張小輝,王海偉,田云霄,楊建華,孫 穎,袁艷龍（邯鄲市中心醫(yī)院病理科，河北 邯鄲 056001）

近年來，食管胃交界部腺癌（adenocarcinoma of esophagogastric junction，AEG）的發(fā)病率迅速增加，嚴(yán)重威脅人們的生命健康[1]。AEG 進(jìn)展迅速，發(fā)現(xiàn)時多為晚期，腫瘤的異質(zhì)性較大，治療方法包括傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療及新型的免疫治療，目前AEG 患者的5 年生存率仍不高，僅20%左右[2]。故亟需尋找新的AEG 預(yù)后生物標(biāo)志物及治療靶點。三葉因子家族成員三葉因子3（trefoil factor-3，TFF3）是一種小分子多肽，主要由消化道黏膜中的杯狀細(xì)胞分泌，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)。TFF3 對消化道黏膜損傷有修復(fù)和保護作用，并參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[3]。人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)是一種酪氨酸激酶受體，通過形成二聚體激活下游MAPK信號通路和PI3K/Akt信號通路，二者共同作用于腫瘤細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤的生存、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成及抗腫瘤細(xì)胞凋亡等[4]。因此，TFF3 及HER2 有望成為AEG 免疫治療的靶點或預(yù)測預(yù)后的標(biāo)志物。本研究通過檢測TFF3 及HER2 在AEG 組織中的表達(dá)并分析其與預(yù)后的關(guān)系，探討二者在AEG發(fā)生發(fā)展中的作用，以期為AEG的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集邯鄲市中心醫(yī)院2016 年1 月至2017 年3 月未經(jīng)放療及化療的AEG 患者的手術(shù)標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有標(biāo)本均經(jīng)2名副高級職稱以上病理醫(yī)師鑒定為腺癌；有完整的臨床資料和隨訪記錄。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并小細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌及其他類型腫瘤；腫瘤多發(fā)。符合標(biāo)準(zhǔn)的病例共140 例，其中女24 例，男116 例；年齡52～82歲，中位年齡66歲；腫瘤最大徑0.8～11.0 cm；Laurén 分型：腸型36 例，混合型73 例，彌漫型31 例；T 分期：T1～T2 期9 例，T3～T4 期131 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移101例，未轉(zhuǎn)移39例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期99 例。 本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（202102-002）。

1.2 實驗方法

所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定24 h，石蠟包埋、4 μm 切片，以PBS 代替一抗為陰性空白對照，正常結(jié)腸黏膜作為陽性對照。行HE染色和免疫組化Elivison兩步法染色檢測TFF3和HER2表達(dá)，若HER2檢測結(jié)果不確定，進(jìn)一步行免疫熒光原位雜交。分析AEG組織中TFF3、HER2 表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤最大徑、Laurén 分型、T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期等臨床病理特征的關(guān)系。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1 TFF3免疫組化檢測結(jié)果判斷 對免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析，測量染色強度和程度。每個樣本選取5個視野，對每個視野中的陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。細(xì)胞染色強度：無染色計0 分，黃色計1 分，棕黃色計2 分，棕色計3 分。腫瘤細(xì)胞數(shù)＜25%、25%～＜50%、50%～＜75%、≥75%,陽性細(xì)胞數(shù)評分分別計1 分、2 分、3 分、4 分。兩者評分相乘,得分0～4 分為陰性，5～12分為陽性。

1.3.2 HER2 免疫組化檢測結(jié)果判讀 HER2 陽性定位于細(xì)胞膜，無反應(yīng)或＜10%腫瘤細(xì)胞膜染色為0；≥10%腫瘤細(xì)胞微弱或隱約可見膜染色或僅有部分細(xì)胞膜染色為1+；≥10%腫瘤細(xì)胞有弱到中等的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜染色為2+；≥10%腫瘤細(xì)胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜強陽染色為3+。0、1+為陰性，3+為陽性，2+為不確定，進(jìn)一步行免疫熒光原位雜交檢測[5]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗；Kaplan-Meier生存曲線分析TFF3 及HER2 對預(yù)后的影響；Cox回歸分析影響AEG 患者預(yù)后的危險因素。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AEG 組織中TFF3、HER2 表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

在140 例AEG 標(biāo)本中，TFF3 陽性表達(dá)72 例（51.43%），HER2 陽性表達(dá)21 例（15.00%）,見圖1。AEG 中TFF3 的陽性表達(dá)與Laurén 分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤最大徑、T分期及TNM 分期無關(guān)（P＞0.05），見表1。AEG 中HER2 的陽性表達(dá)與腫瘤Laurén 分型有關(guān)（P＜0.05），腸型腺癌中陽性表達(dá)率最高（33.33%），彌漫型最低（3.23%）。HER2 表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤最大徑、T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)（P＜0.05），見表1。

圖1 TFF3、HER2在AEG組織中的表達(dá)

表1 AEG組織中TFF3及HER2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.2 AEG組織中HER2與TFF3表達(dá)的關(guān)系

在140 例AEG 標(biāo)本組織中，72 例TFF3 陽性，21 例HER 陽性；6 例HER2 與TFF3 同時陽性，53 例同時陰性。HER2 陽性標(biāo)本中TFF3 陽性率為28.57%，HER2陰性標(biāo)本中TFF3 陽性率為55.46%，二者TFF3 陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.167，P=0.023），提示TFF3的表達(dá)與HER2表達(dá)相關(guān)。

2.3 AEG組織中HER2的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

AEG 患者的中位總生存期為35.5 個月，5 年生存率為34.3%。HER2 陰性及陽性表達(dá)患者的5 年生存率分別為（32.8±4.3）%、（42.9±10.8)%；TFF3 陰性及陽性表達(dá)患者的5 年生存率分別為（42.6±6.0）%、（26.4±5.2）%，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，TFF3的表達(dá)會影響患者生存率。TFF3 陽性患者與陰性患者生存率有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.012），見圖2。

圖2 HER2、TFF3表達(dá)與總生存率的關(guān)系

2.4 影響AEG患者預(yù)后的單因素及多因素分析

采用Cox回歸模型對AEG患者預(yù)后進(jìn)行單因素和多因素分析。單因素分析發(fā)現(xiàn)，入組患者的預(yù)后與腫瘤最大徑、T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期及腫瘤TFF3的表達(dá)相關(guān)（P＜0.05）；將以上5 項具有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)納入Cox多因素分析，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期較晚及TFF3陽性表達(dá)為影響AEG 患者預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05），見表2、3。

表2 影響AEG患者預(yù)后的單因素

表3 影響AEG患者預(yù)后的多因素分析

3 討論

AEG 為腫瘤中心位于食管胃交界部上下5 cm 以內(nèi)的腺癌，并跨越/接觸食管胃交界部，在生物學(xué)行為和預(yù)后方面，AEG 有別于真正意義上的食管癌和胃癌，是一種獨特的臨床病理類型[6]，男性多于女性。腫瘤中心位于食管胃交界部以下2 cm（含2 cm）內(nèi)的AEG 遵循食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)；腫瘤中心位于食管胃交界部以下2 cm 以遠(yuǎn)的AEG 應(yīng)遵循胃癌分期標(biāo)準(zhǔn)[7]。目前，手術(shù)切除仍是AEG 的主要治療手段[2]，隨著醫(yī)療技術(shù)的提高，AEG 的近期預(yù)后有了一定提升，但遠(yuǎn)期效果仍不理想，因此亟需尋找新的治療方案，以提升AEG的整體預(yù)后。

TFF3是三葉因子家族的成員之一，家族其他成員還有TFF1 和TFF2，均主要由黏液分泌上皮細(xì)胞表達(dá)，TFF3主要由小腸及結(jié)腸的杯狀細(xì)胞分泌，在正常胃黏膜中幾乎不表達(dá)[8]，當(dāng)消化系統(tǒng)黏膜受到機械性/化學(xué)性刺激、損傷（如幽門螺桿菌感染、胃食管反流等）時，消化道黏膜上皮細(xì)胞迅速分泌TFF3 以應(yīng)對刺激及損傷[9]。TFF3 除了參與損傷的修復(fù)和保護機制外，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中也具有非常重要的作用,目前認(rèn)為TFF3 通過促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展[10]。食管胃交界部在正常黏膜-癌旁組織-高分化腺癌-低分化腺癌中，TFF3的陽性表達(dá)率逐步升高[11]。Rivat 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，TFF3 和VEGF 能夠激活STAT3 信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，通過RNA 干擾等方式阻斷STAT3 信號途徑后，能夠抑制TFF3 和VEGF 誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲以及裸鼠移植瘤的生長，提示TFF3通過STAT3信號通路促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。顧建春[13]納入92 例胃癌患者進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，TFF3 陽性表達(dá)率為42.7%，TFF3 陽性多見于腫瘤浸潤深、TNM 分期晚的胃癌患者，并且TFF3 陰性的胃癌患者的生存期明顯長于TFF3 陽性患者，其5 年總體生存率分別為（42.6±6.0）%、（26.4±5.2）%，提示TFF3表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，且為胃癌患者生存期的獨立預(yù)測因素[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，AEG 組織TFF3 的陽性表達(dá)率為51.43%，與以往研究結(jié)果相似[12]，并且TFF3 陽性表達(dá)與腫瘤Laurén 分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明在AEG 中TFF3 的表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)；Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，TFF3表達(dá)會影響AEG 患者的生存率，TFF3 陽性患者生存率低于TFF3陰性患者。

HER2 是EGFR 家族的第2 號成員，是一種跨膜酪氨酸激酶受體，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三個部分組成。胞外區(qū)為配體結(jié)合區(qū)，胞內(nèi)區(qū)具有內(nèi)源性酪氨酸激酶活性，HER2 不能與任何已知的配體相結(jié)合，其通過與自身或EGFR 家族的其他成員形成二聚體，然后連接相應(yīng)的配體，使胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化，從而激活下游信號通路，包括PI3K/AKT/mTOR 和Ras/Raf/MAPK 等途徑，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、黏附、遷移和分化[14]，并在乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌及鼻咽癌等癌組織中高表達(dá)，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。以往研究表明，HER2 在AEG 的陽性表達(dá)率高于遠(yuǎn)端胃腺癌[16]。本研究140 例AEG 標(biāo)本中，HER2 陽性表達(dá)率為15.00%，與以往研究相似[17]；同時在腸型AEG 中表達(dá)率最高（33.33%），與相關(guān)研究結(jié)果一致[18]，但由于HER 過表達(dá)使腫瘤更易出現(xiàn)浸潤、化療藥物不敏感，導(dǎo)致預(yù)后較差[15，19]。本研究結(jié)果顯示，HER2 陽性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM 分期無明顯相關(guān)性，這與雷瑞雪等[16]的研究結(jié)果不一致，有待進(jìn)一步探討。

本研究結(jié)果顯示，HER2 多表達(dá)于Laurén 分型為腸型的AEG，而TFF3 多表達(dá)于Laurén 分型為彌漫型的AEG，且二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。顧建春[13]的研究顯示，同時表達(dá)HER2、TFF3 的患者預(yù)后較其他患者差，而TFF3和HER2同時陰性者預(yù)后相對較好，TFF3陽性為影響預(yù)后的危險因素。針對HER2 陽性的AEG，目前可以采用曲妥珠單抗、拉帕替尼等抗HER2 藥物靶向治療[19]。本研究中，51.43%的AEG 患者存在TFF3 過表達(dá)，HER2 陰性患者的TFF3 陽性表達(dá)率高于HER2陽性患者，對于HER2 陰性，無法應(yīng)用抗HER2 藥物靶向治療的患者，TFF3 是否能成為AEG 治療的靶點，還需進(jìn)一步研究。

綜上，TFF3 的陽性表達(dá)與AEG 患者的Laurén 分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，TFF3陽性患者的生存率低于陰性患者；HER2 的陽性表達(dá)與患者的Laurén 分型有關(guān)，與患者的生存率無關(guān)；TFF3 與HER2 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。檢測TFF3 及HER2 有助于判斷患者的預(yù)后，并有望在治療方面提供幫助。