何彥曉 ,張東萍 ,吳福鴻 ,蔣晶擱 ,袁玥 ,蒲曉輝?

1寧夏康亞藥業(yè)股份有限公司,寧夏 銀川 750002;2 銀川市第一人民醫(yī)院,寧夏 銀川 750002;3 河南大學藥學院,河南 開封475004

甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)是甘草的主要有效成分甘草酸及其鹽(即甘草甜素)的代謝產(chǎn)物。甘草次酸具有重要的藥理活性,它不僅有消炎美容之功效,而且具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保護肝細胞、抗氧化及腎上腺皮質(zhì)激素樣作用,具有明顯增強肝腎的解毒功能和腦保護作用[1],可治療腎上腺皮質(zhì)機能衰退、胃潰瘍及十二指腸潰瘍等。更重要的是其可以增強機體免疫力,有效地控制艾滋病毒感染者病情的發(fā)展,其衍生物還具有抗腫瘤的活性[2-3]。

丹參酮(tanshinone,TAN)脂溶性成分在生物體內(nèi)廣泛分布,具有較強的藥理活性,而每一種丹參酮有其特定的生理活性[4]。丹參酮具有保護心血管的作用,包括抗動脈粥樣硬化、改善微循環(huán)和提高血流量水平、抗凝和抗血小板聚集、減小心肌梗死面積、保護血管內(nèi)皮細胞。丹參酮具有免疫和調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、保護腦神經(jīng)、護肝、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、增加腎臟的血供、減緩腎臟損害等方面均有重要作用。清除氧自由基、抑制炎癥細胞增殖、殺傷腫瘤細胞及抑制血管平滑肌細胞增殖等作用,丹參酮還可以消除機體氧化反應所形成的毒素,降低患者腎臟的負荷;具有擴張血管、改變微循環(huán)、降低血小板聚集的作用?？筛纳乒钦酆笠鸬难\不通,為骨折愈合創(chuàng)造良好的局部環(huán)境[5]。

甘草和丹參同時使用較為常見。丹參聯(lián)合甘草酸用藥后,抗肝纖維化臨床效果優(yōu)于單用丹參或甘草酸[6]。已有相關文獻[7-14]報道,采用HPLC 法或LC-MS/MS法分別進行甘草次酸和丹參酮的含量測定方法,但采用同一種方法同時測定體內(nèi)甘草次酸和丹參酮的含量卻鮮少報道。

本研究發(fā)現(xiàn),采用HPLC雙波長法可以同時測定體內(nèi)的甘草次酸和丹參酮的含量,該分析方法準確、重復性好、精密度高,為后續(xù)相關甘草次酸和丹參酮復方產(chǎn)品的體內(nèi)質(zhì)量控制和藥代動力學研究提供了方法學基礎。

1 材料

1.1 儀器

米歐Miulab MIX-28+圓周振蕩器(北京乾明基因技術有限公司);JT-1027HT 超聲波清洗器(中國玉環(huán)曙峰企業(yè)制造);TDZ5-BP離心機(上海安亭科學儀器廠);BSA224S分析天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)

1.2 藥品與試劑

色譜甲醇(天津市科密歐化學試劑有限公司,批號:20200106);二甲基亞砜(DMSO)(天津市德恩化學試劑有限公司,批號:20191005);肝素鈉(國藥準字H12020505,天津生物化學制藥有限公司);大黃酸(Re)(南京景竹生物科技有限公司,批號:JZ18041301);0.9%氯化鈉注射液(山東齊都藥業(yè)有限公司,國藥準字H37020766)

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠36只,體重200±20 g,濟南朋悅實驗動物繁育有限公司(實驗動物質(zhì)量合格證號:No.37072610100 113618;實驗動物許可證:SYXK(魯)20 190003;動物飼料生產(chǎn)許可證號:豫飼證(2008)25540;所有動物實驗均經(jīng)過河南大學動物實驗倫理委員會批準同意,許可證號:HUSOM-2017-236)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動相:甲醇-磷酸緩沖液(pH=3)(85∶15);檢測波長:250 nm(GA)、270 nm(TAN);柱溫:30℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:10μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 標準溶液的配制

精密稱取GA 標準品10 mg,TAN 標準品2.5 mg共同置于50 mL 容量瓶中,用少量色譜甲醇使溶解后,定容至刻度線,搖勻,即得對照品貯備液(GA:200μg/ mL、TAN:50μg/ mL),然后將儲備液用甲醇稀釋成系列濃度即 TAN 的濃度為0.390 625、0.781 25、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25 μg/ mL,GA 的濃度為1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ mL的系列標準溶液。

2.2.2 內(nèi)標溶液的配制

精密稱取內(nèi)標物Re 2.5 mg置于100 mL 容量瓶中,用色譜甲醇溶解并稀釋至刻度線,搖勻得到內(nèi)標儲備液濃度為25μg/ mL,然后用吸量管精密移取內(nèi)標儲備液1.25 mL至10 mL容量瓶中,用色譜甲醇溶解并稀釋定容至刻度線,得到濃度為3.125 μg/ mL的內(nèi)標溶液。

2.2.3 體內(nèi)樣品的處理

取大鼠血漿100μL 置于1.5 mL 離心管中,加入100μL內(nèi)標溶液,渦旋混勻。然后加入400μL色譜甲醇后置于振蕩器上渦旋5 min,離心取上清液,棄去底部沉淀的蛋白。按照2.1項下色譜條件進樣分析。

2.2.4 專屬性實驗

取大鼠的空白血漿、空白血漿加標準溶液和靜脈注射后大鼠血漿按照2.2.3項下處理并按照2.1項下色譜條件進樣分析,另取標準品溶液加內(nèi)標溶液按2.1項下色譜條件進樣并記錄色譜圖。

2.2.5 標準曲線的建立

取新鮮的大鼠空白血漿100μL 置于1.5 mL EP管中,分別加入2.2.1項下配置的一系列標準溶液后,按照2.2.3項下處理樣品,使得相應的血漿中的TAN的濃度為0.078 125、0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5μg/ mL,GA 的濃度為0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/ mL,按照2.1 項下的色譜條件進樣,記錄相應的峰面積。以進樣的待測藥物濃度(X)為橫坐標,以待測藥物峰面積AR與內(nèi)標物質(zhì)Re的色譜峰面積AS的比值為縱坐標進行線性回歸,分別得到GA 和TAN 體內(nèi)含量測定的線性回歸方程。

2.2.6 精密度實驗

取大鼠空白血漿100μL 按照2.2.4項下操作,配制高、中、低的混合標準溶液,即最終血漿中TAN的濃度為0.156 25、0.625、2.5μg/ mL,GA 的濃度為0.625、2.5、10μg/ mL,每個樣品平行6份。分別在日內(nèi)及日間對其重復測定,考察精密度,然后記錄所測得的色譜峰面積,并通過2.2.4項下所得的線性方程計算出其日內(nèi)和日間的RSD 值。

2.2.7 提取回收率實驗

取生理鹽水100μL代替大鼠空白血漿,同樣按照2.2.4項下操作,配制高、中、低三種混合標準溶液,每個樣品平行6份。將配置好的溶液注入高效液相色譜儀中記錄色譜峰面積,計算方法的提取回收率。

2.2.8 體內(nèi)樣品的采集

將大鼠隨機分為6組分別是TAN 游離藥組、GA游離藥組、TAN/MD組、GA/MD 組、TAN/GA/MD 組和TAN/GA/DCA 組。給藥劑量為15 mg/kg(參考丹參酮IIA 磺酸鈉注射液和甘草酸二銨注射液)。大鼠靜脈注射完成時開始計時,分別于0.83、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h的時間點眼眶取血約500μL。然后將取得的血液樣品置于經(jīng)肝素鈉浸潤過的離心管中,離心取上清液得到新鮮的大鼠含藥血漿。按照2.2.3項下處理樣品,然后按照2.2.1項下色譜條件進樣分析。

2.3 結果與討論

2.3.1 體內(nèi)樣品含量測定方法的建立與考察

空白血漿、空白血漿加標品以及給藥后的血漿樣品的HPLC 圖見圖1。a、b、c分別為內(nèi)標Re、TAN和GA的色譜峰。

圖1 空白血漿HPLC圖(A);空白血漿+標準品HPLC圖(B);給藥后血漿樣品HPLC(C)

由圖1可知,空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)并不干擾TAN 和GA 的含量測定,且內(nèi)標Re的保留時間為5.532 min與TAN 和GA 分離較好,表明測定方法具有很好的專屬性。

2.3.2 標準曲線

縱坐標為待測峰面積與內(nèi)標峰面積的比值,橫坐標X 代表不同濃度,對濃度X 進行線性回歸。最終能夠得出TAN 的線性回歸方程為:Y=2.237 7X-0.022 2(R2=0.999 6),線性范圍為0.078 125 μg/ mL～5μg/ mL;GA 的線性回歸方程為:Y=0.430 7X-0.002 6(R2=0.999 8),線性范圍為0.312 5μg/ mL～20μg/ mL,見圖2。

圖2 TAN標準曲線(A);GA標準曲線(B)

研究結果表明,樣品的日內(nèi)及日間精密度均小于3.51%,說明方法精密度良好,符合規(guī)定。

2.3.3 精密度考察結果

精密度考察結果見表1。

表1 精密度考察結果(n=6)

研究結果表明,低、中、高三種濃度的提取回收率在95.20～103.43%之間,RSD 值均小于4.93%,符合規(guī)定。

2.3.4 提取回收率考察結果

提取回收率考察結果,見表2。

表2 提取回收率結果(n=6)

研究結果表明,在線性范圍內(nèi)GA 和TAN 的色譜峰面積與濃度具有良好的線性關系。

2.4 討論

本研究通過采用C18色譜柱,以波長250 nm 和270 nm 分別進行甘草次酸和丹參酮的測定。在該色譜試驗條件下,血漿中的甘草次酸和丹參酮均能與其他成分達到基線分離,且呈現(xiàn)良好的線性關系。本方法操作簡單、靈敏度高,能同時準確對大鼠血漿中的甘草次酸和丹參酮的質(zhì)量濃度進行測定,從而可實現(xiàn)體內(nèi)甘草次酸和丹參酮藥代動力學的變化監(jiān)測,此方法適用于相關甘草次酸和丹參酮復方產(chǎn)品的藥動學評價。