常衛(wèi)才 陳佳偉 劉子祥 陳正民 周少波

1蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院（安徽蚌埠 233000）；2組織移植安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（安徽蚌埠 233000）

膽囊癌（gallbladder carcinoma，GBC）是影響膽囊的最常見的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤類型，病死率約1.7%，每年診斷出22 萬例膽囊癌新發(fā)病例［1］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了許多與膽囊癌發(fā)病相關(guān)的危險(xiǎn)因素［2］，如女性、年齡＞65 歲、長(zhǎng)期膽結(jié)石伴慢性膽囊炎、先天性遺傳變異、肥胖等。其中膽結(jié)石和慢性膽囊炎是膽囊癌發(fā)生發(fā)展重要的驅(qū)動(dòng)因素［3-4］。隱匿發(fā)病，進(jìn)展迅速，治療選擇有限，預(yù)后不良是膽囊癌主要臨床特點(diǎn)［5］。目前手術(shù)切除加放化療是膽囊癌唯一有望治愈的方法，但只適用于早期階段的患者，大多數(shù)患者確診時(shí)已是肝肺淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌癥晚期，失去了治愈機(jī)會(huì)［3］。近年來有研究表明乙酰肝素酶（HPSE）在膽囊癌組織中高表達(dá)，與患者的生存期短和不良預(yù)后密切相關(guān)［6］，但HPSE 影響膽囊癌侵襲、遷移表型改變的分子機(jī)制仍不清楚。

HPSE 是一種在哺乳動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的內(nèi)源性-β-葡萄糖醛酸酶，它的酶促活性可以水解切割硫酸乙酰肝素蛋白多糖的硫酸乙酰肝素（HS）側(cè)鏈，而非酶促活性可以調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，這兩方面的活性使它參與調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展的多個(gè)過程［7-8］，包括但不限于誘導(dǎo)自噬，改變腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、分化及新生血管生成等。ERK/MMP-9 信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲過程中發(fā)揮重要作用［9］。HPSE 可以調(diào)節(jié)腫瘤組織中MMP-9 的表達(dá)［10］，但涉及HPSE 與MMP-9 對(duì)膽囊癌侵襲、遷移的影響及作用機(jī)制有待研究。為此，在本研究中，我們?cè)谀懩野┘?xì)胞模型中采用慢病毒轉(zhuǎn)染方法建立HPSE 過表達(dá)和低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株，旨在明確HPSE 通過ERK/MMP-9 途徑對(duì)膽囊癌細(xì)胞的遷移侵襲的影響，并分析其內(nèi)在分子機(jī)制，以期為膽囊癌的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料人膽囊癌細(xì)胞系（GBC-SD）購自武漢普諾賽。慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（RPMI-1640）購自（北京）賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，胎牛血清購自Clark Bioscience，胰蛋白酶消化液購自Beyotime，青霉素-鏈霉素雙抗購自Biosharp，Transwell 小室購自美國康寧公司，HPSE、MMP-9、GAPDH 多克隆抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自abclonal，ERK、p-ERK 購于Proteintech；BCA 蛋白濃度定量試劑盒購自康為世紀(jì)；ERK 信號(hào)通路抑制劑SCH772984 購自MCE；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑以及PCR 引物購自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、處理及分組將膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD 置于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（RMPI-1640）中，在37 ℃和5%CO2濃度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度約80%，胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞消化脫落，1 000 r/min離心5 min；棄上清后，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移液槍重新吹打成均勻細(xì)胞懸浮液進(jìn)行傳代或種板。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的膽囊癌細(xì)胞，胰酶消化離心完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，密度調(diào)整為1 × 105/mL，將2 mL 細(xì)胞懸液接種到6 孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后按照慢病毒轉(zhuǎn)染操作說明書進(jìn)行HPSE shRNA 轉(zhuǎn)染和過表達(dá)轉(zhuǎn)染，37 ℃和5%CO2濃度條件培養(yǎng)3 d，觀察細(xì)胞熒光評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果，qRT-PCR和Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后GBC-SD 細(xì)胞中HPSE的mRNA 和蛋白表達(dá)水平。根據(jù)目的將實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組（GBC-SD）、HPSE 基因過表達(dá)組（GBCOE）及HPSE 基因敲低組（GBC-SI）。

1.2.2 Western blot 檢測(cè)HPSE、MMP-9、ERK1/2、p-ERK1/2、E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表達(dá)收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的各組膽囊癌細(xì)胞，加入添加了蛋白酶抑制劑（PMSF）的細(xì)胞裂解液（RIPA）冰上裂解，超速離心，BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，蛋白質(zhì)樣品與蛋白上樣緩沖液混合（4∶1），100 ℃、10 min 使蛋白變性，10%SDS-PAGE 電泳，使用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，脫脂奶粉封閉2 h，PVDF膜置入HPSE（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）、ERK1/2（1∶1 000）、p-ERK1/2（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）抗體中4 ℃孵育過夜，之后TBST洗膜，置入相應(yīng)的山羊抗兔二抗中室溫?fù)u床孵育2 h。TBST 再次洗膜，滴加適量的ECL 發(fā)光液，將PVDF 膜放入凝膠成像儀中曝光獲取圖像。

1.2.3 qRT-PCR 檢測(cè)HPSE、MMP-9 mRNA 表達(dá)情況首先收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段的細(xì)胞，加入Trizzol溶液，提取細(xì)胞總mRNA，然后按照cDNA 合成試劑盒說明書中的操作步驟，將mRNA 反轉(zhuǎn)為cDNA。以GAPDH 為內(nèi)參，測(cè)定HPSE mRNA 的表達(dá)水平。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中查詢到的基因序列，應(yīng)用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)目的基因引物，由上海生工生物公司合成，引物序列見表1，利用2-△△Ct法進(jìn)行了相對(duì)表達(dá)水平的測(cè)定。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequence

1.2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將其種植在24 孔的平板小室內(nèi)，在下室內(nèi)添加了含有10%的胎牛血清的完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后，4 ℃預(yù)冷的PBS 洗2 遍，晾干之后多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，再次晾干后用0.1%的結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色10 min。顯微鏡下隨機(jī)5 個(gè)部位觀察并拍照，計(jì)數(shù)取平均值平均。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力待各組細(xì)胞融合度約達(dá)80%時(shí)胰酶消化、離心，無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于6 孔板中，2 mL/孔，在37 ℃和5%CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞融合。隨后，使用200 μL 移液槍槍頭尖端在單層表面上劃痕，在培養(yǎng)0、24 h 時(shí)分別在劃痕處隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行拍照以獲取細(xì)胞遷移的圖像。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析運(yùn)用GraphPad Prism 9.0 軟件，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪制圖表，計(jì)量數(shù)據(jù)均使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來描述，使用t檢驗(yàn)或方差分析來對(duì)各組之間的均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPSE 基因過表達(dá)和RNA 干擾抑制表達(dá)效果的驗(yàn)證Western blot 和qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)基因過表達(dá)HPSE 后的膽囊癌細(xì)胞中HPSE 的蛋白和mRNA 相對(duì)表達(dá)量較陰性對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)RNA干擾抑制HPSE基因表達(dá)后的膽囊癌細(xì)胞中的HPSE mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量較陰性對(duì)照組降低（圖1）。至此，HPSE 基因過表達(dá)組（GBC-OE）和HPSE 基因敲低組（GBC-SI）膽囊癌細(xì)胞株成功建立。并用于實(shí)施后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染后膽囊癌細(xì)胞中HPSE mRNA 和蛋白表達(dá)情況Fig.1 Expression of HPSE mRNA and protein in gallbladder carcinoma cells after transfection with lentivirus

2.2 HPSE 對(duì)膽囊癌細(xì)胞行為功能學(xué)的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，HPSE 過表達(dá)組的細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)，HPSE 敲低組結(jié)果則相反，見圖2。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，HPSE 過表達(dá)組穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量顯著增多，HPSE 敲低組情況相反，見圖2。

圖2 HPSE 表達(dá)水平改變對(duì)膽囊癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響Fig.2 Effect of HPSE expression on migration and invasion ability of gallbladder carcinoma cells

2.3 HPSE 對(duì)膽囊癌細(xì)胞中MMP-9 mRNA 和蛋白表達(dá)、p-ERK 和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，HPSE 過表達(dá)組膽囊癌細(xì)胞中MMP-9 mRNA 和蛋白表達(dá)、p-ERK 及N-cadherin的蛋白表達(dá)水平呈升高改變，而E-cadherin 的蛋白表達(dá)水平呈降低改變；HPSE 敲低組MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)、p-ERK 及N-cadherin 的蛋白表達(dá)水平均呈降低改變，而E-cadherin 的蛋白表達(dá)水平呈升高改變，ERK 蛋白表達(dá)水平不受影響，見圖3。

圖3 HPSE表達(dá)水平改變后對(duì)MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)、EMT相關(guān)蛋白表達(dá)影響Fig.3 The effect of HPSE expression level on the expression of MMP-9 mRNA and protein，and the expression of EMT-related protein

2.4 HPSE 對(duì)膽囊癌細(xì)胞行為功能學(xué)影響的機(jī)制研究與HPSE 基因過表達(dá)組相比，膽囊癌細(xì)胞中HPSE 基因過表達(dá)+ERK 抑制劑組MMP-9、p-ERK、ERK、N-cadherin 的蛋白表達(dá)水平均呈降低改變，而E-cadherin 蛋白表達(dá)水平呈升高改變，見圖4。

圖4 HPSE 過表達(dá)膽囊癌細(xì)胞經(jīng)ERK 抑制劑處理后對(duì)侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of HPSE overexpression of gallbladder cancer cells on the expression of invasion migration-related proteins after treatment with ERK inhibitors

2.5 ERK 抑制劑對(duì)膽囊癌細(xì)胞行為功能學(xué)的影響與過表達(dá)組相比，膽囊癌細(xì)胞中HPSE 基因過表達(dá)+ERK 抑制劑組細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，見圖5；與過表達(dá)組相比，膽囊癌細(xì)胞中HPSE 基因過表達(dá)+ERK 抑制劑組的細(xì)胞遷移能力明顯減弱，見圖5。

圖5 ERK 抑制劑的處理顯著逆轉(zhuǎn)了了HPSE 過表達(dá)對(duì)膽囊癌細(xì)胞侵襲遷移能力的促進(jìn)作用Fig.5 Treatment with ERK inhibitor significantly reversed the promoting effect of HPSE overexpression on invasion and migration of gallbladder carcinoma cells

3 討論

膽囊癌是最常見的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤，診斷不及時(shí)和治療選擇有限是膽囊癌治愈的主要障礙［11］。近年，雖然研究技術(shù)的快速進(jìn)步為膽囊癌的治療打開了新的窗口，出現(xiàn)了諸多新穎的診療策略，如特異性靶向治療［12］、免疫治療［13］、核酸分子診斷［14］和納米粒子藥物遞送［15］等，但流行病學(xué)研究顯示膽囊癌仍是最具侵襲性、中位生存期最短的膽道系統(tǒng)腫瘤［3］。因此，迫切需要了解膽囊癌進(jìn)展的新的調(diào)控機(jī)制，以期改進(jìn)治療策略，提高患者生存期并改善預(yù)后。本研究在膽囊癌的治療方面提供了可能有價(jià)值的分子靶點(diǎn)和理論支撐。

國內(nèi)外大量研究表明，HPSE 表達(dá)水平與多種腫瘤類型的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)［16-18］。RODRIGUES 等［19］的研究顯示HPSE 在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，證明了HPSE 表達(dá)下調(diào)顯著降低N-cadherin 和Vimentin 表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。CHEN 等［20］發(fā)現(xiàn)HPSE 在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)并與患者的多腫瘤病灶、微血管侵襲和不良預(yù)后相關(guān)。HPSE 抑制劑OGT2115 處理膽囊癌細(xì)胞，結(jié)果呈劑量依賴性抑制細(xì)胞生長(zhǎng)與活性［21］。然而，HPSE 促進(jìn)膽囊癌侵襲、遷移的完整機(jī)制仍有待闡明。

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［22-23］，E-cadherin 的低表達(dá)以及N-cadherin 的高表達(dá)是EMT 發(fā)生過程中的重要分子標(biāo)志。WANG 等［24］發(fā)現(xiàn)HPSE 活化Wnt/β-catenin通路，誘導(dǎo)EMT 從而促進(jìn)胰腺癌的侵襲遷移。MASOLA 等［23］的研究證實(shí)HPSE 調(diào)節(jié)EMT 促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞侵襲遷移。ZAHAVI 等［25］采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了EMT 相關(guān)基因高表達(dá)是過表達(dá)HPSE 促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展的重要機(jī)制。我們由此推測(cè)EMT 的誘導(dǎo)是HPSE 促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞侵襲、遷移的重要步驟。另有研究表明，ERK 磷酸化與HPSE 的表達(dá)相關(guān)。在乳腺癌中，ZHANG 等［26］的研究發(fā)現(xiàn)干擾乙酰肝素酶表達(dá)降低ERK 磷酸化水平，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在肝癌中，YU等［27］的研究證明HPSE 誘導(dǎo)硫酸乙酰肝素蛋白多糖（Syndecan-1）側(cè)鏈的水解，促進(jìn)與側(cè)鏈結(jié)合的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（VEGF-C）的釋放，進(jìn)而激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，改變腫瘤微環(huán)境利于肝癌細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移。ERK 的磷酸化已被證明參與調(diào)控腫瘤進(jìn)展的多種生物學(xué)行為，如細(xì)胞增殖［28］、轉(zhuǎn)移［29］、耐藥［30］及免疫應(yīng)答［31］等。在宮頸癌HeLa 細(xì)胞中，楊利利等［32］使用右美托咪定處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)下調(diào)ERK 磷酸化水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。在肝細(xì)胞癌中，ZHAI 等［33］的研究揭示ERK 信號(hào)通路磷酸化激活后促進(jìn)癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移。MMP-9是ERK信號(hào)通路的下游分子［18，34］，是細(xì)胞外基質(zhì)重塑的重要酶類，在膽囊癌細(xì)胞中高表達(dá)，且與腫瘤的侵襲、遷移密切相關(guān)［35］。顯然，ERK/MMP-9 信號(hào)通路異?；罨閷?dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖存活、侵襲遷移［9，18，36］。

在此，為了探究HPSE 對(duì)膽囊癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響及分子機(jī)制，我們采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)過表達(dá)HPSE 基因和RNA 干擾技術(shù)敲低HPSE 基因表達(dá)，再通過嘌呤霉素抗性篩選實(shí)驗(yàn)獲得HPSE 過表達(dá)和低表達(dá)的膽囊癌穩(wěn)定細(xì)胞系。接下來進(jìn)行了Western blot 實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后膽囊癌細(xì)胞中HPSE 表達(dá)，結(jié)果顯示與GBC-SD 組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染后GBC-OE 組HPSE 蛋白和mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，GBC-SI 組情況相反。說明HPSE過表達(dá)和敲低表達(dá)的膽囊癌細(xì)胞系GBC-OE 和GBC-SI 成功構(gòu)建。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，HPSE 過表達(dá)促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞遷移、侵襲等惡性行為，而干擾HPSE 表達(dá)情況恰好相反。隨后我們采用Western blot 實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HPSE表達(dá)水平改變后可能相關(guān)的分子改變，結(jié)果與GBC-SD 組細(xì)胞相比，GBC-OE 組細(xì)胞中p-ERK、N-cadherin 蛋白及MMP-9 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著增加，而E-cadherin蛋白表達(dá)顯著減少；GBC-SI組細(xì)胞出現(xiàn)了相反的情況。提示乙酰肝素酶上調(diào)ERK 磷酸化水平，增加MMP-9 表達(dá)并促進(jìn)EMT 的發(fā)生。我們使用ERK 信號(hào)通路抑制劑SCH772984處理GBC-OE 組細(xì)胞進(jìn)一步探究這些分子改變可能的機(jī)制，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，HPSE 過表達(dá)對(duì)膽囊癌細(xì)胞侵襲遷移能力的促進(jìn)作用在添加ERK 抑制劑后明顯被逆轉(zhuǎn)，同時(shí)Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到在添加ERK 信號(hào)通路抑制劑后GBC-OE組細(xì)胞MMP-9、p-ERK和N-cadherin蛋白表達(dá)水平降低，E-cadherin 蛋白表達(dá)水平升高。因此認(rèn)為HPSE 介導(dǎo)ERK 磷酸化上調(diào)導(dǎo)致MMP-9的表達(dá)增強(qiáng)和誘導(dǎo)EMT 的發(fā)生，進(jìn)而增強(qiáng)膽囊癌細(xì)胞侵襲、遷移能力。

綜上所述，改變膽囊癌細(xì)胞中HPSE 表達(dá)水平可以調(diào)控EMT 的發(fā)生并改變細(xì)胞的遷移侵襲能力，其機(jī)制可能是HPSE 通過調(diào)控ERK/MMP-9 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究通過雙向調(diào)節(jié)HPSE 表達(dá)不僅初步證實(shí)了HPSE 是膽囊癌細(xì)胞侵襲遷移的促進(jìn)因素，還探究了其可能的分子機(jī)制，對(duì)膽囊癌發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了補(bǔ)充和豐富并為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)。但該研究尚有不足之處，目前只在細(xì)胞水平上進(jìn)行了初步的研究，后續(xù)本課題組還將繼續(xù)通過敲低和過表達(dá)等方法，對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入探討，并在整體動(dòng)物水平加以驗(yàn)證。