丁曉霞,劉亞群,于小緯,楊 楠,張悅琪（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥監(jiān)護室，河北 張家口 075000）

肺癌是導(dǎo)致癌癥患者死亡的重要原因，肺鱗癌是常見的肺癌亞型之一，其化療和放療敏感性較低[1-2]。由于肺鱗癌容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，并且目前缺乏有效的診斷性生物標(biāo)志物，確診時患者往往已處于中晚期，導(dǎo)致患者預(yù)后較差[3-4]。因此，積極尋找用于肺鱗癌診斷和預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類不具有編碼能力的小分子RNA，在基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物行為學(xué)過程[5-6]。脂質(zhì)運載蛋白1(lipocalin-1，LCN1) 能夠間接導(dǎo)致肺組織基質(zhì)降解增加，造成肺組織結(jié)構(gòu)重塑，使病情加重。miRNA 可長期穩(wěn)定存在，且其異常表達會影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。miRNA 既可以發(fā)揮抑癌作用，也可以發(fā)揮促癌作用，并且在多數(shù)人類惡性腫瘤中異常表達[9-10]。有研究顯示，miR-146b-3p 可作為診斷非小細(xì)胞肺癌的重要標(biāo)志物[11]。還有研究顯示，miR-146a 在肺鱗癌組織中表達下調(diào)，其異常表達能抑制肺鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲[12]?；谶@些研究結(jié)果，我們推測miR-146b-3p可能在肺癌中發(fā)揮重要作用。本研究探討miR-146b-3p差異表達對肺鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并初步分析其可能的作用機制，以期為肺鱗癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

NCI-H226、NCI-H2170 細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；RPMI 1640培養(yǎng)基、AnnexinV-FITC 凋亡檢測試劑盒購于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；胎牛血清購于愛必信(上海)生物科技有限公司；細(xì)胞計數(shù)儀購于Invitrogen 有限公司；RNA 提取試劑TRIzol 及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 均購自南京森貝伽生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-ScriptTMRT Master Mix 購自上海妍琦生物科技有限公司，PCR 試劑盒Quanti Fast SYBR Green PCR Kit 購自武漢極捷生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒購自北京伊塔生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒購自上海吉至生化科技有限公司；BCL2、BAX、CCNB1、CDK2 多克隆抗體、LCN1多克隆抗體以及HRP 標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）二抗購自上?？泼羯锟萍加邢薰?；雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)試劑盒購自成都安森盛源科技有限公司；ST-360 型酶標(biāo)儀購自上海晚成醫(yī)療器械有限公司；細(xì)胞周期試劑盒購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；ELx808 酶標(biāo)儀購自北京澤平科技有限責(zé)任公司；FACS VantageTM流式細(xì)胞儀購自南京華奧生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

通過TCGA 在線數(shù)據(jù)庫下載肺鱗癌臨床樣本數(shù)據(jù)，比較miR-146b-3p、LCN1在癌旁組織與肺鱗癌組織中的表達情況，并分析LCN1 與肺鱗癌患者臨床表型的關(guān)系。使用Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫評估LCN1 mRNA水平對肺鱗癌患者總生存期的影響。利用Star-Base 數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-146b-3p的靶基因。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將NCI-H226、NCI-H2170 細(xì)胞接種至含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長，胰酶消化液消化后傳代培養(yǎng)，實驗取對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.4 RT-PCR檢測miR-146b-3p表達

采用TRIzol 法提取細(xì)胞或組織中的總RNA，采用紫外分光光度計法測定RNA 的濃度。按TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以RNA 為模板進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 并置于4 ℃保存，進行熒光定量PCR 擴增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，65 ℃延伸1 min，4 ℃ 10 min，擴增40個循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參，miR-146b-3p 上 游 引 物 序 列 ：5′-CCTGGCA CTGAGAACTGAAT-3′，下游序列：5′-GCACCAGAA CTGAGTCCACA-3′；β-actin 上游引物序列：5′-CATC CCTTCTCCCCACACAC-3′，下游序列：5′-AGTCCCAG GGCTTTGATTTG-3′。以2-ΔΔCt法計算miR-146b-3p 的相對表達水平。

1.5 構(gòu)建miR-146b-3p過表達細(xì)胞模型

將對數(shù)生長期的NCI-H2170 和NCI-H226 細(xì)胞分為miR-NC 組和miR-146b-3p 組，根據(jù)Lipofectamine 2000 說明書分別轉(zhuǎn)染miR-146b-3p NC 和miR-146b-3p質(zhì)粒，24 h后更換完全培養(yǎng)基。采用G418篩選出能夠穩(wěn)定過表達miR-146b-3p的NCI-H2170和NCI-H226細(xì)胞系。采用RT-PCR 檢測miR-146b-3p 水平以評估轉(zhuǎn)染效率。

1.6 構(gòu)建LCN1敲低細(xì)胞模型

將對數(shù)生長期的NCI-H2170 和NCI-H226 細(xì)胞分為shNC 組、shLCN1 1#組、shLCN1 2#組和miR-146b-3p+LCN1 組，并根據(jù)Lipofectamine 2000 說明書分別轉(zhuǎn)染shNC、shLCN1 1#、shLCN1 2#質(zhì)粒，24 h 后更換完全培養(yǎng)基。用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定敲低LCN1 的NCI-H2170 和NCI-H226 細(xì)胞系。采用Western blot 檢測LCN1 蛋白水平以評估轉(zhuǎn)染效率，篩選穩(wěn)定質(zhì)粒構(gòu)建miR-146b-3p+LCN1 組（共轉(zhuǎn)染miR-146b-3p+LCN1 2#質(zhì)粒）。

1.7 細(xì)胞增殖實驗

將miR-NC 組、miR-146b-3p 組、shNC 組、shLCN1 1#組、shLCN1 2#組和miR-146b-3p+LCN1 組細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別于0、1、2、3、4、5 d 時對細(xì)胞增殖活性進行檢測。每孔加入CKK-8 10 μL，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，隨后用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的光密度（optical density，OD）值。

1.8 細(xì)胞克隆實驗

將miR-NC 組、miR-146b-3p 組、shNC 組、shLCN1 1#組、shLCN1 2#組和miR-146b-3p+LCN1 組細(xì)胞分別接種到6 孔板中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。用PBS 清洗3 次，再用40 g/L 多聚甲醛固定20 min。結(jié)晶紫染色液染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞集落。

1.9 細(xì)胞周期實驗

將miR-NC 組、miR-146b-3p 組、shNC 組、shLCN1 1#組、shLCN1 2#組和miR-146b-3p+LCN1 組細(xì)胞以1×105個/孔的密度接種于6 孔板，消化離心，棄去上清液，收集細(xì)胞團塊，PBS 重懸細(xì)胞，離心，清洗1 次，振蕩，使細(xì)胞沉淀充分分散，先加入300 μL、4 ℃預(yù)冷PBS，再將上樣管置于渦旋振蕩器上振蕩，加700 μL、4 ℃預(yù)冷的純乙醇沉懸，4 ℃固定過夜。第2天，離心棄去上清液，PBS洗1次，加500 μL PI染液，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測，用Flowjo 軟件分析細(xì)胞周期時相分布。

1.10 細(xì)胞凋亡實驗

取miR-NC 組、miR-146b-3p 組、shNC 組、shLCN1 1#組、shLCN1 2#組和miR-146b-3p+LCN1 組細(xì)胞進行消化、離心、重懸。將細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)并置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以1 500 r/min 離心10 min 去除上清液。加入5 μL AnnexinV-FITC 混勻，再加入5 μL PI混勻，隨后室溫下避光孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.11 雙熒光素酶報告實驗

構(gòu)建野生型報告基因載體LCN1-WT 與突變型報告基因載體LCN1-MT，將載體分別與miR-NC 或miR-146b-3p 共轉(zhuǎn)染到肺鱗癌細(xì)胞中。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用雙熒光素酶檢測試劑盒測量各組細(xì)胞中的熒光素酶活性。

1.12 裸鼠移植瘤實驗

16 只裸鼠購自成都達碩實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2020-030，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中飼養(yǎng)，自由采食飲水。將小鼠分為對照組和觀察組，每組8 只，對照組裸鼠于右側(cè)腹股溝皮下注射0.2 m L(1×107/mL）轉(zhuǎn)染miR-NC 的NCI-H2170 細(xì)胞懸液，觀察組裸鼠于右側(cè)腹股溝皮下注射0.2 mL(1×107/mL）已轉(zhuǎn)染miR-146b-3 的NCI-H2170 細(xì)胞懸液。待成瘤后，每2 d 用微米卡尺測量腫瘤體積，于第2 周末處死小鼠，剝離移植瘤并稱重，RT-PCP 檢測移植瘤組織中miR-146b-3p的表達。

1.13 Western blot檢測

收集miR-NC組、miR-146b-3p組、shNC組、shLCN1 1#組、shLCN1 2#組、miR-146b-3p+LCN1組對數(shù)生長期的NCI-H2170 和NCI-H226 細(xì)胞，加入SDS Loading buffer，沸水浴中煮沸10 min，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入用封閉液稀釋的抗體(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜。次日PBS 洗滌6 min，重復(fù)3 次，然后加入封閉液稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育60 min，PBS 洗滌6 min，重復(fù)3 次，ECL 化學(xué)發(fā)光液進行顯影，以β-actin 作為內(nèi)參，利用BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度，具體操作遵照試劑盒說明書進行。

1.14 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間的表達差異采用t檢驗分析，多組間比較采用單因素方差分析。Kaplan-Meier生存曲線分析患者總生存期。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-146b-3p 過表達抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖、促進凋亡

GEO數(shù)據(jù)庫分析顯示，肺鱗癌組織中miR-146b-3p表達水平明顯低于癌旁組織（P＜0.05）。RT-PCR 實驗結(jié)果顯示，miR-146b-3p 組中miR-146b-3p 表達明顯高于miR-NC 組（P＜0.05）。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，與miR-NC 組相比，miR-146b-3p 組增殖能力明顯降低（P＜0.05）。細(xì)胞克隆實驗結(jié)果顯示，與miR-NC 組相比，miR-146b-3p 組克隆細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。細(xì)胞周期實驗結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-146b-3p組G0/G1 期細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.05），S 期細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示，與miRNC 組相比，miR-146b-3p 組細(xì)胞凋亡率明顯增高（P＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-146b-3p 組細(xì)胞BCL2、CCNB1 和CDK2 蛋白減少（P＜0.05），BAX蛋白增加(P＜0.05)，見圖1。

圖1 miR-146b-3p抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖并促進其凋亡

2.2 miR-146b-3p過表達抑制移植瘤生長

裸鼠移植瘤實驗結(jié)果顯示，觀察組移植瘤體積（468.57±50.63）mm3和體質(zhì)量（0.38±0.04）g明顯小于對照組的體積（287.91±50.63）mm3和體質(zhì)量（0.19±0.02）g（P＜0.05）。隨著時間的推移，移植瘤體積不斷增大，但是觀察組的增長速度明顯慢于對照組（P＜0.05）。RT-PCR 結(jié)果顯示，在裸鼠移植瘤組織中，觀察組中miR-146b-3p mRNA 相對表達量明顯高于對照組（P＜0.05），見圖2。

2.3 miR-146b-3p與LCN1的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，miR-146b-3p 序列3′-UTR 區(qū)與LCN1 存在結(jié)合位點。雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-146b-3p mimic 與LCN1-WT 共轉(zhuǎn)染致熒光素酶活性降低（P＜0.05）。Western blot 和RTPCR實驗結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-146b-3p組中LCN1 mRNA 和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 miR-146b-3p與LCN1的靶向關(guān)系

2.4 LCN1 在肺鱗癌不同臨床特征患者癌組織中的表達水平

TCGA 數(shù)據(jù)庫分析顯示，肺鱗癌組織中LCN1 表達高于癌旁組織（P＜0.05），M1 期患者LCN1 表達高于M0 期患者（P＜0.05），預(yù)后不良患者LCN1 表達高于預(yù)后良好患者（P＜0.05），LCN1 高表達患者總生存率明顯低于LCN1低表達患者（P＜0.05），見圖4。

圖4 LCN1在肺鱗癌不同臨床特征患者癌組織中的表達水平

2.5 敲低LCN1表達抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖并促進其凋亡

Western blot 實驗結(jié)果顯示，與shNC 組相比，shLCN1 1#組和shLCN1 2#組中LCN1 蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，與shNC組相比，shLCN1 1#組和shLCN1 2#組中細(xì)胞增殖能力降低（P＜0.05）。細(xì)胞克隆實驗結(jié)果顯示，與shNC 組相比，shLCN1 1#組和shLCN1 2#組中克隆細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。細(xì)胞周期實驗結(jié)果顯示，與shNC組相比，shLCN1 1#組和shLCN1 2#組G0/G1 期細(xì)胞數(shù)明顯增加，S 期細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示，與shNC 組相比，shLCN1 1#組和shLCN1 2#組中凋亡率明顯增高（P＜0.05），見圖5。

圖5 敲低LCN1表達抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖并促進其凋亡

2.6 miR-146b-3p 靶向LCN1 抑制肺鱗癌增殖并促進其凋亡

Western blot 實驗結(jié)果顯示，與miR-NC 組及miR-146b-3p+LCN1組相比，miR-146b-3p組中LCN1蛋白相對表達水平下降（P＜0.05）。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明，與miR-NC 組及miR-146b-3p+LCN1 組相比，miR-146b-3p 組中增殖能力降低（P＜0.05）。細(xì)胞克隆實驗結(jié)果顯示，與miR-NC 組及miR-146b-3p+LCN1 組相比，miR-146b-3p組中克隆細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。細(xì)胞周期實驗結(jié)果顯示，與miR-NC 組及miR-146b-3p+LCN1 組相比，miR-146-3p 組中G0/G1 期細(xì)胞數(shù)量明顯增加，S 期細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05）。細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示，與miR-NC 組及miR-146b-3p+LCN1組相比，miR-146b-3p組中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.05），見圖6。

圖6 miR-146b-3p靶向LCN1抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖并促進其凋亡

3 討論

肺鱗癌是非小細(xì)胞肺癌的常見類型，早期并無明顯特異性，確診時大多已處于中晚期，錯過了最佳手術(shù)時機，因而通常采取化療等保守治療，但長期使用各種類型的抗癌藥物會導(dǎo)致機體出現(xiàn)耐藥性，從而影響治療效果[13-17]。隨著腫瘤精準(zhǔn)治療的快速發(fā)展，對腫瘤生物學(xué)行為和基因的調(diào)控成為了研究重點。其中miRNA 在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、分化、凋亡、化療耐藥等多種生理過程中起到關(guān)鍵作用[18-19]。本研究旨在尋找影響肺鱗癌生物學(xué)行為的潛在標(biāo)志物，為臨床治療提供理論依據(jù)。

本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-146b-3p在肺鱗癌組織中低表達；LCN1 在肺鱗癌組織中高表達，且LCN1 差異表達與肺鱗癌臨床預(yù)后不良及M 分期有關(guān)。構(gòu)建miR-146b-3p 過表達細(xì)胞模型進行一系列體外功能試驗，結(jié)果顯示，肺鱗癌細(xì)胞過表達miR-146b-3p后，miR-146b-3p表達水平增加，細(xì)胞增殖和克隆能力降低，細(xì)胞周期受到阻滯，細(xì)胞凋亡明顯增加，提示miR-146b-3p 過表達可抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。進一步行Western blot分析顯示，肺鱗癌細(xì)胞過表達miR-146b-3p后，細(xì)胞BCL2、CCNB1和CDK2蛋白減少，BAX 蛋白增加，表明過表達miR-146b-3p 可調(diào)節(jié)肺鱗癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達。促凋亡蛋白BAX 和抗凋亡蛋白BCL2在凋亡信號介導(dǎo)的凋亡過程中起關(guān)鍵作用，BAX 過表達可拮抗BCL2 表達，促進細(xì)胞凋亡。因此，上調(diào)BCL2 表達、下調(diào)BAX 表達可抑制細(xì)胞凋亡。眾所周知，miRNA 通過抑制或降解靶基因mRNA 發(fā)揮生物學(xué)功能[14]。既往研究顯示，miR-146b-5p 可通過靶向調(diào)節(jié)ZNRF2 表達誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[20]。因此，結(jié)合本研究結(jié)果推測miR-146b-3p 可抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，進而阻滯細(xì)胞周期，并通過上調(diào)BAX 和下調(diào)BCL2蛋白表達誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究通過裸鼠移植瘤實驗進一步發(fā)現(xiàn)，miR-146b-3p 過表達可抑制裸鼠移植瘤的生長，證實了miR-146b-3p 過表達在肺鱗癌中發(fā)揮抑制作用。

LCN1 是脂質(zhì)運載蛋白家族的成員，是淚液中重要的脂質(zhì)結(jié)合蛋白，分布在多種組織和腺體中，并與多種疾病的發(fā)生有關(guān)[21-22]。既往研究顯示，LCN1 在乳腺癌中高表達，且其異常表達與臨床病理特征和生存率較低有關(guān)[23]。本研究通過miRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-146b-3p 調(diào)控肺鱗癌細(xì)胞的靶基因，結(jié)果顯示，miR-146b-3p 存在與LCN1 靶向結(jié)合的位點，LCN1 是miR-146b-3p 的靶基因。Western blot 結(jié)果顯示，miR-146b-3p 組中LCN1 蛋白表達水平明顯低于miR-NC組，推測miR146b-3p 可以調(diào)控LCN1 蛋白表達。本研究發(fā)現(xiàn)，肺鱗癌組織中LCN1 表達高于癌旁組織，且與肺鱗癌患者M 分期存在一定關(guān)聯(lián)。為進一步分析LCN1 在肺鱗癌中發(fā)揮的生物學(xué)功能，本研究通過構(gòu)建LCN1 敲低細(xì)胞模型進行體外功能實驗，結(jié)果顯示，LCN1 敲低可以抑制肺鱗癌細(xì)胞生長、增殖，阻滯細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。提示LCN1 在肺鱗癌中高表達，敲低LCN1表達可影響肺鱗癌生物學(xué)行為。

本研究結(jié)果顯示，miR-146b-3p 過表達降低了肺鱗癌細(xì)胞增殖能力，減少了克隆細(xì)胞數(shù)，阻滯了細(xì)胞生長周期，增加了凋亡細(xì)胞數(shù)量；而miR-146b-3p 和LCN1 共轉(zhuǎn)染后，逆轉(zhuǎn)了miR-146b-3p 對肺鱗癌的抑制作用。故我們推測，miR-146b-3p 在肺鱗癌中發(fā)揮促癌作用，其可能通過靶向抑制LCN1 表達調(diào)控肺鱗癌生物學(xué)行為。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)miR-146b-3p 在肺鱗癌細(xì)胞中低表達，LCN1在肺鱗癌細(xì)胞中高表達，且miR-146b-3p與LCN1 存在靶向結(jié)合位點。上調(diào)miR-146b-3p 可以抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并影響細(xì)胞生長周期。而miR-146b-3p 過表達可以抑制移植瘤生長，其作用機制可能是通過靶向LCN1實現(xiàn)的。