王冬納?何淑明

【摘要】目的 研究大腸埃希菌感染誘導(dǎo)陰道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制。方法 制備大腸埃希菌刺激陰道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，采用RNA測(cè)序（RNA-Seq）獲取對(duì)照組和大腸埃希菌刺激組間的差異表達(dá)基因譜，進(jìn)而使用生物信息學(xué)分析差異表達(dá)基因的富集信號(hào)通路，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。結(jié)果 在對(duì)照組和大腸埃希菌刺激組間共發(fā)現(xiàn)4 899個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)和下調(diào)基因分別為1 531和 3 368個(gè)?；虮倔w論（GO）分析顯示，其功能富集在生物學(xué)行為控制模塊的血小板衍生生長(zhǎng)因子結(jié)合和輔助因子結(jié)合、細(xì)胞組成模塊的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶復(fù)合物，以及分子功能模塊的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白方面。京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析顯示這些基因富集于39條信號(hào)通路，如核因子-κB（NF-κB）通路。RT-qPCR結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果一致，證實(shí)大腸埃希菌刺激組細(xì)胞TNF-α表達(dá)上調(diào)（P < 0.05）。結(jié)論 TNF-α調(diào)控NF-κB信號(hào)通路可能是大腸埃希菌誘導(dǎo)陰道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)關(guān)鍵分子機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】RNA測(cè)序；大腸埃希菌；需氧菌性陰道炎；炎癥反應(yīng)

Molecular mechanism of Escherichia coli-induced inflammatory response in vaginal epithelial cells using RNA-Seq analysisWang Dongna△， He Shuming. △The Second School of Clinical Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510280， China

Corresponding author， He Shuming， E-mail： 756497548@qq.com

【Abstract】Objective To investigate the molecular mechanism of inflammatory response in vaginal epithelial cells induced by Escherichia coli infection. Methods An inflammatory response model in vaginal epithelial cells stimulated by Escherichia coli was established. Then， differentially-expressed gene profiles between the control and Escherichia coli stimulation groups were obtained by RNA sequencing （RNA-Seq）. The enrichment signaling pathways of differentially-expressed genes were identified by bioinformatic analysis. The sequencing results were validated by quantitative fluorescent real-time PCR （RT-qPCR）. Results A total of 4899 differentially-expressed genes were found between the control and the Escherichia coli stimulation groups， including 1531 up-regulated genes and 3368 down-regulated genes. Gene Ontology （GO） showed that the functions of differentially-expressed genes were dominantly enriched in platelet-derived growth factor binding and co-receptor binding in the biological process term， endoplasmic reticulum chaperone complex in the cellular component term and protein folding in endoplasmic reticulum in the molecular functional term， respectively. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） showed that these differentially-expressed genes were enriched in 39 signaling pathways， such as the NF-κB signaling pathway. The upregulation of differentially-expressed gene TNF-α was validated by RT-qPCR （P < 0.05）， which was consistent with the RNA-Seq results. Conclusion TNF-α regulating the NF-κB signaling pathway is a critical molecular mechanism of Escherichia coli-induced inflammatory response in vaginal epithelial cells.

【Key words】RNA sequencing； Escherichia coli； Aerobic vaginitis； Inflammatory response

需氧菌性陰道炎與胎兒感染、性交困難和早產(chǎn)有關(guān)，是育齡婦女最常見的生殖道感染之一。目前，臨床上對(duì)于需氧菌性陰道炎治療主要采取抗菌治療、益生菌以及局部雌激素治療等，尚未達(dá)成最佳治療方案共識(shí)，其發(fā)病分子機(jī)制及干預(yù)靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究［1］。需氧菌性陰道炎的發(fā)生與陰道菌群失調(diào)有關(guān)。陰道失去以乳酸菌為主的菌群生態(tài)，出現(xiàn)異常陰道菌群，其中以大腸埃希菌最為常見，占比7.5%；其他菌群次之，如金黃色葡萄球菌占4.5%［2-3］。宋伶俐等［4］研究也表明，需氧菌性陰道炎中以大腸埃希菌為最多見的需氧菌。需氧菌性陰道炎表現(xiàn)為明顯的陰道炎癥和陰道上皮破壞。異常需氧菌明顯增加與陰道炎癥密切相關(guān)。研究表明，需氧菌性陰道炎患者陰道IL-1β和IL-10升高［5］。人陰道上皮細(xì)胞在大腸埃希菌刺激下，VK2/E6E7的Toll樣受體2（TLR2）、TLR4和核因子-κB（NF-κB）表達(dá)上調(diào)，表明需氧菌性陰道炎常見致病菌可刺激陰道上皮細(xì)胞釋放炎癥因子［6］。然而，需氧菌性陰道炎的炎癥反應(yīng)分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究采用RNA測(cè)序（RNA-Seq）技術(shù)，研究大腸埃希菌刺激陰道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的差異表達(dá)基因譜，并采用生物信息學(xué)手段分析差異表達(dá)基因功能和參與調(diào)控信號(hào)通路，為治療需氧性陰道炎的非抗菌性措施提供潛在干預(yù)靶點(diǎn)。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)及處理

人陰道上皮細(xì)胞VK2/E6E7細(xì)胞由廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司提供。采用添加胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國(guó)）和雙抗（青霉素和鏈霉素，100 U/mL，天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，中國(guó)）的Keratinocyte-sFM（Thermo Fisher公司，美國(guó)）在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)過夜后，隨機(jī)分為對(duì)照組（Con組）和大腸埃希菌感染組（E. coli I組）。

E. coli I組加入大腸埃希菌（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，中國(guó)）與細(xì)胞共孵育24 h，同時(shí)Con組加入等量生理鹽水。大腸埃希菌的感染復(fù)數(shù)為100。

二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)

細(xì)胞處理結(jié)束后，采用高純度總RNA快速提取試劑盒（BIOTEKE，中國(guó)）提取總RNA和HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒（Vazyme，中國(guó)）

進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。然后采用HieffTM qPCRSYBR? Green Master Mix試劑盒［翊圣生物科技（上海）股份有限公司，中國(guó)］準(zhǔn)備20 μL反應(yīng)體系：ddH2O 7.4 ?L，

SYBR反應(yīng)預(yù)混液10 ?L，模板DNA 1 ?L和引物

1.6 ?L。qPCR在熒光定量PCR儀（杭州博日科技有限公司，中國(guó)）上進(jìn)行，反應(yīng)參數(shù)為：預(yù)變性94 ℃，

1 min；40個(gè)循環(huán)（變性94 ℃ 15 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 20 s）。引物序列為：IL-1β（產(chǎn)物長(zhǎng)度為118 bp），正向5′-CCTATGTCTTGCCCGTGGAG-3′，反向5′-CACACACTAGCAGGTCGTCA-3′；IL-6（產(chǎn)物長(zhǎng)度為

175 bp），正向5′-TGGAAATGAGAAAAGAGTTGTGC-3′， 反向5′-CGGAACTCCAGAAGACCAGA-3′；TNF-α（產(chǎn)物長(zhǎng)度為144 bp），正向5′-CTGAACTTCGGGGTGATCGG-3′，反向5′-GTTTGCTACGACGTGGGCTA-3′；ACTB（產(chǎn)物長(zhǎng)度為171 bp），正向5′-AAGATCAAGATCATTGCTCCTCCT-3′，反向5′-AGCTCAGTAACAGTCCGCCT-3′。

三、RNA-Seq

RNA-Seq由廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司完成?；玖鞒倘缦拢翰捎肦Neasy Mini Kit（QIAGEN，中國(guó)）提取對(duì)照組和大腸埃希菌感染組細(xì)胞的總RNA。在確定RNA總量和完整性符合標(biāo)準(zhǔn)后，采用磁珠富集mRNA并對(duì)mRNA片段化。然后采用VAHTS mRNA-Seq V3 Library Prep Kit for Illumina（Vazyme，中國(guó)）構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)。經(jīng)過純化和PCR擴(kuò)增后，在Illunima Novaseq 6000 高通量測(cè)序儀進(jìn)行PE150測(cè)序，下機(jī)得到樣本的Fastq格式的堿基序列。

四、生物信息學(xué)分析

完成上述RNA-Seq后，將所獲取的原始測(cè)序數(shù)據(jù)采用Fsatp軟件過濾。過濾處理后，采用FastQC（v0.11.5）去除低質(zhì)量和拼頭序列，獲得清潔reads，采用bowtir2軟件（v2.2.9）去除殘留核糖體RNA（rRNA）和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）序列；過濾后的reads采用HIASAT2軟件（2.2.1）比對(duì)該物種的參考基因組，定位每條reads的位置；采用StringTie軟件（v2.1.5）對(duì)每個(gè)reads所在基因位置計(jì)數(shù)并將所有樣本結(jié)果合并。使用DESeq2軟件（1.30.1）進(jìn)行組件差異分析，獲取差異表達(dá)基因譜，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號(hào)通路富集分析。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22.0分析研究數(shù)據(jù)。經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，定量資料均符合正態(tài)分布，以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、大腸埃希菌刺激引導(dǎo)陰道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)

大腸埃希菌刺激24 h后，Con組和E. coli I組VK2/E6E7細(xì)胞中炎癥因子（IL-6和IL-1β）mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05），提示大腸埃希菌誘導(dǎo)了陰道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。見圖1。

二、測(cè)序質(zhì)量評(píng)價(jià)

樣品經(jīng)高通量測(cè)序后，Con組樣本1和樣本2得到讀序（reads總數(shù)分別為5.713×107條和5.451×107條），采用Fsatp軟件過濾后，得到高質(zhì)量的干凈reads分別為5.675×107條和5.41×107條。E. coli I組樣本1和樣本2得到reads總數(shù)分別為5.342×107條和5.607×107條，過濾后分別得到5.308×107條和5.574×107條。所有樣品過濾后堿基總數(shù)占過濾前堿基總數(shù)的百分比均在98%以上。所有樣品過濾前和過濾后的質(zhì)量值20（Q20）和質(zhì)量值30（Q30）均大于90%。將過濾后reads進(jìn)行核糖體和基因組比對(duì)。去除rRNA和tRNA的reads數(shù)后得到最終reads，所有樣品的最終reads占干凈reads百分比均大于99%，而基因組比對(duì)匹配reads的百分比均在97%以上。以上結(jié)果表明本研究獲取了高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)，為后續(xù)RNA-Seq分析提供保障。

三、差異表達(dá)基因分析

Con組和E. coli I組間共有4 899個(gè)差異表達(dá)基因。其中，上調(diào)基因1 531個(gè)（包括NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因），下調(diào)基因3 368個(gè)（包括囊性纖維化調(diào)節(jié)因子CFTR）。差異表達(dá)基因的火山圖和熱力圖見圖2A、B。

排在上調(diào)基因的前9位依次為TNF-α誘導(dǎo)蛋白6（TNFIP6）、蛇毒素1（VNN1）、蛇毒素3（VNN3）、卵透明帶糖蛋白（ZP4）、TRIM6-TRIM34、LOC105377989、LOC105377991、LOC107986515和水解酶結(jié)構(gòu)域16B（ABHD16B），而Top10的下調(diào)基因分別為Gamma-丁基甜菜堿羥化酶1（BBOX1）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5（IGFBP5）、LOC105378231、Neurofilament Medium Chain（NEFM）、激肽素相關(guān)肽酶2（KLK2）、激肽素相關(guān)肽酶8（KLK8）、醛酮還原酶家族1成員B10（AKR1B10）、富亮氨酸重復(fù)神經(jīng)元1（LRRN1）和磷脂酶A2 四類（ⅣF，即PLA2G4F）。見圖3。

四、差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

1. GO富集分析

GO功能性富集分析結(jié)果見圖4A，該結(jié)果顯示差異表達(dá)基因在生物行為調(diào)控（BP）板塊主要富集在血小板衍生生長(zhǎng)因子結(jié)合和輔助因子結(jié)合等；在細(xì)胞組成（CC）模塊主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶復(fù)合體和寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體等；而在分子功能（MF）模塊則主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白和前列腺芽形成等。

2. KEGG富集分析

KEGG富集分析顯示差異表達(dá)基因富集的信號(hào)通路共計(jì)39條，前25條包括氮代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、蛋白輸出、鞘磷脂生物合成——乳酸和新乳酸系列、PI3K-Akt信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和p53信號(hào)通路。NF-κB信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。見圖4B。28個(gè)差異表達(dá)基因參與調(diào)控NF-κB信號(hào)通路。上調(diào)差異表達(dá)基因TNF-α在NF-κB信號(hào)通路的上游，通過信號(hào)級(jí)聯(lián)激活NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)一步促進(jìn)TNF-α和其他炎癥因子釋放，如IL-1β，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

五、大腸埃希菌刺激對(duì)人陰道上皮細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，大腸埃希菌刺激人陰道上皮細(xì)胞后，TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了RNA-Seq測(cè)序結(jié)果。見圖5。

討論

RNA-Seq技術(shù)能全面獲取生物樣本幾乎全部轉(zhuǎn)錄本序列信息，為篩選疾病相關(guān)候選基因的重要手段。本研究首次通過RNA-Seq技術(shù)分析大腸埃希菌誘導(dǎo)人陰道細(xì)胞炎癥反應(yīng)的基因表達(dá)譜，結(jié)合生物信息學(xué)分析揭示差異表達(dá)基因的潛在生物學(xué)功能及其參與的信號(hào)通路。測(cè)序結(jié)果顯示，E. coli I組和Con組陰道上皮細(xì)胞間共有4 899個(gè)差異表達(dá)基因，其中下調(diào)基因占多數(shù)（3 368個(gè)），上調(diào)基因?yàn)? 531個(gè)。GO和KEGG分析顯示這些差異表達(dá)基因主要富集于39條信號(hào)通路，與多個(gè)細(xì)胞生物行為調(diào)控、細(xì)胞組成和分子功能密切相關(guān)。

炎癥反應(yīng)是需氧菌性陰道炎的主要特征之一。NF-κB信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［7］。研究表明，細(xì)菌性陰道炎大鼠陰道組織中TNF-α升高，NF-κB信號(hào)通路被激活，抑制該通路可改善陰道炎癥狀［8-9］。本研究顯示總計(jì)28個(gè)差異表達(dá)基因參與調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，其中絕大部分為上調(diào)。KEGG信號(hào)通路圖可見TNF-α在NF-κB信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，它為該信號(hào)通路的關(guān)鍵上游基因之一，通過激活NF-κB而進(jìn)一步促進(jìn)TNF-α釋放，形成惡性循環(huán)，加重炎癥反應(yīng)。本研究通過RT-qPCR驗(yàn)證了測(cè)序結(jié)果，即大腸埃希菌刺激上皮細(xì)胞炎癥促進(jìn)TNF-α基因表達(dá)。李會(huì)陽(yáng)［6］研究也表明，大腸埃希菌刺激促進(jìn)VK2/E6E7細(xì)胞的IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)，激活NF-κB信號(hào)通路。因此，NF-κB信號(hào)通路可能為治療大腸埃希菌相關(guān)需氧菌性陰道炎提供治療靶點(diǎn)。

在排名前9位的上調(diào)基因當(dāng)中，TNFIP6在蛋白酶網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，與α間抑制蛋白（I alpha I）形成穩(wěn)定復(fù)合物，增強(qiáng)I alpha I的蛋白酶抑制活性。TNF-α和IL-1等炎癥因子可誘導(dǎo)TNFIP6表達(dá)，與骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生密切相關(guān)［10-11］。本研究顯示，差異表達(dá)基因富集于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎信號(hào)通路，進(jìn)一步提示TNF-α在大腸埃希菌誘導(dǎo)人陰道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)扮演重要角色。目前尚未有研究表明TNFIP6是否參與需氧菌性陰道炎的炎癥反應(yīng)，有待深入研究探討。

研究顯示，毛滴蟲感染下調(diào)人陰道內(nèi)皮細(xì)胞CFTR表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氯離子聚集，與滴蟲誘發(fā)陰道炎癥和免疫反應(yīng)密切相關(guān)［12］。本研究顯示，CFTR為下調(diào)差異表達(dá)基因之一。CFTR通過增強(qiáng)TNF 1型相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TRADD），從而抑制TNF-α介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路激活［13］。CFTR是否能成為干預(yù)需氧菌性陰道炎的靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究揭示。

本研究通過RNA-Seq高通量測(cè)序，闡明大腸埃希菌刺激人陰道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)與對(duì)照細(xì)胞的差異表達(dá)基因譜及其潛在生物學(xué)功能與參與調(diào)控的信號(hào)通路，為進(jìn)一步闡明大腸埃希菌介導(dǎo)的需氧菌性陰道炎的分子機(jī)制提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究結(jié)果初步揭示CFTR及TNF-α等多個(gè)環(huán)節(jié)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路是大腸埃希菌誘導(dǎo)陰道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)關(guān)鍵分子機(jī)制。其他差異表達(dá)基因及相應(yīng)信號(hào)通路在需氧菌性陰道炎中的作用有待今后研究進(jìn)一步闡明。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ 程薇， 周新娥. 需氧菌性陰道炎的病因、診斷及治療進(jìn)展. 海南醫(yī)學(xué)， 2020， 31（4）： 523-528.

［2］ 李文娟， 周宇麒， 馮定云， 等. 成人腸桿菌科菌血癥病原菌的臨床分布及耐藥性分析. 新醫(yī)學(xué)， 2020， 51（1）：42-47.

［3］ Prasad D， Parween S， Kumari K， et al. Prevalence， etiology， and associated symptoms of vaginal discharge during pregnancy in women seen in a tertiary care hospital in Bihar. Cureus， 2021， 13（1）： e12700.

［4］ 宋伶俐， 張麗麗， 吳海波， 等. 需氧性陰道炎的菌群分布和耐藥性分析. 北華大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2021， 22（1）： 93-96.

［5］ Budilovskaya O V， Shipitsina E V， Spasibova E V， et al. Differential expression of local immune response genes in the vagina： implication for the diagnosis of vaginal infections. Bull Exp Biol Med， 2020， 168（5）： 646-650.

［6］ 李會(huì)陽(yáng). TLR2/4/NF-κB信號(hào)通路及下游細(xì)胞因子在需氧菌性陰道炎致病中的作用研究. 天津： 天津醫(yī)科大學(xué)， 2019.

［7］ 王嘉睿， 吳永祥， 劉金來(lái). AMPK/SIRT1/NF-κB通路在糖尿病心肌病中的作用. 新醫(yī)學(xué)， 2017， 48（10）： 677-682.

［8］ 蔣麗， 葉世蕓， 鄭立肯，等. 基于Nrf-2/HO-1/NF-κB通路探討苦參膜對(duì)混合細(xì)菌性陰道炎大鼠的治療作用. 中藥藥理與臨床， 2022， 38（3）： 127-134.

［9］ Kim D E， Kim J K， Han S K， et al. Lactobacillus plantarum NK3 and Bifidobacterium longum NK49 alleviate bacterial vaginosis and osteoporosis in mice by suppressing NF-κB-linked TNF-α expression. J Med Food， 2019， 22（10）： 1022-1031.

［10］ Fu?lo?p C， Sza?nto? S， Mukhopadhyay D， et al. Impaired cumulus mucification and female sterility in tumor necrosis factor-induced protein-6 deficient mice. Development， 2003， 130（10）： 2253-2261.

［11］ Sza?nto? S， Bárdos T， Gál I， et al. Enhanced neutrophil extravasation and rapid progression of proteoglycan-induced arthritis in TSG-6-knockout mice. Arthritis Rheum， 2004， 50（9）： 3012-3022.

［12］ Xu J B， Lu S J， Ke L J， et al. Trichomonas vaginalis infection impairs anion secretion in vaginal epithelium. PLoS Negl Trop Dis， 2021， 15（4）： e0009319.

［13］ Wang H， Cebotaru L， Lee H W， et al. CFTR controls the activity of NF-κB by enhancing the degradation of TRADD. Cell Physiol Biochem， 2016， 40（5）： 1063-1078.

（收稿日期：2023-05-08）

（本文編輯：林燕薇）