張玉昕,張亮亮,甘抗,朱娟芳

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 口腔醫(yī)學(xué)中心,河南 鄭州 450052)

微生物感染是影響種植體成功的主要因素,早期的微生物定植可能發(fā)生在種植體植入的手術(shù)過程中或者術(shù)后愈合的早期階段[1]。0.5%～3.0%患者的手術(shù)切口處或鄰近部位發(fā)生感染[2]。這種形成于植入術(shù)后愈合早期階段的細(xì)菌生物膜會(huì)阻止種植體表面上皮組織封閉,導(dǎo)致發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)菌黏附和增殖,危及骨結(jié)合過程,因而早期階段的細(xì)菌抑制對(duì)于植入的長(zhǎng)期成功十分重要[1,3]。晚期的微生物感染則會(huì)引發(fā)生物學(xué)并發(fā)癥,出現(xiàn)種植體周圍軟硬組織炎癥并且破壞種植體周圍已經(jīng)形成的骨結(jié)合,使種植體松動(dòng)甚至脫落。種植體周圍感染性疾病的臨床治療方案尚無定論且治療效果難以預(yù)測(cè)[4]。因此,研究者希望通過賦予種植體本身抗菌性能,阻止早期微生物的初始附著,盡量阻止晚期微生物定植和感染性生物膜的形成,從而預(yù)防種植體周圍感染性疾病的發(fā)生,實(shí)現(xiàn)種植體長(zhǎng)期穩(wěn)定。本研究擬通過在純鈦種植體表面構(gòu)建由氧化石墨烯(graphene oxide,GO)負(fù)載葡萄糖酸氯己定(chlorhexidine gluconate,CG)的抗菌活性涂層,實(shí)現(xiàn)早期藥物釋放抗菌與接觸抗菌雙重抗菌作用互補(bǔ)的效果。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

鈦片(江蘇珂潤(rùn)璽醫(yī)療科技發(fā)展有限公司)、氧化石墨烯水溶液(蘇州碳豐石墨烯科技有限公司)、葡萄糖酸氯己定水溶液(上海麥克林生化科技有限公司)、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)(日本HITACHI SU5000)、能譜(energy dispersive spectrum,EDS)分析儀(英國(guó)Oxford Instruments Ultim Max)、接觸角測(cè)定儀(上海中晨-JC2000C1)、紫外可見分光光度計(jì)(日本SHIMADZU CORPORATION)、小鼠胚胎成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)[賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司]、DAPI染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)、CCK-8試劑盒[東仁化學(xué)科技(上海)有限公司]、Calcein/PI細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)MOLECULAR DEVICES)、金黃色葡萄球菌(BNCC 186335)、大腸桿菌(BNCC 133264)。

1.2 樣本制備

將直徑10 mm、厚2 mm的四級(jí)醫(yī)用純鈦圓片噴砂酸蝕后得到Ti組樣本。Ti組樣本經(jīng)超聲蕩洗、干燥后,浸漬于5 mol·L-1的氫氧化鈉溶液中,60 ℃處理24 h,超純水蕩洗、干燥,50 g·L-1的3-氨丙基三乙氧基硅烷超聲處理2 h后,將樣本在0.2 g·L-1的GO溶液中浸泡24 h,超純水蕩洗、干燥后獲得Ti-GO組樣本。將Ti-GO組樣本平鋪浸泡于1 g·L-1的CG溶液中,4 ℃浸泡24 h,超純水蕩洗、干燥,得到Ti-GO-CG組樣本。各組樣本均雙面輻照滅菌后備用。

1.3 材料表征

對(duì)各組樣本(Ti組、Ti-GO組和Ti-GO-CG組)進(jìn)行噴金前處理,利用SEM及EDS對(duì)樣品表面進(jìn)行微觀形貌觀察和元素分析。以蒸餾水為介質(zhì),通過接觸角測(cè)定儀檢測(cè)上述3組樣本表面的接觸角并分析材料表面的親水性。

采用透析法[5]觀察Ti-GO-CG組材料表面的藥物釋放情況。將樣本放入密封離心管中,加入10 mL PBS緩沖液,置于37 ℃ 100 r·min-1的恒溫?fù)u床中。使用紫外分光光度計(jì),第1、2、3、5、7天分別采集1 mL浸提液樣本檢測(cè)吸光值(optical density,OD),繪制CG累積釋放量曲線。

1.4 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

樣本浸提液(extracting solution,ES)制作。按照1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)1.25 cm2材料表面積的比例放入密封離心管中,于37 ℃ CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置72 h,得到各組材料的浸提液備用。

配制含100 g·L-1胎牛血清和10 g·L-1雙抗的α-MEM完全培養(yǎng)液,對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。選生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的第3～5代細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

使用DAPI染色法檢測(cè)各組材料(Ti組、Ti-GO組和Ti-GO-CG組)表面細(xì)胞黏附能力。將3組樣品分別平鋪于24孔板內(nèi),每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24 h,40 g·L-1多聚甲醛固定,DAPI染色,使用倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

使用CCK-8法檢測(cè)3組材料浸提液對(duì)細(xì)胞增殖的影響。設(shè)置各組的樣本浸提液為實(shí)驗(yàn)組,記為Ti-es組、Ti-GO-es組和Ti-GO-CG-es組,以培養(yǎng)基為對(duì)照組,記為Control組。將細(xì)胞接種于96孔板內(nèi),每孔2×103個(gè),培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組各孔更換為對(duì)應(yīng)的材料浸提液,對(duì)照組加入細(xì)胞培養(yǎng)基,分別于第1、3、5天,吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基,并加入100 μL配置好的CCK-8工作液,培養(yǎng)箱中避光放置2 h,使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處OD值。

使用Calcein AM/PI試劑盒進(jìn)行細(xì)胞Live/Dead染色實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組同上述CCK-8實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種于24孔板內(nèi),每孔1×104個(gè),培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組各孔更換為對(duì)應(yīng)的浸提液,對(duì)照組使用細(xì)胞培養(yǎng)基,分別于第1、3天,吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基后每孔加入Calcein AM/PI檢測(cè)工作液,培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。使用倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

1.5 體外抗菌實(shí)驗(yàn)

挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌單克隆于10 mL液體Luria-Bertani培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)過夜,將增菌后的菌液于紫外分光光度計(jì)中測(cè)定濃度后按梯度稀釋制備成106CFU·mL-1的細(xì)菌懸液備用。

使用抑菌環(huán)法檢測(cè)各組材料(Ti組、Ti-GO組和Ti-GO-CG組)對(duì)細(xì)菌的抑制效果。取100 μL濃度為106CFU·mL-1的菌懸液添加到LB固體培養(yǎng)基平板中,涂布均勻后將3組樣品實(shí)驗(yàn)面輕貼于平板表面,培養(yǎng)24 h后觀察并采集圖像。

使用比濁法檢測(cè)材料對(duì)周圍環(huán)境中細(xì)菌的抑制效果。設(shè)置空白對(duì)照組,記為Control組,設(shè)置各組材料為實(shí)驗(yàn)組,記為Ti組、Ti-GO組和Ti-GO-CG組。24孔板中各組均加入1 mL 105CFU·mL-1的菌液,分別共培養(yǎng)24 、48 h后,使用多功能酶標(biāo)儀在600 nm處測(cè)定OD值。

使用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)各組材料(Ti組為對(duì)照組,Ti-GO組和Ti-GO-CG組為實(shí)驗(yàn)組)對(duì)細(xì)菌生物膜形成的抑制效果。樣品置于24孔板內(nèi),每孔加入1 mL 105CFU·mL-1的菌懸液,培養(yǎng)48 h。PBS緩沖液輕柔沖洗后,分別將各組樣本置于裝有1 mL PBS緩沖液的離心管中,超聲震蕩3 min,獲得分散的菌液。對(duì)此菌液進(jìn)行逐級(jí)稀釋后涂布平板,24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算抗菌率。抑菌率為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的差值占對(duì)照組的百分率。

通過SEM觀察各組材料(Ti組、Ti-GO組和Ti-GO-CG組)表面細(xì)菌生物膜的形成情況。24孔板放入3組樣品,每孔加入1 mL濃度為105CFU·mL-1的菌懸液培養(yǎng)48 h至形成生物膜,PBS緩沖液清洗,25 g·L-1戊二醛于4 ℃固定過夜,PBS緩沖液清洗,干燥,噴金,SEM觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 材料表征

2.1.1材料表面微觀形貌和元素分析

Ti組表面布滿噴砂酸蝕后的微小凹陷,Ti-GO組及Ti-GO-CG組樣本表面可見一層均勻的薄膜狀物質(zhì)覆蓋在基底的凹陷形貌上,且出現(xiàn)堆疊的褶皺(圖1A)。Ti-GO組較Ti組出現(xiàn)Si波峰,且C、O含量增加,Ti含量降低;在GO涂層的基礎(chǔ)上,Ti-GO-CG組出現(xiàn)了CG特征元素Cl的波峰(圖1B)。

A圖為SEM下材料表面微觀形貌;B圖為EDS下元素分析。

2.1.2材料表面接觸角

Ti組、Ti-GO組和Ti-GO-CG組表面的接觸角分別為118.02°±4.09°、55.67°±0.26°、19.82°±1.67°,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 135.325,P<0.001)。兩兩比較,Ti-GO-CG組表面接觸角小于Ti組和Ti-GO組,Ti-GO組小于Ti組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.1.3體外藥物釋放

CG標(biāo)準(zhǔn)溶液在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的掃描曲線中測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為254 nm(圖2A)。以CG標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2B)。CG水溶液在濃度為50～400 mg·L-1的檢測(cè)范圍內(nèi),其吸光度值與溶液濃度間為較規(guī)律的線性關(guān)系,y=0.002 5x+0.175(R2=0.967 8),其中x為CG溶液的濃度,y為吸光度。材料表面的CG在24 h達(dá)到了128 μg的累積釋藥量,然后呈現(xiàn)出低劑量的緩慢持續(xù)釋放,至第5～7天時(shí)釋藥量明顯下降(圖2C)。

A圖為CG掃描曲線;B圖為CG標(biāo)準(zhǔn)曲線;C圖為藥物釋放曲線。

2.2 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

2.2.1DAPI染色

Ti-GO組和Ti-GO-CG組樣本表面黏附的細(xì)胞數(shù)明顯多于Ti組。見圖3。

圖3 樣本表面黏附細(xì)胞的DAPI染色

2.2.2CCK-8法

各組鈦樣本浸提液細(xì)胞培養(yǎng)1、3、5天,OD值均逐漸增加;第1天各組細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),第3、5天Ti-GO-CG-es組有抑制細(xì)胞增殖的現(xiàn)象,但抑制效果不明顯,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞毒性

2.2.3Live/Dead染色

第1、3天各組細(xì)胞大量存活(綠色熒光),僅觀察到少量死亡細(xì)胞(紅色熒光)。見圖5。

A圖為染色后第1天;B圖為染色后第3天。

2.3 體外抗菌實(shí)驗(yàn)

2.3.1抑菌環(huán)

金黃色葡萄球菌和大腸桿菌平板上僅Ti-GO-CG組周圍可見明顯的抑菌環(huán)。見圖6。

A圖為金黃色葡萄球菌;B圖為大腸桿菌

2.3.2比濁法

Ti-GO-CG組在24 、48 h均出現(xiàn)細(xì)菌增殖抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且24、48 h測(cè)得的OD值基本不變。而其他3組對(duì)菌液中的細(xì)菌增殖無抑制效果,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖7。

A圖為金黃色葡萄球菌;B圖為大腸桿菌。

2.3.3平板計(jì)數(shù)法

Ti-GO組對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌率分別為(33.27±4.90)%、(34.98±4.41)%,低于Ti-GO-CG組對(duì)金黃色葡萄球菌[(99.05±0.52)%]和大腸桿菌[(95.45±0.25)%]的抗菌率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖8。

A圖為金黃色葡萄球菌;B圖為大腸桿菌。

2.3.4SEM觀察

Ti組中,金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌落密集,細(xì)菌形態(tài)清晰,胞膜完整,分別呈光滑球形和棒狀。Ti-GO組菌落數(shù)量明顯減少,細(xì)菌和GO膜直接接觸而萎縮死亡(紅色箭頭所示),其他堆積狀態(tài)下不直接接觸GO膜的細(xì)菌狀態(tài)尚可。Ti-GO-CG組表面基本無菌落附著,偶爾可見單個(gè)菌落存在,細(xì)菌萎縮變形(紅色箭頭所示)。見圖9。

A圖為金黃色葡萄球菌;B圖為大腸桿菌。

3 討論

為制備有良好抗菌活性表面的種植體材料,本研究通過堿熱處理、硅烷化處理和浸漬法在純鈦表面制備GO-CG涂層,并通過涂層材料表征、體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和抗菌實(shí)驗(yàn)對(duì)該涂層材料進(jìn)行了研究,成功制備了鈦種植體表面抗菌涂層。

使用酸蝕和堿處理能夠在材料上制備具有微米、亞微米和納米混合特征的結(jié)構(gòu)表面,并且被證實(shí)可改善材料的骨誘導(dǎo)和骨結(jié)合效果[6-9]。硅烷偶聯(lián)劑廣泛用于含羥基材料表面與生物分子的偶聯(lián)[10-11],可以共價(jià)連接多肽、蛋白質(zhì)和聚合物等各種分子。本研究中先將鈦片噴砂酸蝕處理模擬臨床使用,后用堿熱處理的方式使材料表面獲得大量OH。硅烷化處理材料表面,使GO可以通過與3-氨丙基三乙氧基硅烷形成共價(jià)鍵在鈦表面實(shí)現(xiàn)涂敷,并且獲得的GO涂層能充分嵌入到鈦的多孔結(jié)構(gòu)當(dāng)中,超聲振動(dòng)下未產(chǎn)生分離,這樣的嵌入性結(jié)構(gòu)可以降低該涂層在種植體植入時(shí)因扭矩而被動(dòng)脫落的風(fēng)險(xiǎn)。材料表面形成的GO薄膜又可以實(shí)現(xiàn)對(duì)CG的吸附,使CG完成在材料表面的負(fù)載。

本研究通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)Ti-GO組和Ti-GO-CG組材料表面出現(xiàn)了明顯的均勻薄膜狀物質(zhì)的覆蓋以及堆疊褶皺,結(jié)合EDS結(jié)果,Ti-GO-CG材料較Ti組C、O元素含量增加,Ti含量降低且出現(xiàn)CG的特征元素Cl的峰,證明GO負(fù)載的CG涂層成功涂敷。水接觸角反映固體表面的表面能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該涂層改善了材料表面的親水性,可以為細(xì)胞黏附增殖的良好狀態(tài)提供基礎(chǔ),也說明CG成功負(fù)載。體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),涂層表面的CG雖然出現(xiàn)了藥物緩釋涂層常見的早期突釋現(xiàn)象,但持續(xù)緩慢釋放5～7 d。

表面改性在賦予種植體功能表面的同時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞毒性不容忽視。特定的情況下石墨烯材料有良好的生物相容性,能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和種植體的骨結(jié)合[12]。但是不同種類的石墨烯材料的形態(tài)以及大小都對(duì)細(xì)胞有不同的影響,大部分表現(xiàn)出細(xì)胞毒性[13-15]。同樣,CG材料也有著劑量依賴的細(xì)胞毒性[16]。只有選擇合適的合成方式、劑量等才能實(shí)現(xiàn)生物安全的效果。本研究中制備的鈦表面涂層促進(jìn)了MC3T3-E1細(xì)胞在材料表面的黏附,這與接觸角實(shí)驗(yàn)中親水性的提高的結(jié)果相符合,并且本研究的Ti-GO-CG涂層材料浸提液未明顯導(dǎo)致MC3T3-E1細(xì)胞的增殖抑制及死亡。

金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在手術(shù)切口區(qū)域的感染中十分常見[2]。金黃色葡萄球菌對(duì)鈦有特殊的親和力,是化膿性種植體周圍炎的主要病原菌[17]。GO能夠通過穿透和刺破細(xì)菌細(xì)胞膜、包裹誘導(dǎo)機(jī)械應(yīng)力、從細(xì)菌細(xì)胞膜中提取磷脂以及產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)等方式對(duì)細(xì)菌造成不可逆的損傷[18-22]。CG具有廣譜且高效的抗菌性能,低濃度CG作為一種細(xì)胞膜活性成分,引起G+和G-細(xì)菌胞內(nèi)K+和戊糖的外流;高濃度CG通過使蛋白和核酸沉淀導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁不可逆的損傷[16]。本研究將二者聯(lián)合運(yùn)用后發(fā)現(xiàn), GO-CG涂層具備良好的抗菌效果,具有接觸殺滅和釋放殺滅的雙重抗菌作用。平板計(jì)數(shù)法和SEM結(jié)果顯示,GO涂層對(duì)直接接觸的細(xì)菌有抗菌作用,但是抗菌率較低。GO-CG涂層在各實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出良好的抗菌效果,既可以明顯抑制細(xì)菌在材料表面的黏附,抑制材料表面生物膜的形成,且其可以溶解于種植體周圍血液及體液中,使局部CG濃度升高,對(duì)周圍環(huán)境產(chǎn)生抑菌作用。GO成功負(fù)載CG后,抗菌性能得到提升,與單純GO的抗菌作用形成互補(bǔ),有效抑制細(xì)菌生物膜的形成。

4 小結(jié)

利用GO負(fù)載CG可以在鈦種植體表面成功構(gòu)建抗菌涂層,制備的Ti-GO-CG涂層材料無細(xì)胞毒性,同時(shí)具備良好的抗菌性能。本研究仍存在不足之處,由于人體口腔內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜,種植體材料在植入手術(shù)中因扭力造成的磨損,在體內(nèi)環(huán)境中形成的腐蝕,以及該材料對(duì)成骨相關(guān)過程是否產(chǎn)生影響等問題都有待進(jìn)一步研究。