馬少青,張丁強(qiáng),王學(xué)瑞,于可可,蒲曉輝,袁琦

河南大學(xué) 藥學(xué)院,河南 開封475001

柚皮素(Naringin,NAR)是由蕓香科植物葡萄柚及柑橘類水果中提取的黃酮類化合物,具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性,可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能,抑制腫瘤生長(zhǎng)[1-3]。紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是一種具有抗癌活性的二萜類生物堿化合物,屬于微管穩(wěn)定劑,可以穩(wěn)定分裂間期細(xì)胞的微管蛋白,從而阻止癌癥細(xì)胞的有絲分裂[4]。

紫杉醇前藥裝載柚皮素膠束(NAR/MDSP 膠束),利用MDSP(聚乙二醇單甲醚-去氧膽酸-二硫鍵-紫杉醇)膠束中二硫鍵的還原敏感性和聚乙二醇-去氧膽酸的抗多藥耐藥性,可以實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、高效率的傳輸藥物。而NAR 能夠激活體內(nèi)免疫細(xì)胞,釋放大量免疫因子[5]。因此,NAR/MDSP膠束可以延長(zhǎng)NAR 與PTX 在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間,實(shí)現(xiàn)NAR 與PTX 的共同遞送,達(dá)到雙靶向協(xié)同抗腫瘤MDR 的智能釋藥。本文提供了一種同時(shí)測(cè)定NAR/MDSP 膠束中NAR 和PTX 含量的方法,該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,可用于快速測(cè)定膠束中NAR和PTX 的含量,為NAR/MDSP膠束的進(jìn)一步研發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐,助力于雙靶向協(xié)同抗腫瘤MDR 智能釋藥型納米藥物紫杉醇前藥裝載柚皮素膠束的研究。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

柚皮素對(duì)照品(濰坊華植生物科技有限公司,批號(hào):CAS480-41-1),紫杉醇對(duì)照品(南京景竹生物科技有限公司,批號(hào):CAS33069-62-4),甲醇為色譜純,其它試劑均為分析純;紫杉醇前藥MDCP(聚乙二醇單甲醚-去氧膽酸-丁二酸酐-紫杉醇)和MDSP(聚乙二醇單甲醚-去氧膽酸-二硫鍵-紫杉醇)(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Waters高效液相色譜儀(沃特世科技(上海)有限公司;紫外可見分光光度計(jì)UV-2600(日本島津公司);超聲波清洗儀(北京泰元達(dá)精密清洗機(jī));雷磁PHS-3C PH 計(jì)(杭州美尼特自動(dòng)化儀表有限公司);ZWY-103D 型恒溫培養(yǎng)振蕩器(長(zhǎng)沙諾達(dá)儀器設(shè)備有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 NAR/MDSP膠束的制備

2 mg NAR 和10 mg MDSP溶于10 mL的甲醇,室溫下攪拌45 min,1 800 r·min-1旋干后加入15 mL超純水,45 ℃油浴1 400 r·min-1攪拌2 h,3 000 r·min-1離心10 min,制得NAR/MDSP 膠束。

2.1.2 溶液的制備

①NAR 和PTX 對(duì)照品混合儲(chǔ)備液

分別精密稱取NAR 對(duì)照品和PTX 對(duì)照品,用甲醇溶解后定容,搖勻,制成混合對(duì)照溶液作為對(duì)照儲(chǔ)備液。其中NAR 的濃度為10.00μg·mL-1,PTX 的濃度為10.02μg·mL-1。

②MDSP溶液

精密稱取自制MDSP材料,用甲醇進(jìn)行定量稀釋。

③NAR/MDSP膠束溶液

精密稱取制備的NAR/MDSP 膠束,用甲醇進(jìn)行定量稀釋。

2.2 色譜條件

色譜柱:Waters Symmetry C18色譜柱(250×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇∶水=72∶28(V∶V),檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm,柱溫30 ℃,流速1 mL/min,進(jìn)樣量20μL。NAR 與PTX 的分離度為5.750,峰形良好。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取NAR 和PTX 對(duì)照品混合儲(chǔ)備液稀釋后進(jìn)樣,記錄色譜圖。NAR 與PTX 的保留時(shí)間分別為9.975 min和4.495 min,峰形良好。稀釋后的NAR和PTX 對(duì)照品混合儲(chǔ)備液重復(fù)進(jìn)樣6次,NAR 峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.003%,PTX 峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.061%,NAR 和PTX 峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%。系統(tǒng)適用性符合要求。

2.4 專屬性試驗(yàn)

分別取陰性對(duì)照品溶液(空白溶劑)、MDSP材料、NAR/MDSP膠束、NAR 和PTX的對(duì)照品混合溶液,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,結(jié)果見圖1。

由圖1可知,溶劑陰性對(duì)照品溶液在4.495 min和9.975 min均無吸收。對(duì)照品混合溶液在4.495 min和9.975 min產(chǎn)生吸收,說明NAR 的保留時(shí)間為4.495 min,PTX 的保留時(shí)間為9.975 min。MDSP的溶液在4.495 min無吸收,在9.975 min有明顯吸收,說明MDSP 對(duì)NAR 的測(cè)定無干擾,在9.975 min的吸收峰是MDSP中PTX 產(chǎn)生的吸收。NAR/MDSP膠束在4.495 min和9.975 min均有吸收,為NAR/MDSP膠束溶液中NAR 和PTX 產(chǎn)生的吸收。由圖1～4可知,NAR 和PTX 的色譜峰峰形良好,無干擾峰,且分離度符合要求。表明方法專屬性強(qiáng),可用于紫杉醇前藥裝載柚皮素膠束中同時(shí)測(cè)定柚皮素與紫杉醇的含量。

圖1-1 陰性對(duì)照品的HPLC圖

圖1-2 NAR和PTX的HPLC圖

圖1-3 MDSP材料的HPLC圖

圖1-4 NAR/MDSP膠束的HPLC圖

2.5 線性范圍

精密量取NAR 和PTX 的對(duì)照品混合儲(chǔ)備液用甲醇稀釋,得NAR 的PTX 的梯度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,NAR的濃度分別為0.312 5、0.625 0、1.250、2.500、5.000、和10.00μg·mL-1,PTX 的濃度分別為0.312 0、0.630 0、1.280、2.520、5.010、和10.02 μg·mL-1的溶液,按“2.2”項(xiàng)下條件,注入液相色譜儀,分別以質(zhì)量濃度(x,μg·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見圖2。NAR 的回歸方程分別為:Y=81 183X+302.03,R2=0.999 9;PTX 的回歸方程分別為:Y=71 381X-13 875,R2=0.999 9。結(jié)果表明,NAR 在0.312 5～10.00μg·mL-1,PTX 在0.312 0～10.02 μg·mL-1,峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取低中高三個(gè)濃度的NAR/MDSP 膠束溶液,分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h后,注入液相色譜儀,測(cè)定色譜峰面積,把峰面積帶入2.5項(xiàng)下回歸方程中,計(jì)算NAR 和PTX 的濃度,結(jié)果見表1。由表1 可知,NAR 和PTX 的RSD 值均小于1.5%,表明NAR/MDSP 膠束溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖2 柚皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、紫杉醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 NAR和PTX穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.7 精密度試驗(yàn)

取NAR/MDSP膠束溶液6份,其中NAR的濃度為5.000μg·mL-1,PTX 的濃度為5.010 μg·mL-1,注入液相色譜儀,測(cè)定色譜峰面積,把峰面積帶入2.5項(xiàng)下回歸方程中,計(jì)算濃度,結(jié)果見表2。NAR 的RSD 值為0.54,PTX 的RSD 值為0.97,均小于0.97%,符合規(guī)定。

表2 NAR和PTX重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.8 回收率試驗(yàn)

精密量取5ml,PTX 濃度為5μg·mL-1的MDSP溶液,置于10 mL 量瓶中,分別精密加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1.5、2.5和3.5 mL,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,制備低、中、高3 個(gè)濃度的MDSP 膠束溶液,每個(gè)濃度制備3份樣品,按2.2項(xiàng)下條件,注入液相色譜儀,測(cè)定色譜峰面積,把峰面積帶入2.5項(xiàng)下回歸方程中,結(jié)果見表3。

表3 NAR和PTX的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.9 NAR/MDSP膠束中NAR和PTX的測(cè)定

精密稱取NAR/MDSP 膠束,用甲醇稀釋,定容,配制成1mg·mL-1的溶液,按2.2項(xiàng)下條件,注入液相色譜儀,測(cè)定色譜峰面積,把峰面積帶入2.5項(xiàng)下回歸方程中,計(jì)算NAR 和PTX 的濃度,結(jié)果見表4。

表4 NAR/MDSP膠束中紫杉醇和柚皮素的測(cè)定(n=3)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別取MDSP材料和NAR 對(duì)照品適量,溶于甲醇,以甲醇為空白,在200～600 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,得到圖3。在圖3 中,MDSP 在227 nm有明顯吸收,NAR 在227 nm 和288 nm 有明顯吸收,因此選擇227 nm 做為紫杉醇前藥裝載柚皮素膠束中同時(shí)測(cè)定PTX 和NAR 的檢測(cè)波長(zhǎng)。根據(jù)MDSP的構(gòu)成可知,MDSP 在溶液中可以釋放出PTX。因此推測(cè),MDSP溶液在227 nm 的吸收,是由PTX 產(chǎn)生的。

圖3 NAR與MDCP、MDSP材料的檢測(cè)波長(zhǎng)圖

3.2 溶劑的選擇

我們考察了在室溫下,NAR 對(duì)照品和PTX 對(duì)照品在純化水和不同pH 值水溶液中的溶解度,結(jié)果見表5。NAR 在純化水和不同pH 值水溶液中的溶解度都很小,NAR 在pH 5.8磷酸鹽緩沖液中溶解度最大,但也只有42.54±0.24μg·mL-1,NAR 在純化水中平衡溶解度僅為37.67±1.83 μg·mL-1,pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中平衡溶解度為35.91±0.32μg·mL-1。PTX 在純化水和不同pH 值水溶液中的溶解度更小,在純化水中最大,也僅為0.103±0.56μg·mL-1。表5中的數(shù)據(jù)說明,NAR 和PTX 均難溶于水[6]。因此,在進(jìn)行方法學(xué)考察時(shí),我們選擇了甲醇作為溶劑。

表5 PTX和NAR在不同介質(zhì)中的溶解度(n=3)

我們建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定紫杉醇前藥裝載柚皮素膠束中柚皮素與紫杉醇含量的方法,通過方法學(xué)驗(yàn)證,該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,可用于紫杉醇前藥裝載柚皮素膠束中柚皮素與紫杉醇的含量測(cè)定,為紫杉醇前藥裝載柚皮素膠束的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐,可用于紫杉醇前藥裝載柚皮素膠束的表征,有助于新型抗癌藥物紫杉醇前藥裝載柚皮素膠束的研究。