杜丹鳳 ,丁艷霞 ,李欽?

河南省杜仲栽培與利用工程實(shí)驗(yàn)室,河南 開封475000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種全身代謝性疾病,以骨量減少,骨微結(jié)構(gòu)破壞,骨骼強(qiáng)度下降和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征[1]。OP是一個(gè)日益嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題[2]。OP在前期并無明顯癥狀,又和慢性炎癥性關(guān)節(jié)病、糖尿病、腎功能衰竭等共同發(fā)病[3],造成人們對(duì)骨質(zhì)疏松癥的忽略而延誤治療的最佳時(shí)機(jī)。因此,預(yù)防和治療OP,改善社會(huì)健康,緩解醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)勢(shì)在必行。目前臨床上治療OP的藥物有降鈣素、雌激素、甲狀旁腺素、鈣制劑、維生素D 等。上述藥物在治療骨質(zhì)疏松方面療效顯著,但它們的副作用也是很明顯的,輕微者會(huì)引起嘔吐,嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致癌癥、冠心病、血栓等疾病幾率的增加。中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松強(qiáng)調(diào)整體觀念,辨證論治及治病求本原則。骨質(zhì)疏松在臨床上的病因病機(jī)很少單一存在,中醫(yī)藥治療時(shí)以補(bǔ)腎填精為主要原則,脾、肝、心、肺與腎相互作用。因此,從中醫(yī)藥中尋找治療骨質(zhì)疏松的有效藥物非常有意義。

杜仲葉(Eucommiae Folium)為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥葉。夏、秋二季枝葉茂盛時(shí)采收,曬干或低溫烘干。具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效[4]。近年來,有關(guān)杜仲抗OP 作用的相關(guān)報(bào)道較多,但其研究對(duì)象主要是杜仲皮醇提物[5],杜仲皮水提物[6],杜仲皮中單體如杜仲總黃酮[7],松脂素二葡萄糖苷,松脂素[8]以及含有杜仲的復(fù)方[9-13]。有關(guān)杜仲葉水提物[14],杜仲葉醇提物[15]的治療作用也有報(bào)道。但迄今為止,有關(guān)杜仲葉醇提物對(duì)OP作用的機(jī)制研究鮮有報(bào)道。本研究以杜仲葉醇提物為原料制備杜仲葉顆粒,以去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠為模型,通過測(cè)定大鼠股骨骨密度,觀察杜仲葉顆粒對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的作用。此外,本研究還評(píng)價(jià)了杜仲葉顆粒對(duì)大鼠血清骨代謝指標(biāo)堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型膠原羧基末端肽(CTX-1)的影響,并通過研究對(duì)wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響,初步探討杜仲葉顆粒對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 主要儀器

DXA 小動(dòng)物雙能X 射線骨密度儀(韓國osteosys);全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司);JB-P5包埋機(jī),武漢俊杰電子有限公司;RM2016 病理切片機(jī),徠卡;熒光定量PCR 儀,美國Bio-rad

1.2 藥品與試劑

杜仲葉顆粒,實(shí)驗(yàn)室自制。雌二醇片/雌二醇地屈孕酮片復(fù)合包裝(批號(hào)360952,美國Abbott)。

大鼠CTX-1 ELISA 試劑盒(E-EL-R0939c),Elabscience,堿性磷酸酶(ALP)試劑盒,南京建成生物工程研究所;EDTA 脫鈣液(0.5M),蘇木素染液、伊紅染液,Servicebio;RNA 提取液,RIPA 裂解液,Servicebio。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3月齡SD 雌性大鼠,體質(zhì)量240 g左右,由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(魯)2019-0003,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(豫)2016-0006,飼養(yǎng)于河南大學(xué)藥學(xué)院清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝水、取食。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、西藥組、杜仲葉顆粒低劑量組、杜仲葉顆粒中劑量組、杜仲葉顆粒高劑量組,每組7只。腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后,進(jìn)行造模,其中,假手術(shù)組在卵巢周圍切除少量脂肪,其余組行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。術(shù)后一周,各組灌胃給予相應(yīng)藥物,其中,杜仲葉顆粒低、中、高劑量組分別為1.30 g/kg、2.60 g/kg、5.20 g/kg,雌二醇組灌胃劑量為0.208 mg/kg,雌二醇組與杜仲葉顆粒低、中、高劑量組將藥物溶于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)中,模型組與假手術(shù)組均灌胃0.5% CMC-Na。每日一次,連續(xù)12周。

2.2 骨密度檢測(cè)

取各組大鼠右側(cè)股骨,將其周圍組織和肌肉剔除干凈后,整齊擺放在雙能X 射線骨密度儀的吸收測(cè)量臺(tái)上。采用計(jì)算機(jī)在小動(dòng)物梯級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分析軟件模式下,自動(dòng)記錄股骨整體的骨密度,并求平均值。

2.3 HE染色

取各組大鼠左股骨,分離附著肌肉組織,置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h,放入EDTA 脫鈣液(0.5M)中脫鈣,連續(xù)1 mon。脫鈣完成后,脫水,石蠟包埋,切片,切片后進(jìn)行H&E 染色,脫水、透明、封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)。

2.4 骨代謝指標(biāo)的測(cè)定

給藥12 周后,腹主動(dòng)脈取血,靜置后離心(3 500 r/min,15 min),收集上層血清,-80 ℃保存?zhèn)溆?。按相?yīng)試劑盒說明書,測(cè)定血清中ALP,CTX-1的含量。

2.5 qPCR

取大鼠股骨,加入液氮研磨勻漿,按Trizol試劑盒提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)骨組織wnt3a、βcatenin、DKK1 m RNA表達(dá)量。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計(jì)算各檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。見表1。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過SPSS20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以(x-±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為具有顯著性差異,P＜0.01為具有極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)OVX大鼠骨密度的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠股骨骨密度顯著降低,提示造模成功;灌胃12周后,杜仲葉顆粒組、西藥組均能顯著升高大鼠骨密度。見表2。

3.2 對(duì)OVX大鼠股骨骨組織形態(tài)的影響

HE染色如圖1,光學(xué)顯微鏡(×200)下觀察發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組比較,模型組大鼠股骨骨小梁變細(xì),部分出現(xiàn)斷裂,骨髓腔增大,出現(xiàn)大量空泡;與模型組比較,杜仲葉顆粒組與西藥組對(duì)骨小梁形態(tài)、數(shù)量與連接情況均有改善,且骨髓腔減小,空泡數(shù)量減少。見圖1。

圖1 杜仲葉顆粒對(duì)OVX大鼠股骨組織形態(tài)的影響

3.3 對(duì)OVX大鼠血清骨代謝指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清中ALP,CTX-1含量顯著增高;給藥12 周后,與模型組比較,杜仲葉顆粒組能顯著降低ALP、CTX-1含量,雌二醇組能顯著降低ALP 含量,對(duì)CTX-1含量有降低趨勢(shì),不具有顯著性差異。見表3。

表3 杜仲葉顆粒對(duì)OVX大鼠血清骨代謝指標(biāo)的影響

3.4 對(duì)OVX大鼠股骨wnt3a、β-catenin、DKK1 mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠脛骨Wnt3a、β-catenin的m RNA表達(dá)顯著降低,DKK1 的m RNA 表達(dá)顯著升高,與模型組比較,杜仲葉顆粒組、雌二醇組均能顯著升高Wnt3a、β-catenin的m RNA水平,顯著降低DKK1的m RNA 表達(dá)水平。見圖2。

圖2 杜仲葉顆粒對(duì)去卵巢大鼠wnt3a、β-catenin、DKK1 mRNA表達(dá)量的影響

4 討論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是以全身性骨量的丟失、骨微觀結(jié)構(gòu)的退行性改變?yōu)樘卣鞯墓趋兰膊?根本原因在于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)。ALP是指堿性條件下水解多種磷酸酯并具有轉(zhuǎn)磷酸基作用的一組糖蛋白酶,由成骨細(xì)胞分泌,ALP 增高預(yù)示著骨代謝疾病,如骨質(zhì)疏松癥[16]。CTX-1作為良好的骨吸收標(biāo)志物,能夠預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松,前景優(yōu)良[17]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),杜仲葉提取物能夠顯著降低ALP、CTX-1水平,說明其可能是通過作用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞發(fā)揮抗OP作用。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是Wnt信號(hào)通路中的經(jīng)典通路,既能調(diào)控成骨細(xì)胞促進(jìn)骨形成,又能抑制破骨細(xì)胞分化,從而維持骨穩(wěn)態(tài)[18]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活依賴于wnt蛋白與胞膜上的卷曲蛋白受體(FRZ)及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)5/6結(jié)合,抑制糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的表達(dá),穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin,使β-catenin在胞漿中聚積并進(jìn)入細(xì)胞核,啟動(dòng)下游轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),從而促進(jìn)骨形成[19]。

DKK1是wnt蛋白抑制劑之一,來源于骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞,與wnt蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合LRP5/6,負(fù)向調(diào)控wnt/β-catenin信號(hào)通路,抑制骨形成,使骨代謝發(fā)生異常[20]。本實(shí)驗(yàn)采用定量PCR 法測(cè)定Wnt3a、β-catenin和DKK1的mRNA 表達(dá),進(jìn)一步研究杜仲葉提取物抗OP 的作用機(jī)制。結(jié)果表明,杜仲葉提取物能夠增加Wnt3a、β-catenin的mRNA表達(dá),降低DKK1的m RNA 表達(dá)。進(jìn)一步說明,杜仲葉的抗OP 作用是通過激活wnt/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

骨密度測(cè)量(DXA)是一種用于評(píng)估骨骼強(qiáng)度的臨床工具,被公認(rèn)為診斷骨質(zhì)疏松的金標(biāo)準(zhǔn)。DXA 在評(píng)估骨折風(fēng)險(xiǎn)方面為臨床醫(yī)生提供了很好的服務(wù),并且在診斷老年絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥方面尤其有用[21-22]。本實(shí)驗(yàn)采用DXA 對(duì)大鼠股骨骨密度進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,杜仲葉提取物能夠增加去卵巢大鼠的骨密度,提高骨質(zhì)量。

綜上所述,杜仲葉提取物對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松具有一定的治療作用,不僅能增加股骨骨密度,減少骨折風(fēng)險(xiǎn),而且其機(jī)制可能與正向調(diào)控wnt/βcatenin信號(hào)通路,促進(jìn)骨形成有關(guān)。