周乾華 畢華俊 孟凡東 施益明 芮超

安徽省第二人民醫(yī)院胸心外科（合肥 230012）

食管癌是全球最常見的惡性腫瘤之一［1-2］。迄今為止，手術(shù)切除早期食管癌是提高患者存活率的主要方法［3-4］。許多患者被診斷出患有晚期腫瘤，這導(dǎo)致食管癌患者的治療結(jié)果不佳［5-6］。因此，非常需要探索食管癌的分子機制，以開發(fā)治療晚期腫瘤的有效療法。microRNA（miRNA）屬于一類進化保守的單鏈、小（約19～23 個核苷酸）、內(nèi)源性表達和非蛋白編碼RNA，在多種動物、植物和病毒中充當(dāng)基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)器［7-8］。近期多項研究表明miRNA 在癌癥進展中發(fā)揮的作用。miRNA-30b-5p 是一種新的與癌癥相關(guān)的診斷標(biāo)志物。據(jù)報道［9］miR-30b-5p 可改善甲狀腺癌的診斷。miR-30b-5p 通常作為腫瘤抑制劑，抑制癌癥的增殖和轉(zhuǎn)移，包括腎癌［10］、肺癌［11］和結(jié)直腸癌［12］。據(jù)報道，miR-30b-5p 通過調(diào)節(jié)自噬［13］、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和mTOR 信號通路來控制腫瘤或疾病進展。通過生物信息網(wǎng)站TargetScan 預(yù)測顯示MKRN3 是miR-30b-5p 靶基因，但是關(guān)于miR-30b-5p 和makorin，環(huán)指蛋白3（makorin ring finger protein 3，MKRN3）對食管癌調(diào)控的作用機制尚不清楚。因此，本研究旨在討論miR-30b-5p 靶向MKRN3 對食管癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料收集2016 年1 月至2020 年12 月期間70 例食管癌患者的腫瘤和癌旁組織（距離腫瘤＞4 cm）的標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前術(shù)后經(jīng)過病理學(xué)診斷食管癌；（2）術(shù)前未經(jīng)過放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非原發(fā)性食管癌及無法確診食管癌的患者；（2）失訪及預(yù)后信息不全者。根據(jù)患者信息電話隨訪，日期截止到2020 年12 月?；颊呓M織利用低溫保存固定后，進行石蠟包埋。并收集相關(guān)臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤分化、吸煙史、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤位置、生存時間和預(yù)后結(jié)局。腫瘤組織經(jīng)過兩位病理學(xué)專家診斷為食管癌。本研究獲得安徽省第二人民醫(yī)院研究倫理委員會的批準(zhǔn)，并且所有患者知情同意。

1.1.2 細胞培養(yǎng)和主要試劑人食管癌細胞（EC9706、TE-13 和ECA109）和人食管黏膜上皮細胞（HET-1A）購自中國科學(xué)院上海細胞庫。使用10%胎牛血清（FBS）（Gibco）的1640 培養(yǎng)基（Gibco，CA）培養(yǎng)。培養(yǎng)基內(nèi)含有10%的胎牛血清（Gibco）及1%青鏈霉素。細胞平時存放在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。購買miR-30b-5p 模擬質(zhì)粒和對照質(zhì)粒購自上海吉凱公司。一抗（MKRN3、p-JAK、p-STAT3、JAK、STAT3 和GAPDH）均購自艾博抗公司，二抗購自于武漢三鷹生物科技有限公司，蛋白印跡試劑盒及BCA 蛋白濃度測量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，CCK8 檢測試劑購買于上海生工生物有限公司。Transwell 小室及六孔板購自于NEST 公司。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen 公司；miRcule miRNA Isolation kit、miRcute Plus miRNA Qrcr Kit 和miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit 購買于中國天根有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染選擇對數(shù)生長細胞，在轉(zhuǎn)染前24 h 以每孔3.0 × 104個細胞的速度接種到6 孔板中。根據(jù)LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別用過表達質(zhì)粒和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ECA109 和TE-13細胞，標(biāo)記為miR-30b-5p 模擬物和NC。在轉(zhuǎn)染過程中，加入相應(yīng)的試劑并混合均勻。將細胞培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，在5%CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換成新鮮培養(yǎng)基，然后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-30b-5p及MKRN3表達將轉(zhuǎn)染程序結(jié)束后的細胞樣本使用miRNA/mRNA試劑盒根據(jù)說明書步驟進行抽提miRNA/mRNA，將重提成功后取2 μg miRNA/mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄后取1 μL cDNA，使用購買的miR-30b-5p和其他相關(guān)引物進行PCR，記錄每個反應(yīng)管中熒光信號到達所設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct 值）。使用U6/GAPDH 作為內(nèi)參分析miR-30b-5p 及MKRN3 的表達水平。通過2-ΔΔCt法計算相對表達量，見表1。

1.2.3 CCK-8 和克隆實驗CCK-8 檢測細胞增殖情況。待轉(zhuǎn)染后ECA109 和TE-13 細胞接種于96孔板（NEXT 公司），以密度為5 × 103細胞/孔種板，培養(yǎng)一夜后。分別在培養(yǎng)0、24、48 和72 h 后，在避光的情況下每孔加入10 μL CCK-8 試劑，隨后將96 孔板放入37.5 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約1 h 后，在吸光度值OD450波段使用酶標(biāo)儀檢測OD值，以此檢測細胞增殖情況。

克隆實驗檢測增殖情況，取轉(zhuǎn)染好的細胞消化離心后，以1 000/孔的密度種植于6 孔板中，加入含10%的培養(yǎng)基，隨后培養(yǎng)10 d。去上清后，加入4%的多聚甲醛固定30 min 后，加入1∶8 稀釋后的結(jié)晶紫染液，染色30 min 后PBS 沖洗3～4 遍，拍照計數(shù)。

1.2.4 Transwell 實驗檢測遷移和侵襲能力將細胞以2 × 104個/mL 加入Transwell 中。將新鮮無血清DMEM 培養(yǎng)基加入到上室100 μL，將含有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液加入到下室600 μL。48 h 后，用多聚甲醛固定下腔15 min，并用結(jié)晶紫染色10 min。在顯微鏡下，隨機選擇5 個高倍視野來計算遷移細胞的數(shù)量。實驗前，將基質(zhì)膠解凍，并在4 ℃下用DMEM 稀釋。將基質(zhì)膠加入Transwell 室中，在37 ℃的培養(yǎng)箱中干燥過夜，制備Transwell基質(zhì)膠。將2×104個/mL 加入到室中，其余進行遷移實驗以計算侵入細胞的數(shù)量。

1.2.5 雙熒光素酶報道基因?qū)嶒瀸?shù)生長期的實驗細胞接種到96 孔板中。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒共轉(zhuǎn)染雷尼拉螢光素酶報告基因和miR-30b-5p 模擬片段。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，按照雙熒光素酶試劑盒的說明進行操作。檢測值的比率為比率（螢火蟲螢光素酶值/海腎螢光素酶價值）。

1.2.6 裸鼠成瘤模型購買30 只BALB/c 雌性裸鼠（南京青龍山動物公司），年齡在4～6 周，隨機分為NC 和miR-30b-5p mimics 組。將TE-13 和ECA109 細胞以5×107cells/mL（200 μL/小鼠）的濃度注射到小鼠的右腋下。3 周后，在小鼠體內(nèi)注射100 nmol/L 轉(zhuǎn)染試劑，持續(xù)2 周。每4 天，用卡尺測量腫瘤異種移植物生長，并根據(jù)以下公式計算體積：腫瘤體積（mm3）=（長度×寬度）2 × 0.5。30 d后，通過過量服用300 mg/kg 戊巴比妥鈉對裸鼠實施安樂死。

1.2.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達收集相應(yīng)細胞，購買碧云天公司RIPA 裂解液用以提取總蛋白裂解物。使用碧云天公司BCA 蛋白檢測試劑盒進行測定蛋白濃度。待檢測完成蛋白定量后，將等量配置好的蛋白質(zhì)（40 μg）混合好上樣緩沖液加載到凝膠上，在10%凝膠上電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用TBST 洗膜5 min/次共3次，用5%脫脂乳溶液封閉PVDF 膜1 h，然后將PVDF膜與一抗孵化，4 ℃孵育過夜。第2 天再次使用TBST 溶液清洗PVDF 膜3 次，再將PVDF膜與二抗在37 ℃下孵育1 h。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法本研究所有實驗均獨立進行3 次，數(shù)據(jù)以均值標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。采用GraphPad prism 7.0 軟件和SPSS 25.0 進行統(tǒng)計學(xué)檢驗。采用χ2檢驗評估BARX1 與臨床病理因素的相關(guān)性。組間統(tǒng)計學(xué)比較采用t檢驗、單、雙方差分析（ANOVA）。P＜0.05 為顯著性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 miR-30b-5p 在組織中的表達及與患者臨床特征相關(guān)性為研究miR-30b-5p 在組織中的表達情況，本課題組收集我院70 例食管癌患者臨床數(shù)據(jù)及組織標(biāo)本。qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，miR-30b-5p 在食管癌組織中表達明顯低于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖1。且根據(jù)qRT-PCR 結(jié)果顯示，miR-30b-5p 表達水平與吸煙（P＜0.001）、分化程度（P=0.008）、腫瘤大?。≒＜0.003）、TNM 分期（P＜0.002）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.019）、遠處轉(zhuǎn)移（P=0.015）和位置（P=0.017）具有相關(guān)性（表2）。

圖1 miR-30b-5p 在食管癌組織及癌旁組織中的表達水平Fig.1 Expression levels of miR-30b-5p in esophageal cancer tissues and adjacent tissues

2.2 miR-30b-5p 和MKRN3 在食管癌細胞系中的表達Western blot 和RT-qPCR 實驗室結(jié)果表明，與正常人食管黏膜上皮細胞HET-1A 比較，食管癌細胞ECA109、TE-13 和EC9706 中的MKRN3 表達量顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2A、B）。RT-qPCR 實驗室結(jié)果表明，與正常人食管黏膜上皮細胞HET-1A 比較，食管癌細胞ECA109、TE-13 和EC9706 中miR-30b-5p 表達量顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2C、D）。由于ECA109 和TE-13 細胞中miR-30b-5p 表達較低，選擇這二株細胞進行后續(xù)實驗。

圖2 miR-30b-5p 和MKRN3 在食管癌細胞系中的表達Fig.2 Expression of miR-30b-5p and MKRN3 in esophageal cancer cell lines

2.3 miR-30b-5p 表達上升后MKRN3 的表達水平與NC組（轉(zhuǎn)染NC序列）比較，miR-30b-5p mimics組食管癌細胞株miR-30b-5p 表達水平顯著上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3A）。不管是在蛋白水平還是mRNA水平，與NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-30b-5p mimics 組MKRN3 表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3B、C）。

圖3 miR-30b-5p 表達上升后MKRN3 的表達水平Fig.3 The expression level of MKRN3 after the increased expression of miR-30b-5p

2.4 過表達miR-30b-5p 抑制食管癌細胞增殖、侵襲、遷移能力增殖實驗CCK8 及克隆形成實驗結(jié)果顯示，與NC 組相比，miR-30b-5p mimics 組ECA109、TE-13 兩株食管癌細胞增殖數(shù)量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4A、B）。Transwell 小室實驗結(jié)果顯示，與NC 組相比，miR-30b-5p mimics 組ECA109、TE-13 兩株食管癌細胞的遷移、侵襲能力顯著減弱，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4C）。

圖4 miR-30b-5p 對食管癌細胞增殖、侵襲、遷移能力影響Fig.4 Effects of miR-30b-5p on proliferation，invasion and migration of esophageal cancer cells

2.5 miR-30b-5p 靶向調(diào)控MKRN3 表達通過生物信息網(wǎng)站TargetScan 檢索miR-30b-5p 的靶基因，可以發(fā)現(xiàn)多種與miR-30b-5p 存在靶向關(guān)系的基因。結(jié)果顯示MKRN3 基因以原癌基因存在食管癌細胞中，并與miR-30b-5p 存在著靶向結(jié)合位點。本課題組將MKRN3 基因的3'UTR-WT 和miR-30b-5p 共轉(zhuǎn)染后，相較于NC 組，miR-30b-5p mimics 組熒光素酶活性顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。3'UTR-MUT 和miR-30b-5p共轉(zhuǎn)染后，相較于NC 組，miR-30b-5p mimics 組熒光素酶活性無明顯差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5）。這些結(jié)果說明，miR-30b-5p結(jié)合MKRN3 基因的3'UTR，進而達到抑制MKRN3 基因表達的作用。

圖5 靶基因預(yù)測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒濬ig.5 Target gene prediction and double luciferase reporter gene experiment

2.6 miR-30b-5p 抑制食管癌細胞體內(nèi)增殖能力在ECA109 和TE-13 細胞株中轉(zhuǎn)染miR-30b-5p mimic 后進行裸鼠成瘤實驗，相較于NC 組，不論是ECA109 還是TE-13 細胞株，miR-30b-5p mimic 組顯著抑制瘤體增殖（P＜0.05，圖6）。

圖6 miR-30b-5p 對食管癌細胞體內(nèi)增殖影響Fig.6 Effect of miR-30b-5p on proliferation of esophageal cancer cells in vivo

2.7 miR-30b-5p 過表達抑制食管癌細胞JAK/STAT3信號通路通過Western blot 實驗檢測JAK/STAT3信號通路關(guān)鍵蛋白。Western blot 實驗顯示，與NC 組比較，miR-30b-5p mimics 組JAK、STAT3 蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而p-JAK、p-STAT3 蛋白水平顯著下降差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見圖7）。

圖7 Western blot 檢測miR-30b-5p 對JAK/STAT3 信號通路的影響Fig.7 Western blot analysis of the influence of miR-30b-5p on the JAK/STAT3 signaling pathway

3 討論

食管癌是一種侵襲性很強的惡性腫瘤，其癌癥相關(guān)死亡率排名靠前［14-15］。我國是食管癌高發(fā)國家，全球約一半的食管癌新發(fā)病例在中國，其中食管鱗癌占90%［16］。食管癌的惡性增殖和抗凋亡是死亡的重要原因。因此，深入研究食管癌惡性表型的發(fā)病機制和具體分子機制，可為食管癌的早期診斷和預(yù)后評估提供新的可信賴的依據(jù)。miRNA 是基因表達的重要調(diào)節(jié)因子，其紊亂在癌癥中起著至關(guān)重要的作用［17］。普遍認(rèn)為miRNA腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)［18］。本研究中，我們在臨床試驗中檢測了70 對食管癌組織和配對組織樣本，以探索miR-30b-5p 的表達情況，并發(fā)現(xiàn)miR-30b-5p在食管癌中的表達下調(diào)。食管癌患者miR-30b-5p的低表達與吸煙、分化程度、腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和位置具有相關(guān)性。我們也發(fā)現(xiàn)miR-30b-5p 在食管癌細胞系中相較于食管黏膜上皮細胞也是低表達。這些研究結(jié)果均提示我們miR-30b-5p 在食管癌中可能是抑癌因素。

越來越多的研究［19-21］表明，大多數(shù)miRNA 通過抑制其表達水平來調(diào)節(jié)其靶基因。據(jù)報道，作為腫瘤抑制劑，miR-30b-5p 通過下調(diào)GNA13 的表達來調(diào)節(jié)腎癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和EMT。在結(jié)腸癌中，miR-30b-5p 通過靶向Rap1b 抑制轉(zhuǎn)移［12］。miR-30b-5p 也可以抑制肝癌細胞系的增殖和細胞周期。此外，miR-30b-5p 通過靶向LRP8 抑制肺癌進展并增強順鉑敏感性。我們的研究結(jié)果顯示，在體外實驗中miR-30b-5p 可以顯著抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在體內(nèi)實驗中，miR-30b-5p顯著抑制瘤體增殖。Makorin，環(huán)指蛋白（MKRN3，makorin ring finger protein 3）是miR-30b-5p的下游靶基因，該基因編碼的蛋白包含一個RING（C3HC4）鋅指基序和多個C3H 鋅指基序。在許多類型的癌癥中發(fā)現(xiàn)了MKRN3 的異常表達，如MKRN3 通過PABPC1 和PABPC1 介導(dǎo)的全局蛋白來調(diào)節(jié)非小細胞肺癌細胞增殖［22］。此外，MKRN3 的潛在靶點P53 可能參與MKRN2 介導(dǎo)的食管癌的發(fā)生［23］。根據(jù)我們的實驗結(jié)果，上調(diào)miR-30b-5p 表達，MKRN3表達量顯著下降。同時，熒光素酶報告基因分析的結(jié)果表明miR-30b-5p 能夠靶向作用于MKRN3的3'-UTR，抑制MKRN3 的表達。

信號通路在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。特別是JAK/STAT 信號通路的不當(dāng)激活在人類癌癥中頻繁發(fā)生，并且與癌細胞的存活、增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)［24］。最近，越來越多的證據(jù)［25-26］表明，JAK/STAT信號通路的異常參與了幾種癌癥的發(fā)生。已有研究表明，在食管癌細胞中阻斷JAK/STAT 信號通路，可明顯著抑制腫瘤細胞的侵襲遷移［27］。為了進一步探究miR-30b-5p 調(diào)控機制，我們通過蛋白印跡實驗探索miR-30b-5p 調(diào)控食管癌的作用機制。結(jié)果顯示p-JAK、p-STAT3 蛋白水平顯著下降。因此我們認(rèn)為miR-30b-5p 可能通過JAK/STAT 信號通路調(diào)控食管癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)miR-30b-5p 在食管癌組織中低表達。過表達miR-30b-5p 可以通過下調(diào)MKRN3 抑制食管癌細胞的增殖、侵襲和遷移。此過程可能通過JAK/STAT 信號通路調(diào)控食管癌的發(fā)生發(fā)展。因此，miR-30b-5p 表達可能為食管癌的臨床診療及預(yù)后評估提供重要的參考價值。但在本研究中，我們未深入分析miR-30b-5p 對食管癌患者的預(yù)后影響及只注重體外研究實驗，未對全部表型進行體內(nèi)實驗，這些都將是我們后續(xù)的研究重點。