王翠，楊暢，金玉，高蜜，張雯，王瓊，金海濤△

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是造成老年癡呆的常見原因，發(fā)病率隨人口老齡化的加劇逐年增加，85 歲以上老人發(fā)病率高達(dá)10%［1］。研究顯示，β 淀粉樣蛋白（Aβ）可造成神經(jīng)細(xì)胞凋亡及過度炎癥反應(yīng)，是誘發(fā)AD 的主要因素［2］。因此，抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)對治療AD尤為重要。木犀草苷是一種在植物中廣泛存在黃酮類化合物。木犀草苷可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）氧化損傷［3］，還可減少缺氧缺糖誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［4］，具有治療腦血管疾病的潛在價值。但木犀草苷能否影響AD 發(fā)生發(fā)展還未知。有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3，MEKK3）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)控細(xì)胞生長、凋亡、炎癥反應(yīng)等生命活動。研究顯示，MEKK3在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶誘導(dǎo)的帕金森病模型細(xì)胞中表達(dá)增加，敲減MEKK3可通過阻礙核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa B，NFκB）信號通路的激活，抑制帕金森病模型細(xì)胞促炎細(xì)胞因子表達(dá)，減輕細(xì)胞損傷［5］。AD與帕金森病均屬于神經(jīng)退行性疾病，因此，推測MEKK3 可能也參與AD的發(fā)展進(jìn)程。本研究利用Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建立AD模型，主要觀察木犀草苷對AD模型細(xì)胞凋亡、炎性因子表達(dá)的影響，并以MEKK3為切入點(diǎn)，探究木犀草苷影響AD模型細(xì)胞凋亡、炎性因子表達(dá)的機(jī)制，為其用于治療AD提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器

PC12細(xì)胞（上海弘順生物科技有限公司）；木犀草苷（規(guī)格50 mg，上海邦景實業(yè)有限公司）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司）；Aβ25-35（美國Sigma 公司）；DMEM培養(yǎng)液、LipofectamineTM2000 試劑盒、細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡試劑盒、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；MEKK3小分子干擾RNA（si-MEKK3）及其陰性對照（si-NC）、MEKK3 過表達(dá)載體質(zhì)粒（pcDNA-MEKK3）及其陰性對照（pcDNA）購自廣州銳博生物科技有限公司；兔源一抗［MEKK3、甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）］、山羊抗兔二抗（英國Abcam公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNFα）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。HERAcell 240i CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；iMark680 多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）；FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（美國Becton-Dickinson公司）；BX61光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇PC12細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，于CO2培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組

實驗一：PC12 細(xì)胞分為對照組，模型組及模型+木犀草苷低、中、高劑量組。模型+木犀草苷低、中、高劑量組先分別用含6.25、12.5、25 mg/L［4］木犀草苷的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h，再用含25μmol/L［6］Aβ25-35的培養(yǎng)液孵育24 h；模型組先用不含木犀草苷的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h，再用含25μmol/L Aβ25-35的培養(yǎng)液孵育24 h；對照組用不含木犀草苷及Aβ25-35的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48 h。實驗二：將PC12 細(xì)胞接種至6 孔板中（1.0×105個/孔），培養(yǎng)24 h 后，利用LipofectamineTM2000 試劑盒分別轉(zhuǎn)染si-MEKK3、si-NC、pcDNA-MEKK3、pcDNA。轉(zhuǎn)染12 h，Western blot 檢測MEKK3 蛋白表達(dá)驗證轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染后的PC12 細(xì)胞接種至培養(yǎng)板中，先用不含木犀草苷的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h，再用含25μmol/L Aβ25-35的培養(yǎng)液孵育24 h，分別記為模型+si-MEKK3 組、模型+si-NC 組、模型+pcDNA-MEKK3 組、模型+pcDNA-NC 組。實驗三：將轉(zhuǎn)染pcDNA-MEKK3、pcDNA 的PC12 細(xì)胞先用含25 mg/L 木犀草苷的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h，再用含25 μmol/L Aβ25-35的培養(yǎng)液孵育24 h，分別記為模型+木犀草苷+pcDNA-MEKK3 組、模型+木犀草苷+pcDNA組。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率

接種PC12 細(xì)胞至96 孔板中（2.5×104個/孔），培養(yǎng)12 h后，按照上述1.2.2分組干預(yù)。干預(yù)后，加CCK-8（10μL/孔），孵育2 h。將96孔板置于酶標(biāo)儀卡槽，設(shè)置波長為450 nm，測定各孔光密度（OD）值。增殖抑制率（%）=（1-OD實驗組/OD對照組）/OD對照組×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

接種PC12細(xì)胞至6孔板中（1.0×105個/孔），培養(yǎng)12 h后，按照上述1.2.2分組干預(yù)。干預(yù)后，收集各組細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2 次，300×g離心5 min，棄上清液。加Binding Buffer 重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106個/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加Annexin V-FITC（5μL/管），室溫避光孵育10 min。再加5μL PI，室溫避光孵育5 min。加500μL Binding Buffer，混合均勻，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β水平

接種PC12細(xì)胞至6孔板中（1.0×105個/孔），培養(yǎng)12 h后，按照上述1.2.2 分組干預(yù)。干預(yù)后，收集各組細(xì)胞，500×g離心5 min。取上清液，采用ELISA 試劑盒檢測TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.2.6 Western blot檢測MEKK3蛋白表達(dá)

接種PC12細(xì)胞至6孔板中（1.0×105個/孔），培養(yǎng)12 h后，按照上述1.2.2 分組干預(yù)。干預(yù)后，收集各組細(xì)胞，加PBS 清洗2次，300×g離心5 min，棄上清液。用RIPA 試劑提取總蛋白并測定（BCA法）蛋白濃度。行SDS-PAGE分離總蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h。于4 ℃冰箱中分別用MEKK3（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）一抗孵育12 h，再于室溫下用山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育2 h。滴加顯影液，避光顯影，曝光拍照，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以MEKK3 與GAPDH 灰度值的比值表示MEKK3 蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗；2 組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 木犀草苷對AD模型細(xì)胞增殖與凋亡的影響

與對照組比較，模型組PC12 細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，模型+木犀草苷低、中、高劑量組PC12細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率依次降低（P＜0.05），見圖1，表1。

Tab.1 Effects of cynaroside on proliferation inhibition rate and apoptosis rate of AD model cells表1 木犀草苷對AD模型細(xì)胞增殖抑制率與凋亡率的影響（n=9，%，±s）

Tab.1 Effects of cynaroside on proliferation inhibition rate and apoptosis rate of AD model cells表1 木犀草苷對AD模型細(xì)胞增殖抑制率與凋亡率的影響（n=9，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比，b與模型組比，c與模型+木犀草苷低劑量組比，d與模型+木犀草苷中劑量組比，P＜0.05。

組別對照組模型組模型+木犀草苷低劑量組模型+木犀草苷中劑量組模型+木犀草苷高劑量組F增殖抑制率0.02±0.01 44.15±1.84a 32.36±1.84b 24.06±1.28bc 12.45±0.71bcd 1 482.537＊＊凋亡率6.35±0.16 23.83±0.88a 20.37±0.89b 16.29±1.12bc 11.93±0.56bcd 675.957＊＊

Fig.1 Effect of cynaroside on apoptosis of AD model cells detected by flow cytometry圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測木犀草苷對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響

2.2 木犀草苷對AD模型細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，模型+木犀草苷低、中、高劑量組TNF-α、IL-6、IL-1β 水平依次降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Effects of cynaroside on the expression of inflammatory cytokines and MEKK3 protein in AD model cells表2 木犀草苷對AD模型細(xì)胞炎性因子表達(dá)和MEKK3蛋白表達(dá)水平的影響（n=9，±s）

Tab.2 Effects of cynaroside on the expression of inflammatory cytokines and MEKK3 protein in AD model cells表2 木犀草苷對AD模型細(xì)胞炎性因子表達(dá)和MEKK3蛋白表達(dá)水平的影響（n=9，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比，b與模型組比，c與模型+木犀草苷低劑量組比，d與模型+木犀草苷中劑量組比，P＜0.05。

組別對照組模型組模型+木犀草苷低劑量組模型+木犀草苷中劑量組模型+木犀草苷高劑量組F TNF-α/（ng/L）100.06±5.79 400.08±14.63a 332.88±20.38b 244.86±12.78bc 148.91±11.88bcd 721.179＊＊IL-6/（ng/L）64.78±4.99 442.40±32.12a 303.79±15.73b 222.45±14.55bc 126.42±9.40bcd 621.541＊＊組別對照組模型組模型+木犀草苷低劑量組模型+木犀草苷中劑量組模型+木犀草苷高劑量組F IL-1β/（ng/L）93.60±5.55 275.42±20.46a 235.50±13.86b 176.98±12.97bc 125.28±8.96bcd 286.230＊＊MEKK3 0.15±0.02 0.67±0.04a 0.51±0.03b 0.39±0.04bc 0.22±0.02bcd 411.612＊＊

2.3 木犀草苷對AD 模型細(xì)胞中MEKK3 蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組MEKK3 蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，模型+木犀草苷低、中、高劑量組MEKK3 蛋白水平依次降低（P＜0.05），見圖2，表2。

Fig.2 Western blot detection of the effect of cynaroside on the expression of MEKK3 protein in AD model cells圖2 Western blot檢測木犀草苷對AD模型細(xì)胞中MEKK3蛋白表達(dá)的影響

2.4 MEKK3轉(zhuǎn)染效果驗證

與si-NC 組比較，si-MEKK3 組MEKK3 蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（0.15±0.01vs.0.05±0.01，t=21.213，P＜0.05）；與pcDNA 組比較，pcDNAMEKK3 組MEKK3 蛋白表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（0.15±0.01vs.0.49±0.04，t=24.739，P＜0.05），見圖3。

Fig.3 Western blot detection of the effect of transfection on MEKK3 protein expression圖3 Western blot檢測轉(zhuǎn)染對MEKK3蛋白表達(dá)的影響

2.5 敲減MEKK3 對AD 模型細(xì)胞損傷及炎性因子表達(dá)的影響

與模型+si-NC組比較，模型+si-MEKK3組PC12細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、炎性因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）水平降低（P＜0.01），見圖4，表3。

Tab.3 Effects of knockdown of MEKK3 on proliferation inhibition rate,apoptosis rate and expression of inflammatory factors in AD model cells表3 敲減MEKK3對AD模型細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及炎性因子表達(dá)的影響（n=9，±s）

Tab.3 Effects of knockdown of MEKK3 on proliferation inhibition rate,apoptosis rate and expression of inflammatory factors in AD model cells表3 敲減MEKK3對AD模型細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及炎性因子表達(dá)的影響（n=9，±s）

＊＊P＜0.01。表4、5同

組別模型+si-NC組模型+si-MEKK3組t增殖抑制率/%44.19±1.96 14.56±0.83 41.762＊＊凋亡率/%23.65±1.58 13.35±0.97 16.667＊＊TNF-α/（ng/L）399.83±23.91 198.54±19.89 19.416＊＊IL-6/（ng/L）448.76±20.57 144.50±22.08 30.248＊＊IL-1β/（ng/L）272.70±35.62 133.54±10.81 11.215＊＊

Fig.4 The effect of knockout MEKK3 on apoptosis of AD model cells detected by flow cytometry圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測敲減MEKK3對AD模型細(xì)胞凋亡的影響

2.6 過表達(dá)MEKK3 對AD 模型細(xì)胞損傷及炎性因子表達(dá)的影響

與模型+pcDNA 組比較，模型+pcDNA-MEKK3組PC12 細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、炎性因子（TNFα、IL-6、IL-1β）水平升高（P＜0.01），見圖5，表4。

Tab.4 Effects of overexpression of MEKK3 on proliferation inhibition rate,apoptosis rate and expression of inflammatory factors in AD model cells表4 過表達(dá)MEKK3對AD模型細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及炎性因子表達(dá)的影響（n=9，±s）

Tab.4 Effects of overexpression of MEKK3 on proliferation inhibition rate,apoptosis rate and expression of inflammatory factors in AD model cells表4 過表達(dá)MEKK3對AD模型細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及炎性因子表達(dá)的影響（n=9，±s）

組別模型+pcDNA組模型+pcDNA-MEKK3組t增殖抑制率/%42.35±2.05 60.18±3.72 12.593＊＊凋亡率/%21.74±1.50 36.28±2.15 16.639＊＊TNF-α/（ng/L）387.96±25.39 562.30±40.15 11.010＊＊IL-6/（ng/L）439.55±31.42 641.07±45.19 10.984＊＊IL-1β/（ng/L）280.14±22.90 435.80±30.57 12.226＊＊

Fig.5 Effects of overexpression of MEKK3 on apoptosis of AD model cells detected by flow cytometry圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)MEKK3對AD模型細(xì)胞凋亡的影響

2.7 上調(diào)MEKK3 恢復(fù)木犀草苷對AD 模型細(xì)胞損傷及炎性因子表達(dá)的影響

與模型+木犀草苷+pcDNA 組比較，模型+木犀草苷+pcDNA-MEKK3 組PC12 細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、炎性因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）水平升高（P＜0.05），見圖6，表5。

Tab.5 Effects of up-regulation of MEKK3 to restore on inhibition rate of proliferation,apoptosis rate and expression of inflammatory factors in AD model cells表5 上調(diào)MEKK3恢復(fù)木犀草苷對AD模型細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及炎性因子表達(dá)的影響 （n=9，±s）

Tab.5 Effects of up-regulation of MEKK3 to restore on inhibition rate of proliferation,apoptosis rate and expression of inflammatory factors in AD model cells表5 上調(diào)MEKK3恢復(fù)木犀草苷對AD模型細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及炎性因子表達(dá)的影響 （n=9，±s）

組別模型+木犀草苷+pcDNA組模型+木犀草苷+pcDNA-MEKK3組t增殖抑制率/%12.48±0.78 33.27±1.87 30.782＊＊凋亡率/%11.67±0.62 21.07±0.83 27.220＊＊TNF-α/（ng/L）142.99±17.36 348.56±19.04 23.935＊＊IL-6/（ng/L）126.56±9.61 347.98±20.81 28.979＊＊IL-1β/（ng/L）133.38±15.76 238.75±17.50 13.423＊＊

Fig.6 Effects of up-regulation of MEKK3 on cell apoptosis in AD model cells mediated by cynaroside detected by flow cytometry圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測上調(diào)MEKK3對木犀草苷介導(dǎo)的AD模型細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

AD 以漸進(jìn)性記憶障礙、人格改變、智力減退等認(rèn)知功能障礙為主要特征，其危害僅次于腫瘤、心血管疾病、腦卒中。目前，AD發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其中Aβ在AD 患者大腦中沉積，可影響神經(jīng)細(xì)胞骨架完整性，且通過干擾線粒體功能發(fā)揮細(xì)胞毒性致細(xì)胞損傷［7］。PC12細(xì)胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤分化細(xì)胞株，具有神經(jīng)細(xì)胞特性，因此常用Aβ 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞建立AD 模型［8］。本研究結(jié)果顯示，PC12 細(xì)胞經(jīng)Aβ25-35誘導(dǎo)后，細(xì)胞增殖活性降低，凋亡增加，PC12細(xì)胞發(fā)生損傷，模型建立成功。

目前AD 缺乏有效的治療藥物，針對AD 發(fā)病機(jī)制不同靶點(diǎn)的藥物開發(fā)尚處于試驗階段。天然植物活性成分因毒性低、作用靶點(diǎn)多、療效強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)成為AD治療藥物的重點(diǎn)研究對象。木犀草苷具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等功效［9-10］。研究顯示，木犀草苷可抑制脂多糖誘導(dǎo)的HUVECs 分泌炎性因子和黏附因子，減輕HUVECs損傷［11］。本研究結(jié)果顯示，木犀草苷可提高Aβ25-35誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞增殖活性，并減少細(xì)胞凋亡，提示木犀草苷可減輕Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，具有治療AD的潛在價值。炎癥是AD發(fā)病機(jī)制之一，Aβ大量堆積可誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生過度炎癥反應(yīng)，分泌大量炎性因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β，這些炎性因子進(jìn)一步損傷神經(jīng)細(xì)胞，加快AD發(fā)展進(jìn)程［12］。在本實驗中，木犀草苷可抑制Aβ25-35誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 和IL-1β，提示木犀草苷可減輕Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞炎性損傷，這也可能是其減輕Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。

MEKK3 屬于絲裂原活化蛋白3 激酶家族成員，可通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶、NF-κB、p38 等多種信號通路調(diào)控細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)過程。研究顯示，MEKK3 的異常表達(dá)與人類腫瘤、心腦血管疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［13-14］。據(jù)報道，在糖尿病小鼠中，MEKK3 可通過誘導(dǎo)p38 MAPK/NFκB通路的激活，加重2型糖尿病的認(rèn)知缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病腦?。?5］；此外，創(chuàng)傷性腦損傷小鼠皮質(zhì)和海馬中MEKK3 表達(dá)增加，下調(diào)MEKK3 可減輕氧糖剝奪/再灌注誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)炎癥［16］。在本研究中，Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中MEKK3 蛋白表達(dá)增加，敲減MEKK3 可抑制Aβ25-35誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡、炎性因子表達(dá)，而過表達(dá)MEKK3 表現(xiàn)出相反作用，提示MEKK3 也具有作為AD 治療分子靶點(diǎn)的潛力。同時，本研究結(jié)果顯示，木犀草苷可抑制Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中MEKK3蛋白表達(dá)，而上調(diào)MEKK3可減弱木犀草苷對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞增殖活性、凋亡、炎性因子表達(dá)的影響，這提示木犀草苷可能通過下調(diào)MEKK3 表達(dá)，抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷。

綜上，木犀草苷可抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡和炎性因子表達(dá)，有可能成為治療AD 的藥物，其作用機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中MEKK3 表達(dá)有關(guān)。但本研究僅通過體外細(xì)胞實驗進(jìn)行了探究，尚需進(jìn)一步在體內(nèi)觀察木犀草苷治療AD 的療效性和安全性。