趙瓊 ,魏文海 ,李靜蕓 ,?；勖?,王磊 ,柴國祥 ,韓婕,李興芳

1甘肅中醫(yī)藥大學,蘭州 730030;2 蘭州市肺科醫(yī)院,蘭州 730030;3 蘭州大學 第一醫(yī)院,蘭州 730030;4 甘肅省中醫(yī)院,蘭州730050

結核病是結核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病,可侵襲人體多組織器官。研究[1]顯示,肺結核和糖尿病的發(fā)生發(fā)展及轉歸關系密切,糖尿病是肺結核發(fā)病的高危因素,且患者預后普遍較差。肺結核和糖尿病的發(fā)生均離不開遺傳因素調控,探究遺傳因素在糖尿病并發(fā)肺結核發(fā)病機制中的相關作用,對糖尿病并發(fā)肺結核高危人群的篩查及防控有重要臨床意義。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)因其在人類基因組中的高密度和相對均勻分布而成為首選的遺傳標記,并已被廣泛應用于精細定位疾病位點和候選基因關聯(lián)研究[2]。本課題選取 CYP4F2 和CYP24A1基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點進行分析,探討CYP4F2和CYP24A1基因多態(tài)性與結核病并糖尿病易感性的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取230例肺結核并糖尿病患者作為肺結核并糖尿病(Case)組,其中女性95例、男性135例,吸煙者157例、不吸煙者73例,飲酒者157例、不飲酒者73例。選取同期212例體檢健康者作為對照(Control)組,其中女性80 例、男性132 例,吸煙者134例、不吸煙者78例,飲酒者141例、不飲酒者71例。兩組研究對象基本臨床信息比較,組間年齡、性別、吸煙和飲酒習慣差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。本課題獲得甘肅中醫(yī)藥大學醫(yī)學倫理委員會的批準,研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

采集外周靜脈血2 mL,EDTA 抗凝,使用Axy PreP血基因組DNA 小量試劑盒(購自Axygen公司)提取DNA。

1.2.2 基因位點的PCR擴增

選取CYP4F2 基因的rs 2 108 622位點和rs 3 093 106位點,CYP24A1基因的rs 2 762 934位點和rs 2 296 241位點,使用實時熒光定量PCR 反應技術中的Taq Man熒光探針技術,采用ABI公司的Taq Man Universal PCR master Mix試劑盒(內含d NTP、PCR 緩沖液和DNA 聚合酶)、SNP Genoty-Ping Product試劑盒(內含引物、探針)對位點進行基因分型。按照標準96孔板模式在ABI-7 500 fast實時熒光定量PCR 儀上進行定量PCR 反應,實現(xiàn)快速檢測。反應體系成分見表1。反應條件:95 ℃10 min的預變性,然后92℃15 s退火、60℃1 min延伸共40個循環(huán)。PCR 反應結束后,在ABI 7500 fast儀器上使用SDSv1.63版本的終點分析軟件包讀取檢測結果。

表1 PCR反應體系成分

1.2.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析,檢驗各組變量的正態(tài)分布情況。正態(tài)分布的計量資料表達為x-±s,非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)及四分位間距表示,組間比較采用非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis H 檢驗)。計數(shù)資料以百分數(shù)表示,組間比較采用χ2檢驗。將所有基因型,用Hardy-Weinberg平衡原理估測樣本的群體代表性,采用logistics回歸模型計算相對優(yōu)勢比(ORs)及其95%置信區(qū)間(confidence intervals CIs)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

為評估樣本的群體代表性,采用χ2檢驗對Case組和Control組4個SNP位點的基因分型結果進行分析。Case組和Control組的位點Hardy-Weinberg平衡檢驗P＞0.05,提示納入的樣本來自可隨機婚配的穩(wěn)定群體,具有群體代表性。見表2。

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

2.3 基因型分布比較

計算Case組和Control組不同位點的基因型頻率并進行組間比較,CYP4F2 rs 2 108 622和rs 3 093 106位點,CYP24A1 rs 2 296 241位點的基因型頻率在Case組和Control組中無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);CYP24A1 rs 2 762 934位點AG 基因型頻率Case組高于Control組,GG 和AA 基因型頻率Case組低于Control組,組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見表3。

表3 Case組和Control組基因型分布比較

2.4 各SNP位點等位基因頻率比較

對4個SNP位點分別統(tǒng)計計算等位基因頻率并進行組間比較:CYP4F2 rs 2 108 622 和rs 3 093 106位點,CYP24A1 rs 2 296 241位點的基因型頻率分布在Case組和Control組中差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);CYP24A1 rs 2 762 934位點的A等位基因的頻率Case組高于Control組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表4。

表4 Case組和Control組各SNP位點等位基因頻率比較

2.5 不同遺傳模型下rs 2 762 934位點基因型的比較

對于上述基因型趨勢分析中P＜0.05 的rs 2 762 934位點作進一步分析,rs 2 762 934位點的等位基因為A/G 二態(tài)型,野生型均為A。由于未知基因型與表達方式的關系,從以下遺傳模型分別進行分析:共顯性模型AG vs GG,AA vs GG;顯性模型GG vs AG-AA;隱性模型GG-AG vs AA;超顯性模型GG-AA vs AG。rs 2 762 934位點基因型共顯性模型(AG vs GG,AA vs GG)具有統(tǒng)計學意義,基因型AG較基因型GG發(fā)生Case的OR值為1.90(P=0.003,95%CI=1.28～2.81),基因型AA 較基因型GG 發(fā)生Case的OR 值為0.58(P=0.003,95%CI=0.14～2.38)。顯性模型(AG-AA vs GG)的OR值為1.79(P=0.003,95%CI=1.22～2.63),具有統(tǒng)計學差異。隱性模型(AA vs G G-AG)的OR 值為0.45(P=0.25,95%CI=0.11～1.84),無統(tǒng)計學差異。超顯性模型(AG vs GG-AA)的OR值為1.93(P=0.001,95%CI=1.31～2.86),具有統(tǒng)計學差異。見表5。

表5 rs2762934位點基因型在不同遺傳模型下的比較

3 討論

CYP4F2和CYP24A1是CYP450家族成員之一。CYP4F2是人體代謝花生四烯酸(AA)生成具有調節(jié)腎功能和血管張力的20-HETE 最主要的代謝酶。20-HETE水平升高與血管氧化應激、內皮功能障礙和高輸精管外周阻力有關,參與血壓、腎功能、腦血流、肺循環(huán)等多種血管事件的調節(jié)[3]。CYP4F2被認為是是糖尿病和高血壓及心腦血管疾病的重要候選基因。由CYP24A1 基因編碼的25(OH)D3-24-羥化酶是維生素D 代謝關鍵酶,維生素D 本身沒有生物活性,進入血液循環(huán)后在肝臟中轉化為25(OH)D3,并在腎臟中進一步轉化為具有生物活性的1,25(OH)2D3。25(OH)D3-24-羥化酶催化25(OH)D3和1,25(OH)2D3降解為24-羥基化產物,導致維生素D 失活。近年來,越來越多的研究[4-5]表明,維生素D 缺乏會增加糖尿病的發(fā)病風險。人們在全基因組關聯(lián)研究(GWAS)中發(fā)現(xiàn)了許多可影響血清維生素D 濃度的基因多態(tài)性位點,其中包括維生素D 代謝基因CYP24A1[6]。目前已有研究[7]表明,CYP24A1基因多態(tài)性與糖尿病關系密切。CYP24A1 rs 2 296 241攜帶A 等位基因是移植術后糖尿病的危險因素。CYP24A1基因rs 2 248 359、rs 6 068 816位點和2型糖尿病具有顯著的關聯(lián)性[8]。CYP24A1 rs 4 809 957等位基因G在2型糖尿病家族中的傳遞失衡,并導致維生素D缺乏[9]。但目前尚無CYP4F2基因rs 2 108 622和rs 3 093 106位點,CYP24A1基因的rs 2 762 934位點和rs 2 296 241位點與肺結核并糖尿病相關性的研究報道。

為了解CYP4F2和CYP24A1基因多態(tài)性與肺結核并糖尿病的相關性,本研究選取肺結核并糖尿病患者230例和體檢健康者212例作為研究對象,對CYP4F2 rs 2 108 622 和rs 3 093 106位點,CYP24A1基因的rs 2 762 934位點和rs 2 296 241位點進行分析,所檢測得到的SNP基因頻率均達到Har-dy-Weinberg遺傳平衡(P＞0.05),提示納入的樣本來自可隨機婚配的穩(wěn)定群體,具有群體代表性。

本研究結果顯示,CYP4F2 rs 2 108 622和rs 3 093 106位點、CYP24A1 rs 2 296 241位點的基因型和等位基因頻率在Case組和Control組中無均統(tǒng)計學差異,提示上述位點與肺結核并糖尿病不相關。CYP24A1 rs 2 762 934位點AG 基因型頻率Case組高于Control組,GG 和AA 基因型頻率Case組低于Control組,組間差異具有統(tǒng)計學意義,提示基因型雜合子個體較純合子個體發(fā)生Case的風險增加。rs 2 762 934位點A 等位基因的頻率Case組高于Control組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),提示A 等位基因是Case的風險基因。在顯性模型條件下(AG-AA vs GG),攜帶A 等位基因的個體較未攜帶A 等位基因的個體發(fā)生Case的風險増加1.79倍。超顯性模型條件下(GG-AA vs AG)下,基因型純合子個體較雜合子個體發(fā)生Case的風險増加1.93倍,具有統(tǒng)計學差異。而在隱性模型(GG-AG vs AA)條件下,Case組和Control組的基因型頻率差異沒有統(tǒng)計學意義。上述不同遺傳模型的分析進一步表明:rs 2 762 934位點基因型雜合子個體較純合子個體發(fā)生Case的風險增加,A 等位基因是Case的風險基因。

綜上所述,CYP4F2 rs 2 108 622 和 rs 3 093 106位點,CYP24A1 rs 2 296 241位點與肺結核并糖尿病均不相關。CYP24A1位點多態(tài)性與肺結核并糖尿病相關,基因型雜合子個體比純合子個體發(fā)生肺結核并糖尿病的風險高,A 等位基因可能增加患病風險。