李 川,鐘育武,趙展慶（海南西部中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，海南 儋州 571799）

急性胰腺炎是一種常見的胰腺疾病，其嚴(yán)重程度從輕度自限性疾病到重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）不等。其中SAP 是一種急性臨床綜合征，是胰腺局部炎癥病變累及多個器官的全身性疾病，其特點(diǎn)是起病急、進(jìn)展快、并發(fā)癥發(fā)生率高和多器官衰竭，病死率為7%～47%[1]。急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是SAP 的常見并發(fā)癥，預(yù)后極差，尤其是在需要腎替代治療時，病死率為25%～75%[2]。AKI的特點(diǎn)是患者腎排泄功能迅速喪失，一般通過氮代謝終產(chǎn)物（尿素和肌酐）的積累和/或尿量減少來診斷[3]。SAP 患者發(fā)生AKI 的確切機(jī)制較為復(fù)雜，了解SAP 腎損傷的病理學(xué)機(jī)制可能為危重癥患者的治療提供新的方向。

正五聚蛋白3（pentraxin 3，PTX3）是正五聚蛋白家族的成員之一，主要產(chǎn)生于炎癥部位，在宿主防御、癌癥生物學(xué)、自身免疫、血管生成調(diào)節(jié)和組織修復(fù)等一系列事件中具有重要作用[4]。研究表明，PTX3 是唯一能在腎組織中檢測到的戊聚糖，危重癥患者發(fā)生AKI后，血清和尿液中PTX3 含量明顯升高[5]。然而，PTX3在SAP 誘導(dǎo)的AKI 中的作用尚未闡明。本研究探討PTX3 在SAP 誘導(dǎo)的腎損傷小鼠中的作用及其可能的機(jī)制，以期為SAP誘導(dǎo)的AKI提供治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料

40 只雄性BALB/c 小鼠，體質(zhì)量（22±2）g，7～8 周齡，購自海南藥物研究所有限責(zé)任公司，動物使用許可證號：SYXK（瓊）2020-0025。小鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物房，環(huán)境溫度（22±3）℃，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。所有動物都得到了人道主義的照顧，所有動物實(shí)驗(yàn)均按照國家實(shí)驗(yàn)動物管理法規(guī)和海南醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會規(guī)定進(jìn)行。

PTX3 單克隆抗體和左旋精氨酸購自美國Sigma公司；重組小鼠PTX3 購自美國R&D 公司；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-4 和IL-13 檢測試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；iNOS、CD16/32 和GAPDH 抗體購自英國Abcam 公司；CD206 和Arg-1 抗體購自美國圣克魯斯生物技術(shù)有限公司；一步法TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 SAP小鼠模型建立[6]及干預(yù)處理

40只小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為空白對照組、SAP 組、PTX3 組和anti-PTX3 組，每組10 只。PTX3 組和anti-PTX3 組小鼠分別腹腔注射重組小鼠PTX3（0.5 mg/kg）[7]和PTX3單克隆抗體（0.2 mg/kg）；空白對照組和SAP組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。然后SAP組小鼠腹腔注射20%左旋精氨酸（4 mg/g），PTX3 組和anti-PTX3 組小鼠分別于給藥48 h、24 h 之后腹腔注射20%左旋精氨酸（4 mg/g）；1 h 后，各組再次腹腔注射20%左旋精氨酸（4 mg/g）。若小鼠表現(xiàn)為腹部收縮明顯，痛苦異常，且伴有間歇性嘔吐，則視為建模成功[8]。注射結(jié)束后，小鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.3 血清生化指標(biāo)檢測

小鼠最后一次干預(yù)24 h 后麻醉，眼球采血。血液靜置離心后，取上層血清，于-80 ℃保存。全自動生化分析儀檢測血清淀粉酶（amylase，AMY）、肌酐（creatinine，Cr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。

1.4 HE染色檢測胰腺和腎組織病理學(xué)變化

小鼠最后一次干預(yù)24 h 后麻醉，眼球采血后處死小鼠。取胰腺和腎組織，用4%多聚甲醛固定72 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明；石蠟包埋、切片。石蠟切片常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水，蘇木素染色10 min，0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水洗滌后，伊紅浸染3 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察。

對胰腺組織進(jìn)行病理學(xué)評分，評分標(biāo)準(zhǔn)：輕度水腫、炎癥和出血各計(jì)1 分；中度水腫、炎癥和出血各計(jì)2 分；重度水腫、炎癥和出血各計(jì)3 分；此外，局灶性壞死計(jì)3分，片狀壞死計(jì)5分，小葉壞死計(jì)7分[9]。對腎小管損傷進(jìn)行評分：無損傷計(jì)0 分；＜25%損傷計(jì)1 分；25%～＜50%損傷計(jì)2 分；50%～75%損傷計(jì)3 分；＞75%損傷計(jì)4 分[10]。分值越高說明胰腺及腎組織損傷越嚴(yán)重。

1.5 TUNEL染色檢測腎組織細(xì)胞凋亡情況

使用1.4 項(xiàng)下制備的腎組織石蠟切片，并常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水，用蛋白酶K 于37 ℃孵育15 min。PBS 洗滌后，添加TUNEL 檢測液，37 ℃避光孵育60 min。DAPI 染核，PBS 洗滌3 次后，用抗熒光淬滅封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.6 ELISA檢測IL-6、TNF-α、IL-4和IL-13水平

取出凍存的血清解凍，另取胰腺組織研磨后的上清液。按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α、IL-4和IL-13水平。

1.7 Western blot 檢測PTX3、iNOS、CD16/32、CD206和Arg-1蛋白表達(dá)

取各組小鼠腎組織剪碎，RIPA 裂解液裂解組織，離心取上清，BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 分離并轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入PTX3（1∶1 000）、iNOS（1∶1 000）、CD16/32（1∶1 000）、CD206（1∶1 000）、Arg-1（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）抗體，于4 ℃孵育過夜。加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h 后，滴加BeyoECL Star 工作液到膜上，使用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測腎組織中M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞比例

取各組小鼠腎組織剪碎，加入消化液于37 ℃消化30 min。移液槍吹打分散細(xì)胞后，過200 目銅網(wǎng)。800 r/min 離心5 min，去上清。PBS 清洗細(xì)胞2 次，800 r/min 離心5 min 去上清，使用DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后以1×106個/孔多密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，制備單個核細(xì)胞懸液，加入佛波酯（終濃度30 ng/mL）[11]刺激2 h。細(xì)胞離心去上清，PBS 重懸細(xì)胞，加入iNOS（1∶2 000）、CD16/32（1∶3 000）、CD206（1∶3 000）和Arg-1（1∶3 000）抗體，室溫孵育30 min，PBS 洗滌細(xì)胞。熒光二抗避光孵育30 min，PBS 洗滌細(xì)胞并重懸。上流式細(xì)胞儀檢測M1型和M2型巨噬細(xì)胞比例。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠胰腺組織病理學(xué)變化

空白對照組小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常損傷。與空白對照組相比，SAP 組、PTX3 組和anti-PTX3組小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)紊亂，胰腺組織病理學(xué)評分升高（P＜0.05）；與SAP 組相比，PTX3 組小鼠胰腺結(jié)構(gòu)損傷加重，胰腺組織病理學(xué)評分明顯升高（P＜0.05）；anti-PTX3組胰腺組織病理學(xué)變化較SAP組和PTX3組明顯改善，具有更好的結(jié)構(gòu)完整性，炎癥細(xì)胞的浸潤減少，胰腺組織病理學(xué)評分明顯降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 小鼠胰腺組織病理學(xué)變化

2.2 各組小鼠PTX3表達(dá)變化

與空白對照組相比，SAP 組、PTX3 組和anti-PTX3組小鼠PTX3 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與SAP 組相比，PTX3 組小鼠PTX3 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），anti-PTX3 組小鼠PTX3 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 Western blot檢測小鼠PTX3蛋白表達(dá)

2.3 各組小鼠血清生化指標(biāo)比較

與空白對照組相比，SAP 組、PTX3 組和anti-PTX3組小鼠AMY、BUN 和Cr 水平升高（P＜0.05）；與SAP 組相比，PTX3 組小鼠AMY、BUN 和Cr 水平明顯升高（P＜0.05），anti-PTX3組小鼠AMY、BUN和Cr水平明顯降低（P＜0.05）；與PTX3 組相比，anti-PTX3 組小鼠AMY、BUN和Cr水平明顯降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠血清AMY、BUN和Cr水平比較(±s，n=10)

表1 各組小鼠血清AMY、BUN和Cr水平比較(±s，n=10)

*：與空白對照組比較，P＜0.05；#：與SAP 組比較，P＜0.05；△：與PTX3組比較，P＜0.05

組別空白對照組SAP組PTX3組anti-PTX3組AMY（U/L）2 464.92±329.34 9 174.38±634.57*11 273.05±856.48*#3 746.92±478.51*#△BUN（mmol/L）7.29±0.83 16.16±1.74*21.53±2.26*#7.85±0.90*#△Cr（μmol/L）12.73±1.16 18.76±1.45*23.76±2.14*#13.09±1.24*#△

2.4 各組小鼠腎組織病理學(xué)變化

空白對照組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常損傷。與空白對照組相比，SAP 組、PTX3 組和anti-PTX3 組小鼠腎小管伴有炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管損傷評分升高（P＜0.05）；與SAP 組相比，PTX3 組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)損傷加重，腎小管損傷評分明顯升高（P＜0.05），anti-PTX3組腎組織病理學(xué)變化明顯改善，腎小管結(jié)構(gòu)完整性更佳，腎小管損傷評分明顯降低（P＜0.05）；與PTX3組相比，anti-PTX3 組腎小管損傷顯著降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 小鼠腎組織病理學(xué)變化

2.5 各組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡率比較

與空白對照組相比，SAP 組、PTX3 和anti-PTX3 組小鼠細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與SAP 組相比，PTX3組小鼠細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），anti-PTX3組小鼠細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）；與PTX3 組相比，anti-PTX3 組小鼠細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 腎組織細(xì)胞凋亡情況

2.6 各組小鼠IL-6、TNF-α、IL-4和IL-13水平比較

與空白對照組相比，SAP 組、PTX3 組和anti-PTX3組小鼠血清和胰腺組織中IL-6 和TNF-α 水平升高（P＜0.05），IL-4 和IL-13 水平明顯降低（P＜0.05）；與SAP 組相比，PTX3 組小鼠血清和胰腺組織中IL-6 和TNF-α水平明顯升高（P＜0.05），IL-4和IL-13水平明顯降低（P＜0.05），anti-PTX3 組小鼠血清和胰腺組織中IL-6和TNF-α 水平明顯降低（P＜0.05），IL-4和IL-13水平明顯升高（P＜0.05）；與PTX3組相比，anti-PTX3組小鼠血清和胰腺組織中IL-6 和TNF-α 水平明顯降低（P＜0.05），IL-4 和IL-13 水平明顯升高（P＜0.05），見表2、3。

表2 各組小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-4和IL-13水平比較(±s，n=10，pg/mL)

表2 各組小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-4和IL-13水平比較(±s，n=10，pg/mL)

*：與空白對照組比較，P＜0.05；#：與SAP組比較，P＜0.05；△：與PTX3組比較，P＜0.05

組別空白對照組SAP組PTX3組anti-PTX3組IL-6 43.52±6.78 196.34±21.57*262.48±33.62*#119.23±13.59*#△TNF-α 24.69±4.18 77.56±8.94*116.27±12.69*#48.35±6.68*#△IL-4 156.78±16.14 93.49±11.87*62.56±8.44*#136.20±12.60*#△IL-13 175.06±18.83 113.49±15.67*71.78±8.40*#152.17±14.87*#△

表3 各組小鼠胰腺組織IL-6、TNF-α、IL-4和IL-13水平比較(±s，n=10，pg/mL)

表3 各組小鼠胰腺組織IL-6、TNF-α、IL-4和IL-13水平比較(±s，n=10，pg/mL)

*：與空白對照組比較，P＜0.05；#：與SAP組比較，P＜0.05；△：與PTX3組比較，P＜0.05

組別空白對照組SAP組PTX3組anti-PTX3組IL-6 68.47±5.64 329.86±26.35*453.86±29.75*#148.73±17.83*#△TNF-α 43.76±5.29 129.74±11.25*204.82±24.85*#73.78±12.62*#△IL-4 285.48±24.73 128.38±16.48*79.27±6.62*#197.58±20.61*#△IL-13 387.72±31.26 185.29±11.83*113.49±13.25*#274.94±23.61*#△

2.7 各組小鼠M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物蛋白水平比較

與空白對照組相比，SAP 組、PTX3 組和anti-PTX3組小鼠iNOS和CD16/32蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），CD206 和Arg-1 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與SAP組相比，PTX3 組小鼠iNOS 和CD16/32 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），CD206 和Arg-1 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），anti-PTX3 組小鼠iNOS 和CD16/32 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），CD206 和Arg-1 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與PTX3 組相比，anti-PTX3 組小鼠iNOS 和CD16/32 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），CD206和Arg-1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），見圖5。

圖5 Western blot檢測小鼠iNOS、CD16/32、CD206和Arg-1蛋白表達(dá)

2.8 各組小鼠腎組織中M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞比例比較

與空白對照組相比，SAP組小鼠M1型巨噬細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.05），M2 型巨噬細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.05）；與SAP 組相比，PTX3 組小鼠M1 型巨噬細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.05），M2 型巨噬細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.05），anti-PTX3 組小鼠M1 型巨噬細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.05），M2 型巨噬細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.05）；與PTX3 組比較，anti-PTX3 組小鼠M1 型巨噬細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.05），M2 型巨噬細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠腎組織中M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞比例比較(±s，n=10，%)

表4 各組小鼠腎組織中M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞比例比較(±s，n=10，%)

*：與空白對照組比較，P＜0.05；#：與SAP 組比較，P＜0.05；△：與PTX3組比較，P＜0.05

組別空白對照組SAP組PTX3組anti-PTX3組M1型巨噬細(xì)胞比例1.35±0.08 6.20±0.27*13.82±0.84*#3.64±0.21*#△M2型巨噬細(xì)胞比例5.16±0.37 2.18±0.09*1.23±0.05*#3.45±0.12*#△

3 討論

SAP 被認(rèn)為是導(dǎo)致危重癥患者發(fā)生AKI的主要危險因素，其發(fā)病率不斷上升[12]。AKI 以血清Cr 和BUN升高為特征，是SAP 的嚴(yán)重并發(fā)癥，病死率高，是SAP患者常見的死亡原因之一[13]。SAP 患者發(fā)生AKI 的機(jī)制可能涉及多種因素。因此，研究SAP 誘導(dǎo)的腎損傷過程及潛在發(fā)病機(jī)制可能為治療SAP提供新方向。

PTX3是一種新型的AKI標(biāo)志物，與慢性腎損傷有關(guān)，其可引起急性缺血性腎損傷[14-15]，但具體機(jī)制尚不清楚。研究表明，PTX3在AKI患者的血清和尿液中高表達(dá)[5]。本研究建立了SAP 小鼠模型，并通過過表達(dá)和敲減PTX3 探究其在SAP 小鼠中的作用，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，SAP 組小鼠存在明顯的胰腺和腎損傷，且過表達(dá)PTX3 后，小鼠癥狀加重，而敲低PTX3后，小鼠癥狀減輕，以上結(jié)果提示PTX3 對SAP 誘導(dǎo)的腎損傷具有促進(jìn)作用，與相關(guān)研究[14-15]報(bào)道的PTX3 可作為腎損傷的標(biāo)志物相一致，但PTX3促進(jìn)AKI發(fā)展的具體機(jī)制仍不清楚。

炎癥滲出和炎癥介質(zhì)的過度釋放是SAP 腎損傷的重要機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）主動進(jìn)入胰腺組織，誘導(dǎo)TNF-α 和IL-6 等炎癥細(xì)胞因子的快速產(chǎn)生和釋放，在局部胰腺炎癥和全身并發(fā)癥中起重要作用[16]。TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-8 等通過促進(jìn)炎癥細(xì)胞活化和向腎募集，增加腎小球通透性，引起腎小管和間質(zhì)組織的損傷，促進(jìn)AKI的毒性損傷[17]。有研究表明，胰腺炎患者血漿中PTX3 水平升高，PTX3 水平與胰腺炎患者IL-6、IL-8、TNF-α及APACHEⅡ評分、Ranson評分均呈顯著正相關(guān)[14-15]。本研究結(jié)果顯示，相比于空白對照組，SAP 組小鼠PTX3 表達(dá)升高，促炎因子IL-6 和TNF-α水平明顯升高，抑炎因子IL-4和IL-13水平明顯降低，過表達(dá)PTX3 則加重上述變化，而敲低PTX3 后則可逆轉(zhuǎn)上述變化。表明PTX3 可促進(jìn)SAP 誘導(dǎo)的腎損傷小鼠的炎癥反應(yīng)。

PTX3 可通過炎癥因子（IL-1β、IL-6 和TNF-α）、脂多糖或外膜蛋白A等刺激，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活或直接與受體結(jié)合改變巨噬細(xì)胞分化和極化來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體天然免疫[18]。Th1細(xì)胞分泌IFN-γ 和TNF-α，刺激巨噬細(xì)胞向促進(jìn)炎癥的M1型分化，而IL-4和IL-13主要由Th2細(xì)胞分泌，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型分化[19]。有研究表明，在永生化異位子宮內(nèi)膜異位基質(zhì)細(xì)胞中，補(bǔ)體成分3/PTX3通過促進(jìn)THP1 巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1 表型分化[20]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)PTX3可上調(diào)SAP 小鼠腎組織中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS和CD16/32 表達(dá)及M1 型巨噬細(xì)胞比例，下調(diào)M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206、Arg-1 表達(dá)及M2 型巨噬細(xì)胞比例，而敲減PTX3 則可逆轉(zhuǎn)上述變化。推測PTX3 可能促進(jìn)SAP誘導(dǎo)的腎損傷小鼠腎組織中巨噬細(xì)胞M1/M2的轉(zhuǎn)化。

綜上所述，PTX3 可能通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 型分化，抑制M2 型分化，促進(jìn)小鼠腎組織的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)SAP 小鼠誘發(fā)腎組織細(xì)胞凋亡和腎損傷。本研究結(jié)果為明確SAP誘發(fā)AKI的發(fā)病機(jī)制及開發(fā)新的治療靶點(diǎn)提供了新的科學(xué)依據(jù)。