張信仁，張?jiān)?，陳澤宇，劉正?/p>

（1.三明海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，福建 三明 365000；2.福州海關(guān)技術(shù)中心，福州 350001）

標(biāo)準(zhǔn)樣品是集科研與標(biāo)準(zhǔn)于一體的，具有均勻性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和溯源性的實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)[1]。標(biāo)準(zhǔn)樣品在測(cè)量系統(tǒng)校準(zhǔn)、測(cè)量程序評(píng)估、給其它材料賦值和質(zhì)量控制[2]、保證分析方法的準(zhǔn)確性及可溯源性等方面具有重要作用[3]。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分為純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[4]兩類，標(biāo)準(zhǔn)樣品可有效避免基體效應(yīng)對(duì)物質(zhì)成分分析的影響，能滿足校準(zhǔn)檢測(cè)的實(shí)際需求，適用于食品分析方法的確認(rèn)和質(zhì)量控制，對(duì)于確保食品檢驗(yàn)分析的準(zhǔn)確性和有效性具有重要意義[5]。

罌粟殼為罌粟科植物罌粟采完鴉片后的干燥成熟果殼，具有一定的成癮性，標(biāo)志性成分為罌粟堿、那可丁、可待因、嗎啡、蒂巴因等生物堿[6]，是國家嚴(yán)格控制的藥用物質(zhì)，嚴(yán)禁食品中非法添加，也是國家食品安全重點(diǎn)監(jiān)查項(xiàng)目[7]。然而一些不法商販為了謀取高額利益，將罌粟殼或其浸提物添加到食品中使消費(fèi)者食用后容易上癮，以達(dá)到吸引消費(fèi)者的目的[8]，極大地危害人民群眾的身體健康。因食品基體復(fù)雜多樣，需要有對(duì)應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品或質(zhì)控樣來檢測(cè)校準(zhǔn)，才能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性或滿足要求[9]，由此可見基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)于檢驗(yàn)檢測(cè)至關(guān)重要，直接影響測(cè)量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，從而影響到此類案件的查處。雖然國家一級(jí)、二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已在國內(nèi)外各領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[10]，但是目前涉及的食品安全檢測(cè)基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在非法添加物領(lǐng)域取得有證編號(hào)的僅有10個(gè)批號(hào)，5種物質(zhì)[11]，未見食品基質(zhì)中罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)樣品的相關(guān)研究報(bào)道。筆者以辣椒油為基質(zhì)，加入一定量的鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品，研制了辣椒油中罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)樣品，該標(biāo)準(zhǔn)樣品可用于火鍋食品系列中罌粟堿檢測(cè)的方法驗(yàn)證和質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：LC-30A 型，日本島津公司。

三重四極桿質(zhì)譜儀：AB3500 型，美國AB SCIEX公司。

冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)：Allegra 64R 型，美國Beckman Coulter公司。

超純水機(jī)：Milli-Q Reference 型，美國密理博公司。

電子分析天平：XS204型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

脈動(dòng)式多管渦旋振蕩器：HMV-50A 型，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

旋渦混合器：XW-80 A 型，上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))不小于99.9%，美國CATO標(biāo)準(zhǔn)品公司。

甲醇、乙腈：色譜純，德國默克公司。

無水乙酸鈉、無水硫酸鎂：分析純，西隴科學(xué)股份公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品制備

在辣椒油樣品中加入一定濃度和比例的鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品，充分振蕩混勻后，采用帶密封蓋的棕色玻璃瓶分裝，并粘貼對(duì)應(yīng)的標(biāo)識(shí)，每瓶獨(dú)立樣品分裝25 g左右。所制得的標(biāo)準(zhǔn)樣品與實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)樣品基本一致，于-18 ℃冰箱中存儲(chǔ)，短期可常溫下儲(chǔ)存與使用。

1.3 測(cè)定方法

參考國家市場(chǎng)監(jiān)管總局公告〔2018年第3號(hào)〕附件1 (BJS 201802)[12]，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，以色譜峰面積外標(biāo)法定量，罌粟堿檢測(cè)離子對(duì)質(zhì)荷比為304.4/202.0(定量)，304.4/171.1(定性)。

1.4 樣品均勻性檢驗(yàn)

隨機(jī)抽取15 份獨(dú)立包裝的樣品進(jìn)行均勻性檢測(cè)，對(duì)抽取的每瓶樣品，在重復(fù)條件下測(cè)定3 次，采用單因素方差分析(F檢驗(yàn))法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以檢驗(yàn)樣品的均勻性。

1.5 樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)

包含長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)和短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)，所用的人員、設(shè)備、方法及實(shí)驗(yàn)條件與均勻性檢驗(yàn)相同。長(zhǎng)期穩(wěn)定性共進(jìn)行了26個(gè)月，按照先密后疏的原則每間隔一定時(shí)間隨機(jī)取樣1次，每瓶樣品重復(fù)檢驗(yàn)3次，采用平均值作為檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；短期穩(wěn)定性通過模擬運(yùn)輸條件，將穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果的平均值與均勻性測(cè)定結(jié)果的平均值進(jìn)行比較，采用F檢驗(yàn)法評(píng)定樣品的穩(wěn)定性。

1.6 樣品定值及不確定度分析

標(biāo)準(zhǔn)樣品由9個(gè)通過資質(zhì)認(rèn)定的實(shí)驗(yàn)室協(xié)同定值，檢測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)[13?14]、柯克倫(Cochran)檢驗(yàn)及格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)[15]后取平均值進(jìn)行定值。

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15000.3—2008[16]，通過建立有效的數(shù)學(xué)模型，對(duì)各種不確定度分量進(jìn)行定量，利用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行分布計(jì)算和整體合成，通過推導(dǎo)計(jì)算，給出火鍋食品(辣椒油)中罌粟堿含量的擴(kuò)展不確定度。

2 結(jié)果與討論

2.1 基質(zhì)樣品選擇

為了使標(biāo)準(zhǔn)樣品基質(zhì)與實(shí)際檢測(cè)樣品接近一致，盡量消除基質(zhì)干擾和基體效應(yīng)引入的系統(tǒng)誤差[17]，選擇火鍋食品底料中辣椒調(diào)味油陰性樣品，經(jīng)不銹鋼濾網(wǎng)過濾，去除火鍋殘?jiān)屠苯纷押蟪吻謇苯氛{(diào)味油；也可選擇市售的辣椒油或調(diào)和油，但是成分相對(duì)較單純，與實(shí)際檢測(cè)樣品(成分較為復(fù)雜)基質(zhì)會(huì)有偏差。

2.2 均勻性檢驗(yàn)

在充分振蕩混勻后的辣椒油標(biāo)準(zhǔn)樣品分裝前，隨機(jī)選取上、中、下層的3 份樣品進(jìn)行均勻性初測(cè)，然后在已分裝好的樣品中隨機(jī)抽取15 份獨(dú)立包裝樣品，以每瓶樣品3次重復(fù)測(cè)試數(shù)據(jù)為一組，共15組45 個(gè)數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析法(F檢驗(yàn))檢驗(yàn)樣品的均勻性。計(jì)算F值，查F分布臨界值Fa，若樣品F＜Fa，則表明樣品內(nèi)和樣品間無顯著性差異，樣品是均勻的。均勻性檢驗(yàn)方差分析結(jié)果見表1。結(jié)果表明，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，F(xiàn)＜F0.05，因此組間和組內(nèi)不存在顯著性差異，辣椒油中罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性良好。

表1 辣椒油中罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性檢驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

2.3.1 短期穩(wěn)定性

模擬樣品運(yùn)輸極端條件進(jìn)行短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)，將獨(dú)立包裝的樣品分別置于-18、4、25 ℃環(huán)境以及室外條件下保存14 d后測(cè)定；取獨(dú)立包裝樣品分別郵寄至北京和深圳往返4～6 d，取樣檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試3 次，考察其短期穩(wěn)定性。對(duì)檢測(cè)結(jié)果及均勻性數(shù)據(jù)同時(shí)采用F檢驗(yàn)法，進(jìn)行單因素方差分析，分析結(jié)果見表2。結(jié)果表明，當(dāng)顯著水平α=0.05時(shí)，樣品F＜Fα(臨界值)，其結(jié)果均未見顯著差異，表明所研制的辣椒油基體標(biāo)準(zhǔn)樣品短期是穩(wěn)定的。

表2 辣椒油中罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)樣品短期穩(wěn)定性方差分析結(jié)果

2.3.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性

進(jìn)行了26 個(gè)月長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。按照先密后疏的原則，每間隔一定時(shí)間抽取獨(dú)立包裝的樣品，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試3次。長(zhǎng)期穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果及F檢驗(yàn)法檢驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別見表3和表4。采用F檢驗(yàn)法檢驗(yàn)一元線性回歸模型的顯著性(以Fs表述)，通過計(jì)算F來評(píng)估回歸的顯著性。對(duì)于95%的置信水平，罌粟堿的Fs≥0.05，表示回歸不顯著，表明所研制的標(biāo)準(zhǔn)樣品在26 個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的。目前該標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)仍在繼續(xù)監(jiān)控。

表3 辣椒油中罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)樣品長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表4 辣椒油中罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)樣品長(zhǎng)期穩(wěn)定性回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.4 定值

2.4.1 定值實(shí)驗(yàn)室選擇

標(biāo)準(zhǔn)樣品采用多實(shí)驗(yàn)室協(xié)同定值的方案，參加協(xié)同定值的具有CMA(中國計(jì)量認(rèn)證)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室有石家莊海關(guān)技術(shù)中心(編號(hào)001)、昆明海關(guān)技術(shù)中心(編號(hào)002)、廈門海關(guān)技術(shù)中心(編號(hào)003)、重慶海關(guān)技術(shù)中心(編號(hào)004)、福建中檢華日有限公司(編號(hào)005)、福州海關(guān)技術(shù)中心(編號(hào)006)、天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心(編號(hào)007)、三明海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心(編號(hào)008)、南昌海關(guān)技術(shù)中心(編號(hào)009)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定3 個(gè)樣品，每個(gè)樣品平行測(cè)定2次，共計(jì)54個(gè)檢測(cè)值。罌粟堿室外協(xié)同定值結(jié)果見表5。

表5 辣椒油中罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)樣品室外協(xié)同定值結(jié)果

2.4.2 離群值檢驗(yàn)

為保證各實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)值無異常值，依次采用正態(tài)分布檢驗(yàn)的偏態(tài)系數(shù)和峰態(tài)系數(shù)法、柯克倫(Cochran)檢驗(yàn)及格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。

正態(tài)分布檢驗(yàn)采用偏態(tài)系數(shù)和峰態(tài)系數(shù)法，置信概率P=0.95，測(cè)量次數(shù)n=54，經(jīng)計(jì)算偏態(tài)系數(shù)A=0.136，峰態(tài)系數(shù)B=2.535，查表得A1=0.53，B1=2.15，B1′=3.99，則A＜A1，B1＜B＜B1′，表明該組測(cè)量數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布。

柯克倫檢驗(yàn)結(jié)果：當(dāng)p=9，n=6時(shí)，查表得C0(5%)=0.328 5，計(jì)算C值為0.233 2，則C＜C0(5%)。

格拉布斯檢驗(yàn)結(jié)果：當(dāng)p=9 時(shí)，單值G1(5%，9)=2.215，G1(1%，9)=2.387，計(jì)算G11=2.206，G1p=2.311，則G11＜G1(5%，9)；雙值G2(5%，9)=0.149 2，G2(1%，9)=0.085 1；計(jì)算G21和G2p值分別為0.840 3 和0.819 7，則G21＞G2(5%，9)，表明9家實(shí)驗(yàn)室對(duì)辣椒油基體中罌粟堿的檢測(cè)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，結(jié)果無異常值，均可參與后續(xù)檢驗(yàn)，所有單元的數(shù)據(jù)均可參與定值。

2.4.3 定值結(jié)果

數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)、柯克倫檢驗(yàn)及格拉布斯檢驗(yàn)，所有單元的數(shù)據(jù)均可保留并參與最終定值，即協(xié)同定值實(shí)驗(yàn)室提供結(jié)果的平均值，結(jié)果為39.4 μg/kg。

2.5 溯源性

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在空間上必須具有溯源量值的功能[18]。以有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)溶液制作校準(zhǔn)曲線；測(cè)量前對(duì)所有計(jì)量?jī)x器(分析天平、容量瓶、移液槍等)進(jìn)行了校準(zhǔn)，并考慮其示值不確定度；具有資質(zhì)的9 家實(shí)驗(yàn)室協(xié)同定值，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性和溯源性。

2.6 不確定度評(píng)定

定值結(jié)果的擴(kuò)展不確定度UCRM參照GB/T 15000.3—2008 評(píng)定。由于標(biāo)準(zhǔn)樣品采用郵政網(wǎng)絡(luò)協(xié)同定值，因短期運(yùn)輸所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度usts已包含在各實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)值中，不用再單獨(dú)計(jì)算。故標(biāo)準(zhǔn)品的不確定度來源由3 部分組成：定值標(biāo)準(zhǔn)不確定度uchar、瓶間標(biāo)準(zhǔn)不確定度ubb、長(zhǎng)期穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)不確定度ults。各項(xiàng)不確定度計(jì)算結(jié)果見表6。

表6 辣椒油中罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)樣品量值不確定度計(jì)算結(jié)果

在置信水平為95%時(shí)，k=2，將表6 數(shù)據(jù)代入下式計(jì)算擴(kuò)展不確定度：

計(jì)算得UCRM=1.52 μg/kg。標(biāo)準(zhǔn)值由定值的總平均值與擴(kuò)展不確定度組成，則辣椒油中罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果為(39.4±3.0) μg/kg.

3 結(jié)語

建立了火鍋食品基質(zhì)(辣椒油)中罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法。由9 家通過資質(zhì)認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法協(xié)作定值，量值可靠，均勻性和穩(wěn)定性良好，罌粟堿特性值為(39.4±3.0)μg/kg。利用該方法制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品(質(zhì)控樣)對(duì)檢測(cè)過程的質(zhì)量控制、檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研發(fā)、生產(chǎn)、制備以及確保食品安全均具有重要意義。