王超 郭春梅 程紅新 史延通

【摘要】目的：采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法建立同時(shí)測(cè)定藤黃藥材中藤黃酸、轉(zhuǎn)位藤黃酸、藤黃酸B、異藤黃酸、新藤黃酸5種成分的含量。方法：藤黃藥材經(jīng)75%乙醇水超聲提取，以ZORBAX Eclipse Plus C18為色譜柱、0.1%甲酸水-乙腈（30∶70，V/V）為流動(dòng)相，流速為0.4 mL/min，柱溫為35℃；質(zhì)譜采用電噴霧離子（ESI）源、正離子掃描的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行定量分析。結(jié)果：藤黃酸、轉(zhuǎn)位藤黃酸、藤黃酸B、異藤黃酸、新藤黃酸分別在51.00～1020、3.749～74.98、8.675～ 173.5、60.00～1200、47.95～959 ng/mL（r均大于0.9990）的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。5種成分的平均加樣回收率分別為97.2%、98.1%、97.9%、97.0%、99.3%，RSD分別為2.1%、2.1%、2.3%、1.9%、2.1%。藤黃藥材中上述5種成分含量分別為22.98%～ 23.63%、1.28%～1.35%、2.78%～2.89%、26.13%～26.54%、22.29%～22.40%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，可用于藤黃藥材的多指標(biāo)成分定量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；藤黃；含量測(cè)定

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.03.033

Simultaneous Determination of Contents of 5 Components in Gamboge by UPLC-MS/MS

WANG Chao，GUO Chunmei，CHENG Hongxin，SHI Yantong

（Liaoning Institute for Drug Control，Liaoning Shenyang 110036，China）

Abstract：Objective：To establish an ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS / MS）method for the simultaneous determination of Gambogic acid，Gambogellic acid，Morellic acid，Isogambogic acid and Gambogenic acid in Gamboge. Methods：Gamboge was extracted by ultrasonic extraction with 75% ethanol-water. The determination was performed on ZORBAX Eclipse Plus C18 column with mobile phase consisted of 0.1 % formic acid solution-acetonitrile（30∶70，V/V）at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was 35℃. For quantitation，the electrospray ionization（ESI）source was applied to carry out the positive ion scanning with multiple reaction monitoring（MRM）mode. Results：The linear range of Gambogic acid，Gambogellic acid，Morellic acid，Isogambogic acid and Gambogenic acid were 51.00～1020、3.749～74.98、8.675～173.5、60.00～1200、47.95～959 ng/ mL（all r≥0.9990）respectively，which showed a good linear relationship within the concentration range. The average recoveries were 97.2 %，98.1 %，97.9 %，97.0 %，99.3 %，and RSDs were 2.1%，2.1%，2.3%，1.9%，2.1%，respectively. The content of the above five components were 22.98%～23.63%、1.28%～1.35%、2.78%～2.89%、26.13%～26.54%、22.29%～22.40%，respectively. Conclusion：The method issimple，accurate and reliable，which could be used as the quantitative determination of multiple index components of Gamboge.

Key words：UPLC-MS/MS；gamboge；content determination

藤黃為藤黃科藤黃屬植物藤黃Garcinia hanburyi Hook. f.的樹(shù)脂[1]，最早出自《海藥本草》，現(xiàn)收錄于《中藥大辭典》[2]。藥理學(xué)研究表明，藤黃具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒等作用[3-7]，藤黃酸和新藤黃酸等成分是藤黃的主要成分[8-9]。目前，關(guān)于藤黃含量測(cè)定的研究文獻(xiàn)報(bào)道較少[10-11]，因此有必要建立一種藤黃中多組分的同時(shí)含量測(cè)定方法。

UPLC-MS/MS（超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜）法是以超高效液相作為分離系統(tǒng)、質(zhì)譜作為檢測(cè)系統(tǒng)的分析技術(shù)，該分析技術(shù)將超高效液相高分離度的優(yōu)勢(shì)與質(zhì)譜高靈敏度的特性相結(jié)合，具備分離能力強(qiáng)，分析時(shí)間短，靈敏度高，專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于中藥材的定性定量分析。本研究基于UPLCMS/MS技術(shù)建立了同時(shí)測(cè)定藤黃中藤黃酸、轉(zhuǎn)位藤黃酸、藤黃酸B、異藤黃酸、新藤黃酸5種成分含量的方法，以期為藤黃藥材質(zhì)量控制及應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器

超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Xevo TQ，美國(guó)Waters公司）；電子天平（XP26，瑞士METTLER TOLEDO公司）；超純水儀（Milli-Q Advantage A10，美國(guó)Millipore公司）；超聲清洗器（AS3120A，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2材料

藤黃酸（批號(hào)111966-201401）來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；轉(zhuǎn)位藤黃酸（批號(hào)10594）來(lái)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；藤黃酸B（批號(hào)J15 GB 150695）來(lái)自上海源葉生物科技有限公司；異藤黃酸（批號(hào)CFS202001）、新藤黃酸（批號(hào)CFS202002）來(lái)自武漢天植生物技術(shù)有限公司；藤黃對(duì)照藥材（編號(hào)S-01～S-05，批號(hào)121215-200602）來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；色譜純甲醇、色譜純乙腈、色譜純乙醇（德國(guó)Merck公司）；質(zhì)譜級(jí)甲酸（美國(guó)Sigma公司）。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1×100 mm 1.8-Micron）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水-乙腈（30∶70，V/V）；流速為0.4 mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為2μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子（ESI）源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；毛細(xì)管電壓為3.0 kV；脫溶劑溫度為550℃；錐孔氣流速為50 L/Hr；脫溶劑氣流速為850 L/Hr；碰撞氣流速為0.15 mL/min；碰撞氣為氬氣；其他參數(shù)見(jiàn)表1。

1.3.3對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱取藤黃酸、轉(zhuǎn)位藤黃酸、藤黃酸B、異藤黃酸、新藤黃酸對(duì)照品適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解后，加甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度分別為藤黃酸510.0μg/ mL、轉(zhuǎn)位藤黃酸499.9μg/mL、藤黃酸B 399.9μg/mL、異藤黃酸479.4μg/mL、新藤黃酸433.7μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述各單一對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇配制為上述成分質(zhì)量濃度依次為10.20、0.7498、12.00、0.959、1.735μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.4供試品溶液的制備

取藤黃藥材約5 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加75%乙醇水80 mL，浸泡5 min，超聲處理10 min，放冷至室溫，用75%乙醇水定容，搖勻，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液0.5 mL，置于50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2結(jié)果與分析

2.1色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過(guò)全掃描模式確定母離子并對(duì)錐孔電壓進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)不斷增加碰撞能量確定合適的子離子，最終確定5種成分各自的定量、定性離子對(duì)。由于待測(cè)成分復(fù)雜且成分中具有極性相近的同分異構(gòu)體，因此比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸溶液、乙腈-乙酸銨溶液等多種流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中加入適量的甲酸可以使同分異構(gòu)體達(dá)到基線分離，因此選擇乙腈-甲酸溶液作為流動(dòng)相。各化合物在正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng)，但當(dāng)流動(dòng)相系統(tǒng)中加入甲酸后，負(fù)離子模式響應(yīng)明顯降低，因此選擇在正離子模式下進(jìn)行檢測(cè)。

2.2樣品前處理?xiàng)l件的選擇

考察了甲醇、乙醇、乙腈三種不同提取溶劑及25%、50%、75%、100%四種不同溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)藤黃中各成分含量的影響，結(jié)果顯示，不同提取溶劑對(duì)提取效率的影響不大，當(dāng)以75%乙醇作為提取溶劑時(shí)提取效果相對(duì)較好，因此選擇75%乙醇作為提取溶劑。比較直接超聲處理和浸泡后超聲處理兩種不同超聲提取方法，結(jié)果顯示，在相同提取時(shí)間下，浸泡后超聲提取液的含量高于直接超聲提取液，最終選用浸泡后超聲提取法。比較浸泡5、10、15 min和超聲10、15、20、30 min的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)浸泡時(shí)間和提取時(shí)間對(duì)各成分的含量無(wú)顯著影響，最終選擇浸泡5 min后超聲提取10 min。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專屬性

分別取空白溶劑、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液適量，按照上述條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，待測(cè)成分的分離良好，空白無(wú)雜質(zhì)峰干擾，表明本方法專屬性較強(qiáng)。

2.3.2線性關(guān)系

分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按照上述條件進(jìn)樣測(cè)定，以各成分的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸分析，得各組分的回歸方程和線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表2，表明藤黃中各成分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.3精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按照上述條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算5種成分峰面積的RSD值，結(jié)果顯示，藤黃酸、轉(zhuǎn)位藤黃酸、藤黃酸B、異藤黃酸、新藤黃酸的RSD分別為1.7%、1.8%、2.2%、1.8%、2.6%，表明儀器精密度良好。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)

稱取藤黃藥材粉末約5 mg，精密稱定，平行稱取6份，按上述操作制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算藤黃酸、轉(zhuǎn)位藤黃酸、藤黃酸B、異藤黃酸、新藤黃酸的含量分別為23.31%、1.28%、2.88%、26.18%、22.08%，RSD分別為1.8%、2.8%、2.9%、1.8%、1.9%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5定性試驗(yàn)

稱取藤黃藥材粉末約5 mg，按上述操作制備供試品溶液，放置在4℃恒溫進(jìn)樣器中，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示藤黃酸、轉(zhuǎn)位藤黃酸、藤黃酸B、異藤黃酸、新藤黃酸峰面積的RSD分別為1.9%、2.9%、2.8%、2.0%、3.0%，表明供試品溶液在4℃恒溫進(jìn)樣器中放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6加樣回收試驗(yàn)

取同一藤黃藥材約2.5 mg，精密稱定，平行稱取9份，分別精密加入混合對(duì)照品溶液，使加入各成分含量分別為供試品中相應(yīng)成分含量的50%、100%、150%，按上述操作制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3，藤黃中5種成分的平均回收率為95.1%～101.6%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4樣品含量測(cè)定

精密稱取編號(hào)為S-01～S-04的藤黃藥材粉末約0.5 mg，按上述操作制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3結(jié)論

本研究建立了一種同時(shí)測(cè)定藤黃藥材中5種成分含量的UPLC-MS/MS方法。該法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高，可為藤黃藥材質(zhì)量控制及應(yīng)用提供參考依據(jù)可為藤黃藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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【作者簡(jiǎn)介】

王超，女，1985年出生，副主任藥師，研究方向?yàn)樗幤贩欠ㄌ砑蛹盎瘖y品理化檢驗(yàn)。

郭春梅，女，1966年出生，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槭称?、化妝品檢驗(yàn)。

程紅新，女，1966年出生，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槭称?、化妝品檢驗(yàn)。

史延通，男，1975年出生，正高級(jí)研究員，研究方向?yàn)榛瘖y品業(yè)務(wù)管理。

（編輯：侯睿琪）