèi)NADH代謝的調(diào)控，將琥珀酸生產(chǎn)效率提高了57.3%[11]。

除以上方法外，電刺激發(fā)酵也可用于調(diào)控微生物胞內(nèi)的NADH代謝。電刺激發(fā)酵就是將惰性電極插入微生物培養(yǎng)液中，形成一種電解池系統(tǒng)[12]。當(dāng)施加電流后，在陰極會(huì)產(chǎn)生電子，電子通過傳遞進(jìn)入微生物胞內(nèi)可以提高NADH/NAD＋值[13]。電壓達(dá)到一定值后，陰極還會(huì)發(fā)生還原反應(yīng)而產(chǎn)生氫氣。產(chǎn)生的氫氣可降低胞外氧化還原電位，并作為電子傳遞供體使胞內(nèi)NADH/NAD＋值升高。電刺激發(fā)酵技術(shù)在發(fā)酵產(chǎn)氫、丁醇、丙二醇、琥珀酸等高還原性代謝產(chǎn)物的工藝中得到了初步應(yīng)用。已有研究發(fā)現(xiàn)，低壓、低電流刺激可以提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的能力，其主要原因是微生物胞內(nèi)NADH可用水平的增加[14-15]。與琥珀酸相似，NADH不足也是導(dǎo)致丁醇產(chǎn)量較低的主要原因[16]。He Aiyong等[17]發(fā)現(xiàn)電刺激發(fā)酵可以提高Clostridium beijerinckiiIB4胞內(nèi)的NADH/NAD＋值，并導(dǎo)致丁醇的產(chǎn)量及生產(chǎn)效率分別增加17.4%與60.3%。Zhou Mi等[18]發(fā)現(xiàn)施加電流刺激可以提高甘油對(duì)1,3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率，代謝流分析結(jié)果顯示NADH通量增加是1,3-丙二醇產(chǎn)量升高的主要原因。Wang Zhen等[19]研究結(jié)果表明，對(duì)A.succinogenes發(fā)酵過程施加電流刺激可以將琥珀酸提高22.4%。

電化學(xué)技術(shù)在微生物發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用為發(fā)酵過程控制及微生物代謝調(diào)控提供了新的研究方向[13,20]，但電刺激對(duì)鈍齒棒桿菌厭氧發(fā)酵特性的影響尚不明確，菌株胞內(nèi)哪些節(jié)點(diǎn)的代謝流分布對(duì)電流刺激脅迫產(chǎn)生了應(yīng)激響應(yīng)尚不清楚。且目前為止，此方面的研究甚少。因此，本研究以鈍齒棒桿菌為發(fā)酵菌株，通過改變厭氧發(fā)酵過程中的電流強(qiáng)度對(duì)胞內(nèi)NADH代謝進(jìn)行調(diào)控，以提高琥珀酸產(chǎn)量，并對(duì)不同電流條件下的代謝通量及基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，考察電刺激對(duì)鈍齒棒桿菌代謝流分布的影響，找出可以聯(lián)產(chǎn)乳酸與琥珀酸的電流刺激條件。本研究結(jié)果將有助于在理論方面掌握電流刺激對(duì)鈍齒棒桿菌厭氧發(fā)酵特性的影響，在應(yīng)用方面可建立提高琥珀酸生產(chǎn)效率的電刺激發(fā)酵工藝，同時(shí)對(duì)推動(dòng)發(fā)酵工程與電化學(xué)學(xué)科的交叉融合也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

鈍齒棒桿菌CICC20219，目前由巢湖學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基A主要用于微生物的快速繁殖，主要成分：葡萄糖40 g/L，尿素2 g/L，酵母提取物2 g/L，酪蛋白氨基酸7 g/L，(NH4)2SO47 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，F(xiàn)eSO40.006 g/L，MnSO40.0042 g/L，生物素0.0002 g/L、硫胺素0.0002 g/L[21]。

培養(yǎng)基B 主要用于厭氧發(fā)酵產(chǎn)乳酸與琥珀酸，主要成分：葡萄糖60 g/ L，NaHCO316.8 g/ L，KH2PO40.5 g/ L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，F(xiàn)eSO40.006 g/L，MnSO40.0042 g/L，生物素0.0002 g/L、硫胺素0.0002 g/L[21]。

1.1.3 試劑盒

NADH與NAD＋濃度檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品序號(hào)：A114）、RNA提取試劑盒（產(chǎn)品序號(hào)：NO65）、cDNA合成試劑盒（產(chǎn)品序號(hào)：N118）南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUTIY UPLC H-Class plus超高效液相色譜系統(tǒng) 美國(guó)Waters公司；FQD-96A實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 杭州博日科技股份有限公司；CHI660E電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司；ACQUTIY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUTIY UPLC BEH Amide Carbohydrate Analysis C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）愛爾蘭Waters公司；全溫?fù)u瓶柜 蘇州培英公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究采用的發(fā)酵工藝可分為2 個(gè)階段：有氧階段與厭氧階段。有氧階段主要用于鈍齒棒桿菌的快速繁殖，目的是獲得大量的菌體；厭氧階段主要為代謝葡萄糖生產(chǎn)有機(jī)酸的發(fā)酵階段。主要過程如下：挑取鈍齒棒桿菌接種于含30 mL培養(yǎng)基A的250 mL搖瓶中，于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，按照10%接種量轉(zhuǎn)接于含100 mL培養(yǎng)基A的500 mL搖瓶中，然后于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)10～12 h。將培養(yǎng)液于5000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清液并收集菌體，然后將菌體接種于厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基B，接種量：生物量干質(zhì)量濃度約為8 g/L。

厭氧發(fā)酵階段使用100 mL的H型電解池為發(fā)酵容器（圖2）。H型電解池為3電極體系，鉑片電極（10 mm×10 mm×0.1 mm）為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，且置Ag/AgCl電極于陰極電解池，并使用質(zhì)子膜將陰極與陽(yáng)極隔開。陽(yáng)極與陰極電解池均含有80 mL培養(yǎng)基B，唯一不同的是：添加3 g堿式MgCO3于陰極電解池，用于中和產(chǎn)生的有機(jī)酸。電流通過電化學(xué)工作站提供，開環(huán)條件下的電解池系統(tǒng)為對(duì)照組，默認(rèn)電流大小為0 mA。

圖2 H型電解池發(fā)酵系統(tǒng)示意圖Fig.2 Schematic view of H-type electrolytic fermentor

1.3.2 分析檢測(cè)

細(xì)胞數(shù)量通過檢測(cè)OD600nm和干質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。NADH與NAD＋濃度由輔酶I檢測(cè)試劑盒測(cè)定。利用超高效液相色譜對(duì)有機(jī)酸和殘?zhí)呛窟M(jìn)行分析。檢測(cè)有機(jī)酸時(shí)，采用二極管陣列檢測(cè)器，色譜柱為ACQUTIY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.003 mmol/L硫酸溶液，流速為0.2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。檢測(cè)殘?zhí)菚r(shí)，采用蒸發(fā)光檢測(cè)器，色譜柱為ACQUTIY UPLC BEH Amide Carb ohydrate Analysis C18色譜柱，流動(dòng)相為80%乙腈溶液，流速為0.4 mL/min。

1.3.3 基因表達(dá)水平分析

鈍齒棒桿菌在厭氧條件下培養(yǎng)4 h后，利用TRIzol法提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以16S RNA為內(nèi)參基因，利用real-time PCR儀對(duì)6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因（zwf）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（pepc）、蘋果酸脫氫酶基因（mdh）及乳酸脫氫酶基因（ldhA）的表達(dá)水平進(jìn)行分析。RNA提取與cDNA合成分別使用相關(guān)試劑盒完成。使用的引物如表1所示，引物合成委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

表1 real-time PCR使用的特異性引物Table 1 Specific primer sequences used for real-time PCR

1.3.4 代謝通量分析

鈍齒棒桿菌在厭氧條件下培養(yǎng)時(shí)，生物量基本沒有變化[8,22]。因此，本研究不考慮生物量對(duì)代謝通量分布的影響。代謝通量計(jì)算過程中，假設(shè)胞內(nèi)代謝反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物處于擬穩(wěn)態(tài)，并能及時(shí)轉(zhuǎn)化為下游產(chǎn)物，同時(shí)設(shè)定NADH與NADPH可無(wú)限制相互轉(zhuǎn)換。鈍齒棒桿菌在厭氧條件的代謝網(wǎng)絡(luò)如圖1所示，主要由EMP、磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，HMP）、琥珀酸、乳酸、乙酸等合成途徑組成。由圖3可知，代謝通量計(jì)算時(shí)共有27 個(gè)變量，圍繞6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖等代謝中間體可列出代謝通量方程21 個(gè)（表2），圍繞NADH（NADPH）平衡、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）平衡可列出代謝通量方程2 個(gè)，即共有23 個(gè)代謝通量方程，方程自由度為4，因此，需要測(cè)定4 個(gè)變量才能對(duì)代謝通量方程進(jìn)行求解。本研究取厭氧發(fā)酵4 h的發(fā)酵液進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析，通過離線精確檢測(cè)殘?zhí)恰⑷樗?、琥珀酸和乙酸等變量，以求解代謝通量方程。

表2 代謝通量方程Table 2 Equations of metabolic flux balance

圖3 變量分布示意圖Fig.3 Schematic diagram of variables

2 結(jié)果與分析

2.1 電流刺激對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

本研究以H型電解池為發(fā)酵容器，在發(fā)酵過程中通過施加電流刺激改變鈍齒棒桿菌胞外培養(yǎng)環(huán)境，研究電流刺激對(duì)其代謝特性的影響，結(jié)果如圖4所示。研究發(fā)現(xiàn)，通入電流對(duì)鈍齒棒桿菌在厭氧條件下發(fā)酵特性產(chǎn)生了較為明顯的影響。在對(duì)照組（未通電），鈍齒棒桿菌在8 h內(nèi)共消耗葡萄糖58.7 g/L（圖4a），葡萄糖消耗速率為7.3 g/（L·h）（圖5）。施加-2 mA與-5 mA電流刺激后，在相同時(shí)間內(nèi)，鈍齒棒桿菌消耗的葡萄糖分別達(dá)到65.7 g/L（圖4b）與74.7 g/L（圖4c），葡萄糖消耗速率分別為8.2 g/（L·h）與9.3 g/（L·h），與對(duì)照組相比，分別增加12.3%與27.4%。以上結(jié)果說明，通入電流對(duì)葡萄糖的代謝效率具有顯著促進(jìn)作用。導(dǎo)致鈍齒棒桿菌在電流刺激條件下糖代謝效率增加的可能原因是細(xì)胞膜通透性的提升。因?yàn)?，鈍齒棒桿菌吸收利用葡萄糖的過程主要分為跨膜運(yùn)輸與糖酵解，葡萄糖只有通過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)才能被微生物進(jìn)一步利用，而研究顯示適度的電流刺激會(huì)增加細(xì)胞膜的通透性[23]。另外，細(xì)胞膜通透性增加還會(huì)加速胞內(nèi)代謝產(chǎn)物（琥珀酸與乳酸）向胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，減弱胞內(nèi)代謝產(chǎn)物反饋抑制，提升胞內(nèi)的整個(gè)代謝速率。與本研究結(jié)果相似，Wang Kai等[24]也發(fā)現(xiàn)，施加電流刺激可以增加硫酸鹽還原細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，并加速底物與代謝產(chǎn)物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖4 不同電流刺激條件下的發(fā)酵結(jié)果Fig.4 Fermentation characteristics under different electrical current stimulation conditions

圖5 不同電流刺激條件下的葡萄糖消耗速率Fig.5 Glucose consumption rates under different electrical current stimulation conditions

施加電流刺激后，發(fā)酵液中的乳酸與琥珀酸質(zhì)量濃度均高于對(duì)照組。無(wú)電流刺激條件下，發(fā)酵液中的乳酸質(zhì)量濃度在8 h達(dá)到43.9 g/L（圖4a）。當(dāng)電流為-2 mA與-5 mA時(shí)，乳酸質(zhì)量濃度分別為45.0 g/L（圖4b）與46.5 g/L（圖4c），與對(duì)照組比，分別增加了2.5%和5.9%。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)的乳酸質(zhì)量濃度在3 組中雖然是最低的，但其乳酸產(chǎn)量（每代謝1 g葡萄糖產(chǎn)生的乳酸質(zhì)量）最高，達(dá)到0.75 g/g（圖6），分別比-2 mA與-5 mA實(shí)驗(yàn)組高出10.3%與21.0%。通入電流可以明顯提高發(fā)酵液中琥珀酸質(zhì)量濃度及琥珀酸產(chǎn)量，電流越小，琥珀酸質(zhì)量濃度與產(chǎn)量越高。當(dāng)電流由0 mA（對(duì)照組）變?yōu)?5 mA時(shí)，琥珀酸質(zhì)量濃度由13.8 g/L增加到28.9 g/L，琥珀酸產(chǎn)量由0.24 g/g增加到0.39 g/g（圖6），與對(duì)照組相比，質(zhì)量濃度與產(chǎn)量分別增加了109.4%和62.5%。同時(shí)，琥珀酸與乳酸產(chǎn)量比由0.32增加到0.63。以上結(jié)果說明，電流刺激可以改變鈍齒棒桿菌在厭氧條件下的代謝物組成，并有利于提高需要較多H還原力的代謝產(chǎn)物的合成，如琥珀酸。

圖6 不同電流刺激條件下的有機(jī)酸產(chǎn)量Fig.6 Organic acid yields under different electrical current stimulation conditions

微生物培養(yǎng)過程中，向反應(yīng)系統(tǒng)施加電流刺激可以在培養(yǎng)液中產(chǎn)生更多的電子，電子通過傳遞進(jìn)入細(xì)胞會(huì)對(duì)胞內(nèi)NADH代謝產(chǎn)生影響，繼而影響微生物整體代謝特性[13,20,25]，比如代謝產(chǎn)物通量分布。為了深入分析電流刺激調(diào)控鈍齒棒桿菌代謝特性的原因，本研究對(duì)不同電流刺激條件下的胞內(nèi)NADH/NAD＋值進(jìn)行分析。由圖7 可以看出，通入電流后，鈍齒棒桿菌胞內(nèi)的NADH/NAD＋值明顯升高。當(dāng)電流為-2 mA與-5 mA時(shí)，NADH/NAD＋值分別為0.79與0.85，比對(duì)照組高出21.5%和30.8%。由圖1可以看出，輔因子NADH/NAD＋是6-磷酸葡萄糖脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶與乳酸脫氫酶等的輔酶，表明胞內(nèi)H還原力可用水平對(duì)鈍齒棒桿菌代謝通量分布有重要的調(diào)節(jié)作用。因此，電流刺激導(dǎo)致鈍齒棒桿菌胞內(nèi)NADH通量增加是導(dǎo)致鈍齒棒桿菌代謝特性發(fā)生變化及琥珀酸產(chǎn)量增加的主要原因之一。與本研究結(jié)果相似，其他研究也表明改變微生物培養(yǎng)環(huán)境可以調(diào)節(jié)其胞內(nèi)NADH的可用水平，隨之調(diào)控胞內(nèi)產(chǎn)物代謝通量分布[26]。

圖7 不同電流刺激條件下的NADH/NAD＋值Fig.7 NADH/NAD+ ratio under different electrical current stimulation conditions

除了乳酸與琥珀酸，乙酸是鈍齒棒桿菌厭氧發(fā)酵時(shí)的主要副產(chǎn)物。施加電流刺激后，乙酸質(zhì)量濃度也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，由1.3 g/L（0 mA）增加到2.3 g/L（-5 mA），但其質(zhì)量濃度與產(chǎn)量相對(duì)較低。

2.2 電流刺激對(duì)代謝通量分布的影響

NADH（或NADPH）主要由EMP與HMP產(chǎn)生。與EMP相比，1 分子葡萄糖經(jīng)由HMP代謝后會(huì)產(chǎn)生額外2 分子H還原力（圖1）。本研究中，施加電流刺激后，消耗單位葡萄糖產(chǎn)生的NADH明顯增加，表明胞內(nèi)EMP與HMP兩個(gè)途徑的代謝通量分布在施加電流刺激后發(fā)生改變。另外，磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點(diǎn)的代謝流分布對(duì)琥珀酸、乳酸產(chǎn)量也有重要調(diào)節(jié)作用[27]。通過代謝通量分析，可以更深入了解電流刺激對(duì)6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸等關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)代謝流分布的影響，有助于通過電流刺激調(diào)控琥珀酸與乳酸生成比，實(shí)現(xiàn)鈍齒棒桿菌厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)乳酸與琥珀酸。代謝通量分析結(jié)果如表3所示。

表3 代謝通量計(jì)算結(jié)果Table 3 Calculated metabolic flux distribution

可以看出，除琥珀酸、乳酸、乙酸等最終產(chǎn)物外，電流刺激對(duì)6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸等節(jié)點(diǎn)的代謝流分布產(chǎn)生了明顯影響。對(duì)照組中，6-磷酸葡萄糖節(jié)點(diǎn)流向6-磷酸果糖的流量J2為 92.4 mmol/（L·g·h），至6-磷酸葡萄糖酸的流量J9為7.6 mmol/（L·g·h），兩者比例為12∶1，說明碳源主要經(jīng)由EMP 進(jìn)行代謝。同時(shí)，在磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點(diǎn)，流向丙酮酸的流量J7為159.7 mmol/（L·g·h），流向草酰乙酸（C4途徑）的流量J22為37.7 mmol/（L·g·h），兩者比例約為4:1，說明碳代謝流主要流向丙酮酸-乳酸合成途徑。施加-2 mA與-5 mA電流刺激后，J9分別增加到14.0、19.7 mmol/（L·g·h），與對(duì)照組相比，分別增加了84.4%和150.6%。同時(shí)，J7流量由 159.7 mmol/（L·g·h）減少到146.9、134.2 mmol/（L·g·h）。相比之下，J22由37.7 mmol/（L·g·h）增加到48.4、59.3 mmol/（L·g·h）。以上結(jié)果說明，施加電流刺激可以明顯增加HMP與C4途徑的代謝通量。其原因可能是：微生物胞內(nèi)的氧化還原態(tài)勢(shì)處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在鈍齒棒桿菌胞內(nèi)H還原力因外界環(huán)境改變而升高后，微生物會(huì)調(diào)節(jié)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物組成，以合成還原態(tài)勢(shì)更高的代謝產(chǎn)物，如琥珀酸，讓NAD＋快速重生，使胞內(nèi)氧化還原態(tài)勢(shì)處于新的穩(wěn)定狀態(tài)[7,28]。

2.3 電流刺激對(duì)基因表達(dá)水平的影響

為進(jìn)一步明確電流刺激對(duì)鈍齒棒桿菌代謝通量分布影響，本研究對(duì)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。由圖8可以看出，施加-5 mA電流刺激后，6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因（zwf）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（pepc）與蘋果酸脫氫酶基因（mdh）的表達(dá)水平均上調(diào)，而乳酸脫氫酶基因（ldhA）表達(dá)水平下調(diào)。zwf與pepc表達(dá)水平上調(diào)，可以進(jìn)一步佐證電流刺激可以增加HMP與C4途徑代謝通量的結(jié)果。蘋果酸脫氫酶是琥珀酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，NADH是其輔酶[29]。mdh表達(dá)水平上調(diào)，ldhA表達(dá)水平下調(diào)，說明C4途徑中草酰乙酸至蘋果酸的代謝活動(dòng)增加，丙酮酸至乳酸的代謝活動(dòng)下降，與琥珀酸產(chǎn)量增加、乳酸產(chǎn)量減少的發(fā)酵結(jié)果一致。

圖8 不同電流刺激條件下的基因表達(dá)水平Fig.8 Gene expression levels under different electrical current stimulation conditions

厭氧條件下，鈍齒棒桿菌利用C4途徑合成1 mol琥珀酸，需要2 mol NADH。EMP產(chǎn)生的NADH無(wú)法滿足高琥珀酸合成通量對(duì)NADH的需求，而HMP則可產(chǎn)生更多的H還原力。在本研究中，施加電流刺激后，陰極發(fā)生還原反應(yīng)產(chǎn)生電子，甚至析氫，并經(jīng)過傳遞鏈進(jìn)入鈍齒棒桿菌胞內(nèi)，電流刺激提供的額外電子致使6-磷酸葡萄糖節(jié)點(diǎn)處的HMP代謝通量增加，并合成更多的H還原力，結(jié)果導(dǎo)致胞內(nèi)的NADH/NAD＋值顯著升高[25]。因?yàn)榘麅?nèi)可用于合成琥珀酸的NADH增加，鈍齒棒桿菌調(diào)節(jié)了磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點(diǎn)的代謝流分布，使琥珀酸合成途徑代謝通量增加，這可能就是施加電流刺激后，琥珀酸產(chǎn)量增加的主要原因。因此，6-磷酸葡萄糖是影響琥珀酸產(chǎn)量的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，只有該節(jié)點(diǎn)出的代謝流發(fā)生改變，使更多的碳經(jīng)由HMP進(jìn)行代謝產(chǎn)生更多的H還原力，才能有效提高琥珀酸產(chǎn)量。

3 結(jié)論

研究電流刺激對(duì)鈍齒棒桿菌厭氧發(fā)酵特性的影響，結(jié)果顯示，施加-2 mA與-5 mA電流刺激可以提升鈍齒棒桿菌代謝葡萄糖的速率與琥珀酸的產(chǎn)量，有利于聯(lián)產(chǎn)乳酸與琥珀酸。電流刺激提供的額外電子使HMP代謝通量增加，并合成更多的H還原力，是琥珀酸產(chǎn)量提高的主要原因。本研究結(jié)果有利于加強(qiáng)發(fā)酵工程與電化學(xué)學(xué)科的交叉融合，可為利用微生物發(fā)酵工藝聯(lián)產(chǎn)琥珀酸及乳酸提供參考。