李相輝 侯艷紅 吳凱 楊汨 張林

1中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科（北京 100091）；2河北北方學(xué)院（河北張家口 075132）

胃癌是嚴重威脅國人健康與生命的一種惡性腫瘤，近年來該疾病發(fā)病率及病死率在歐美國家已經(jīng)呈下降趨勢［1］，在日本及韓國，由于消化內(nèi)鏡檢查的推廣，早期診斷率大幅提升，總體預(yù)后也明顯轉(zhuǎn)好［2］。但在我國胃癌仍然呈快速上升的趨勢，且早期診斷率較低，預(yù)后較差。根據(jù)CHEN等［3］的研究顯示，胃癌、食道癌和肝癌如今被確定為癌癥死亡的主要原因。農(nóng)村地區(qū)居民發(fā)病率和死亡率明顯高于城市居民。進展期胃癌的治療效果極差，臨床5 年生存率低于40%，臨床急需治療效果更好且毒副作用更小的治療方法。根據(jù)國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)一些潛在的抑癌基因及RNA，如硫氧還蛋白5（TXNDC5）基因、長鏈非編碼RNA（LncRNA）RP11-356I2.2［4］、糞便miRNA［5］等，它們對癌癥尤其是消化系統(tǒng)癌癥具有潛在的抑制作用。本研究組前期的基礎(chǔ)研究中［6-9］證實：TXNDC5 基因在胃癌前病變及胃癌組織中的表達顯著高于正常胃黏膜組織，且該分子高表達與不良的預(yù)后關(guān)系密切。進一步通過體外細胞實驗證實：在正常胃黏膜上皮細胞中上調(diào)該基因的表達可使之出現(xiàn)惡性生物學(xué)行為表現(xiàn)，而在該分子高表達的胃癌細胞中采用RNA 干擾技術(shù)降低其表達可抑制細胞生長，改善惡性生物學(xué)表現(xiàn)。這些結(jié)果提示TXNDC5 具有作為胃癌靶向治療潛在目標分子的可能。為了驗證干預(yù)該分子表達對體內(nèi)胃癌的抑制作用，我們在本研究中采用納米微球包載TXNDC5 RNA 干擾核酸片段導(dǎo)入胃癌模型動物體內(nèi)，觀察其對移植瘤模型動物的體內(nèi)抑瘤作用，進一步評估TXNDC5 作為胃癌治療靶點的意義。

1 材料與方法

1.1 材料α-氰基丙烯酸正丁酯（BCA）（北京瞬康醫(yī)用膠有限公司）；TXNDC5 單抗（Abnova 公司）；其他試劑為國產(chǎn)分析純。85-2 恒溫加熱磁力攪拌器（上海志威電器有限公司）；微孔濾膜（欣惠澤奧有限公司），Zeta sizerNano ZS90 型激光粒徑分析儀（英國馬爾文公司）；人胃腺癌細胞株SGC7901（解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科保存），細胞培養(yǎng)于含胎牛血清、青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中。IVIS·Lumina LT 小動物活體成像系統(tǒng)（美國PerkinElmer）；Living Image 4.3 圖像分析軟件（美國PerkinElmer）。細胞及動物實驗由中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心動物實驗室進行。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物BALB/c 裸鼠45 只，全部建模，40 只入實驗組5 只后備。雌性，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g。實驗條件：實驗室溫度（22～25）℃，相對濕度40%～70% RH，相對空氣壓力10～20 Pa，空氣交換頻率10～15 次/h，備有中央空調(diào)和空氣過濾機械設(shè)備，動物籠具、墊料、飲用水等均經(jīng)高壓蒸汽消毒，每籠3 只鼠，飼以SPF 級專用顆粒飼料，自由飲水。裸鼠移植瘤模型建立參見李春梅等［10］報道的方法，取對數(shù)生長期的人胃腺癌細胞系SGC7901 細胞，PBS 洗滌3 次，重懸于PBS 中并調(diào)整濃度為6 × 107/mL。于每只裸鼠右側(cè)腋部皮下注射0.2 mL 細胞懸液，觀察成瘤情況。約8～12 d 成瘤（瘤體直徑＞0.5 cm）后開始治療實驗。

1.2.2 TXNDC5siRNA-PBCA-NP的制備TXNDC5 siRNA 核酸片段參見本研究組張林等［8］報道的核酸序列合成，具體序列為：5'-cgacctggatgctgcagacactggagtactgcagtgtctgcagcatccagttttt-3'，3'-ggacctacgacgtctgtgacctcatgacgtcacagacgtcgtaggtcaaaaagatc-5'。TXNDC5 siRNA雙鏈體DNA合成后參照張林等［8］報道的方法將此雙鏈DNA 片段插入IMG800 RNAi 載體XbaI 和ScaI 酶切位點之間，完成構(gòu)建TXNDC5 siRNA載體。TXNDC5 siRNA-PBCA-NP的具體制備方法參考本研究組李春梅等［11］的實驗方法。稱取Dxtran-70 100 mg、PluronicF-127 75 mg 及TXNDC5 siRNA 載體5 mg 溶于無菌水，濃度為5 μmol/L 置于10 mL 燒杯中加無菌水，用0.1 mol/L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 至1.4，定容至5 mL，在25 ℃600 r/min 電磁攪拌下緩加入0.06 mL BCA 單體，攪拌5 h 后，用0.1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至7.0，繼續(xù)攪拌0.5 h，用微孔濾膜過濾，即得乳白色膠體溶液。將微球稀釋到合適的濃度后，用激光散射粒度分析儀來觀察微球粒徑的大小及分布。TXNDC5 siRNA-PBCA-NP 的包封率和載藥率由下述公式分別計算：載藥率=納米粒子中TXNDC5 siRNA質(zhì)量/納米粒子質(zhì)量×100%，包封率=納米粒子中TXNDC5 siRNA質(zhì)量/TXNDC5 siRNA投藥量×100%。透射電鏡觀察納米顆粒形態(tài)。

1.2.3 體內(nèi)抑瘤實驗荷瘤裸鼠隨機分為4 組，每組10 只，按以下分組情況進行實驗：A 組：按2.5 mg/kg 等劑量的TXNDC5 siRNA-PBCA-NP 經(jīng)尾靜脈注射；B 組：等量PBCA-NP 經(jīng)尾靜脈注射；C組：5-Fu 2.5 mg/kg 量經(jīng)尾靜脈注射；D 組：等量生理鹽水經(jīng)尾靜脈注射。每3 天重復(fù)治療1 次，每3天測量1 次腫瘤長徑（a）和短徑（b）。第15 天及第30 天行活體生物發(fā)光檢測成像并記錄，生物發(fā)光實驗方法參考王劍超等的研究方法［12］。腫瘤體積V=a×b2/2，按照每組每個測量時間點平均腫瘤體積繪制生長曲線。第30 天處死裸鼠，剝離瘤體稱重，抑瘤率=［（對照組瘤重一實驗組瘤重）/對照組瘤重］×100%，比較各組間抑瘤率的差異。

1.2.4 各處理組動物腫瘤組織TXNDC5 表達情況檢測按上述分組情況進行實驗，第30 天處死裸鼠，剝離瘤體稱重后，腫瘤組織留取部分進行福爾馬林固定，組織石蠟包埋后切片進行HE 染色和TXNDC5 免疫組化檢測，按照常規(guī)SP 免疫組化法進行。采用免疫組化陽性細胞計數(shù)法分析，在40 倍光鏡下隨機選擇10 個不重疊視野，計數(shù)陽性著色細胞數(shù)，每個組織選3 張切片，每組10 個樣本全部計數(shù)，而后求出每張切片平均陽性細胞數(shù)進行組間比較。各組動物取部分腫瘤組織提取總RNA 和總蛋白行RT-PCR 和Western blot 檢測。RT-PCR 檢測：取各組鼠腫瘤組織100 mg 左右，使用異硫氰酸胍一步法提取總RNA（Code：D9108，TaKaRa 大連寶生物有限公司），所提取總RNA 液經(jīng)紫外分光光度計測定A260/A280 值，計算RNA的純度。使用PrimeScript TMRT reagent Kit（Code：DRR037A，TaKaRa 大連寶生物有限公司）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所有操作均嚴格按照說明書進行，將所得25 μL 產(chǎn)物凍存于-20 ℃冰箱以備進行PCR。采用常規(guī)PCR 法檢測，擴增標本以β-actin 作為內(nèi)參對照，計算檢測結(jié)果以生理鹽水空白對照組標本作為對照。PCR 擴增引物由北京塞百盛基因技術(shù)有限公司合成。擴增片段為359 bp。以DNA Marker（DL2000）作為標準分子量標記，以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照，結(jié)果以兩者之吸光度的比值表示，而后求各組平均值進行組間比較。Western blot 檢測：常規(guī)提取各組腫瘤組織總蛋白，Bradford 法測定蛋白質(zhì)含量。常規(guī)制備10%分離膠和5%積層膠，按每孔50 μg 的蛋白量加樣，樣品加等體積的5×蛋白上樣緩沖液，上樣前將樣品在沸水中加熱10 min，進行SDS-PAGE 電泳。電泳后進行轉(zhuǎn)膜，將分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。PVDF 膜于5%脫脂奶粉TBS 中室溫孵育2 h 封閉非特異性抗原。而后加1∶1 000 PBS 稀釋的一抗4 ℃孵育過夜。用TBS 洗膜3 次，每次10 min，滴加二抗工作液室溫下孵育2 h，再TBS 洗膜3 次，每次10 min。隨后濾紙吸干殘液，完成顯色及顯影定影。Western blot 檢測以β-actin 為內(nèi)參對照，用圖像分析軟件IPP6.0 對圖像進行灰度分析，結(jié)果以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度的比值表示，而后求各組平均值進行組間比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件計數(shù)資料以率表示，率的比較采用χ2檢驗；計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TXNDC5 siRNA-PBCA-NP 的制備按前述方法所得到的納米顆粒電鏡下觀察形態(tài)表現(xiàn)為光滑的球形，藥物均勻地分散在聚合物基質(zhì)中。TXNDC5 siRNA-PBCA-NP 納米粒的平均尺寸分別為（79.45±11.24）nm。TXNDC5 siRNA的包封率和載藥量分別為（46.68±7.66）%、（8.14±0.69）%，電鏡觀察納米顆粒為較為規(guī)則的球形分散性良好。成功制備了TXNDC5 siRNA-PBCA-NP 載藥納米粒子（圖1）。

圖1 TXNDC5 siRNA-PBCA-NP 載藥納米粒子透射電鏡檢測圖Fig.1 Transmission electron microscopic examination of TXNDC5 siRNA-PBCA-NP drug loaded nanoparticles

2.2 各處理組動物腫瘤組織TXNDC5 表達情況檢測

2.2.1 免疫組化檢測結(jié)果TXNDC5 蛋白陽性主要為腫瘤細胞胞質(zhì)的棕色顆粒（圖2），與其余各組比較，A 組動物腫瘤組織TNXDC5 免疫組化染色強度明顯降低（P＜0.05），其余各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 免疫組化檢測各組腫瘤組織TNXDC5 蛋白表達Tab.1 Expression of TXNDC5 protein in tumor tissues of each group detected by immunohistochemistry ±s

表1 免疫組化檢測各組腫瘤組織TNXDC5 蛋白表達Tab.1 Expression of TXNDC5 protein in tumor tissues of each group detected by immunohistochemistry ±s

注：與其他各組比較，*P＜0.05

組別A 組B 組C 組D 組動物數(shù)10 10 10 10 TNXDC5 陽性細胞表達7.4±1.3*43.2±6.5 37.6±7.2 39.5±9.1

圖2 各組動物腫瘤組織TNXDC5 免疫組化檢測結(jié)果（×200）Fig.2 Immunohistochemical detection results of TXNDC5 in tumor tissues of animals in each group

2.2.2 RT-PCR 檢測結(jié)果與其余各組比較，A 組動物腫瘤組織TNXDC5 mRNA 表達顯著降低（P＜0.05），其余各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2、圖3。

表2 RT-PCR 檢測各組腫瘤組織TNXDC5mRNA 的表達Tab.2 TXNDC5 mRNA expression in tumor tissues of each group detected by RT-PCR ±s

表2 RT-PCR 檢測各組腫瘤組織TNXDC5mRNA 的表達Tab.2 TXNDC5 mRNA expression in tumor tissues of each group detected by RT-PCR ±s

注：與其余各組比較，*P＜0.05

組別A 組B 組C 組D 組動物數(shù)10 10 10 10 TNXDC5 mRNA 表達0.126±0.071*0.510±0.139 0.463±0.115 0.418±0.133

圖3 各組動物腫瘤組織TNXDC5 mRNA 表達RT-PCR檢測Fig.3 RT-PCR detection of TXNDC5 mRNA expression in tumor tissues of animals in each group

2.2.3 Western blot 檢測結(jié)果與其余各組比較，A 組動物腫瘤組織TNXDC5 蛋白質(zhì)表達顯著下降（P＜0.05）。其余各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3、圖4。

表3 各組動物腫瘤組織TNXDC5 蛋白質(zhì)表達Western blot檢測Tab.3 Western blot detection of TXNDC5 protein expression in tumor tissues of animals in each group ±s

表3 各組動物腫瘤組織TNXDC5 蛋白質(zhì)表達Western blot檢測Tab.3 Western blot detection of TXNDC5 protein expression in tumor tissues of animals in each group ±s

注：與其余各組比較，*P＜0.05

組別A 組B 組C 組D 組動物數(shù)10 10 10 10 TNXDC5 蛋白質(zhì)表達0.241±0.083*0.548±0.144 0.471±0.102 0.505±0.164

圖4 各組動物腫瘤組織TNXDC5 蛋白質(zhì)表達Western blot檢測Fig.4 Western blot detection of TXNDC5 protein expression in tumor tissues of animals in each group

2.3 TXNDC5 siRNA-PBCA-NP 體內(nèi)抑瘤實驗結(jié)果以各組裸鼠移植瘤體積均值繪制腫瘤生長曲線（圖5）。治療后30 d 各治療組腫瘤質(zhì)量計算抑瘤率，A 組、C 組抑瘤率顯著高于B、D 兩組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），A、C 兩組及B、D 兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

表4 各組裸鼠治療后腫瘤質(zhì)量Tab.4 Tumor mass of nude mice in each group after treatment ±s，mg

表4 各組裸鼠治療后腫瘤質(zhì)量Tab.4 Tumor mass of nude mice in each group after treatment ±s，mg

注：*表示與B、D 組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05

組別A 組B 組C 組D 組例數(shù)10 10 10 10腫瘤質(zhì)量（mg）381.27±24.22*1 081.04±38.58*414.53±29.59*1 154.66±34.25抑瘤率（%）66.98±4.02*6.38±1.04 64.10±7.55*

圖5 實驗動物腫瘤生長曲線Fig.5 tumor growth curve of experimental animals

2.4 體內(nèi)抑瘤實驗活體生物發(fā)光檢測結(jié)果生理鹽水空白對照組和單純納米顆粒治療組荷瘤裸鼠腫瘤范圍和光子量隨時間進行性升高，而采用TXNDC5 siRNA-PBCA-NP 和5-Fu 干預(yù)組荷瘤裸鼠腫瘤范圍和光子量均受到不同程度的抑制。各組處理前腫瘤光子量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥第15 天和30 天行生物發(fā)光檢測時，TXNDC5 siRNA-PBCA-NP 和5-Fu 組裸鼠腫瘤光子量顯著低于其他各組（P＜0.05），結(jié)果見圖6、7。

圖7 生物活體發(fā)光檢測胃癌荷瘤裸鼠腫瘤光子量Fig.7 Bioluminescence detection of tumor photons in nude mice bearing gastric cancer

3 討論

胃癌絕大多數(shù)起源于胃黏膜腺上皮細胞，起初生長于人體胃黏膜層，早期無明顯癥狀，直至侵犯周邊組織臟器后方可引起癥狀。常規(guī)體檢血常規(guī)、生化及腫瘤標志物檢測和普通的腹部超聲及CT 檢查難以發(fā)現(xiàn)，以日本為代表的西方發(fā)達國家近年來推廣了消化內(nèi)鏡普查，明顯提升了胃癌的早期發(fā)現(xiàn)率，繼而提高了該腫瘤的治愈率。但按照目前我國的整體醫(yī)療水平、國民認知水平和傳統(tǒng)觀念尚無法推廣全面的消化內(nèi)鏡普查，因此國內(nèi)大多數(shù)胃癌發(fā)現(xiàn)時均為進展期，缺乏有效的治療手段，故預(yù)后極差［13-14］。因此針對進展期胃癌有效而低副反應(yīng)的治療方法是目前研究的熱點。分子靶向治療和生物免疫治療開啟了惡性腫瘤治療的新時代，其中胃癌分子靶點問題是一個研究熱點，本研究組近年來進行了胃癌前炎癥性病變惡性轉(zhuǎn)化的分子機制研究。通過差異蛋白組學(xué)研究我們發(fā)現(xiàn)TXNDC5 蛋白分子可能在癌前病變向胃癌的演變中具有重要意義［7］。隨后又采用基因轉(zhuǎn)染及RNAi 方法建立TXNDC5 表達上調(diào)胃黏膜上皮細胞系及下調(diào)的胃癌細胞系，檢測這些細胞系生長、增殖、細胞周期及凋亡、遷徙能力等惡性相關(guān)生物學(xué)特性，研究［8］結(jié)果提示TXNDC5 表達上調(diào)可明顯促進生長、增殖及遷徙能力，而下調(diào)則有相反作用。在此基礎(chǔ)上我們進行了TXNDC5 蛋白分子在較大人群樣本胃癌組織中的表達，免疫組織化學(xué)檢測并分析其與患者臨床生存情況和病理學(xué)特征的相關(guān)性。結(jié)果也提示TXNDC5 高表達可能與腫瘤更高的惡性程度及更差的預(yù)后相關(guān)［9］。國外的一些研究［15-25］表明TXNDC5 基因在宮頸癌、胃癌、肺癌、肝癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種人類腫瘤組織或細胞中表達上調(diào)，并且均提示TXNDC5 分子在多種腫瘤中可能均有較明顯的促癌作用，具有作為惡性腫瘤治療分子靶點的潛力。納米載藥系統(tǒng)是另一個近年來熱點方向，國內(nèi)外已經(jīng)有采用納米載藥系統(tǒng)進行惡性腫瘤治療的研究［26-34］，如碳納米束、金納米粒子、納米二氧化硅和超順磁性、氧化鐵納米粒子等無機納米粒子以及白蛋白納米粒子、殼聚糖納米粒子等有機納米粒子，在惡性腫瘤診斷及治療中已取得一定成績。其中聚氰基丙烯酸正丁酯納米微粒（PBCA-NP）作為藥物載體具有顆粒大小適中可避免內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬快速分布于組織，具有優(yōu)良的藥物緩釋作用，尤其具有透過血腦、血胰等一些屏障的良好作用，在前期的體外細胞學(xué)實驗中我們已經(jīng)證實其良好的載藥及藥物釋放作用［35-36］。楊西曉等［37］通過MTT 染色、乳酸脫氫酶釋放量的測定，研究絲裂霉素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒對正常肝細胞株生長毒性的關(guān)系，證明聚氰基丙烯酸正丁酯納米?？勺鳛榭拱┧幬锝z裂霉素的載體，載藥后可降低絲裂霉素的細胞毒性。劉建軍等［38］使用SD 大鼠進行慢性毒性試驗，對新型抗腫瘤復(fù)合材料表阿霉素α-聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒生物安全性進行初步評價，結(jié)果證實其生物安全性良好。馬淑燕等［39］通過制備硫酸長春堿聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒，檢測其對大鼠C6 腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞及正常大鼠星形膠質(zhì)細胞的毒性作用，納米?？梢院芎玫慕档烷L春堿原料藥的毒性。綜上，根據(jù)既往實驗研究證實，本實驗中所用的siRNA 靶向納米微粒屬于生物安全性良好的載藥納米材料。

本研究結(jié)果顯示TXNDC5 siRNA-PBCA-NP 對于裸鼠胃癌移植瘤的抑制作用明顯優(yōu)于空納米粒子PBCA-NP 且與化療藥物5-Fu 基本持平，而PBCA-NP 空納米顆粒未體現(xiàn)出明顯的抑制作用。這一結(jié)果與我們前期體外胃癌細胞干預(yù)結(jié)果［7］一致，提示：（1）TXNDC5 siRNA 在體內(nèi)條件下依然可以對模型動物胃癌種植瘤組織TXNDC5 基因的表達水平進行有效的抑制，并通過干擾該基因的表達起到抑制腫瘤生長的治療作用。（2）PBCA-NP 納米微粒在動物體內(nèi)對TXNDC5 siRNA 載體核酸具有明顯的保護作用，可以作為物理屏障保護核酸片段不被體內(nèi)廣泛存在的各類核酸酶所降解，并導(dǎo)向其進入治療靶組織細胞內(nèi)達到抑制腫瘤的作用。本研究中采用了腫瘤生長曲線法、腫瘤質(zhì)量評估及活體生物發(fā)光法對抑瘤效果進行評估，各方法總體結(jié)果基本一致，其中以腫瘤質(zhì)量法計算的TXNDC5 siRNA 組和5-Fu 抑瘤率略高于活體生物發(fā)光光子量計算的抑瘤率，但相差不大，這種情況可能反應(yīng)了兩種實驗方法的精確性不同?；铙w生物發(fā)光法檢測動物腫瘤生長情況在后15 d 出現(xiàn)腫瘤生長普遍減緩的情況，可能與此時間段動物疾病消耗明顯出現(xiàn)了營養(yǎng)狀況普遍不佳的情況，對腫瘤生長支持不足，造成腫瘤組織代謝降低影響生物發(fā)光情況。本研究結(jié)果初步證實了裝載TXNDC5 siRNA 的納米微粒在模型動物體內(nèi)能夠完成組織吸收再分布并血行轉(zhuǎn)運，能夠初步克服內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬等諸多不利因素的影響，而對動物體內(nèi)的胃癌移植瘤產(chǎn)生良好的抑制作用。

本研究仍存在諸多不足，首先本實驗是以模型動物為基礎(chǔ)的前臨床水平研究，結(jié)果具有局限性，尚不足以說明人體的情況，納米微粒在人類機體的情況更為復(fù)雜，與免疫缺陷的裸鼠有很大不同。其次本研究中采用的載藥納米顆粒并不具有對于腫瘤的再導(dǎo)向性，這種情況造成了載藥納米顆粒廣泛分布于各器官組織，特異性較差。因此對納米微粒進行優(yōu)化和修飾使之具有靶向作用并在更為高等模型動物體內(nèi)實驗研究將是我們下一步的研究工作重點。通過進一步完善的實驗研究，將為裝載TXNDC5 siRNA 的納米微粒治療胃癌進入臨床打下堅實的基礎(chǔ)。