谷 威，王高烽，孔丹丹，駱驕陽，李錦萍，馬永貴，楊美華

（1.青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海 西寧 810008；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193）

檳榔（Arecae semen） 為多年生常綠棕櫚科植物檳榔（Areca catechu L.） 的干燥成熟種子，為我國著名的四大南藥（檳榔，益智，砂仁，巴戟天） 之一，具有較大的藥食兩用價值[1]。檳榔在《中華人民共和國藥典》 1953 年版中就有收載記錄，且在2015年版《中華人民共和國藥典》一部收載的檳榔相關(guān)飲片及成方制劑多達60 余種[2]。檳榔具有驅(qū)蟲、利水行氣、消積等功效，在臨床中多用于治療蛔蟲、絳蟲病，腹脹痛，瘧疾等疾病[3]，有文獻表明，其主要功效成分即為檳榔中的多種生物堿，主要包括檳榔堿、檳榔次堿、去甲基檳榔堿和去甲基檳榔次堿等。同時，上述生物堿也具有一定的毒副作用[4-5]。通常，檳榔飲片的加工需將鮮果檳榔經(jīng)過前處理加工制得，其過程主要包含浸泡、晾曬、煮洗、脫油和倉儲的5 個關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6-8]，其中生物堿含量也隨之動態(tài)變化[9]。

截至目前，國內(nèi)外研究多集中于食品檳榔中的生物堿含量分布特點，藥用檳榔飲片的藥效活性，及生物堿致癌性風(fēng)險的安全性評價等領(lǐng)域[10-13]，尚未系統(tǒng)分析鮮果檳榔在前處理加工過程中4 種生物堿含量變化的規(guī)律研究，而檳榔中生物堿含量直接影響其質(zhì)量及安全性等級。通過分析藥用檳榔飲片生產(chǎn)加工過程中的4 種生物堿含量變化，了解初加工過程干擾水平，以期為檳榔飲片的藥效價值及安全性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

檳榔鮮果，采自我國云南及海南省，共16 批次。

1.2 儀器與試劑

LC-20AT 型高效液相色譜儀，日本島津公司產(chǎn)品；THZ-D 型恒溫振蕩器，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SB-5200D 型KQ-500 超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；AB135-S 型電子分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司產(chǎn)品。

氫溴酸檳榔堿對照品CHB-Q-036、去甲檳榔堿對照品CHB-Q-043、檳榔次堿對照品CHB-B-088、去甲檳榔次堿鹽酸鹽對照品CHB-Q-042，成都克洛瑪生物科技有限公司提供，甲醇為色譜純，美國Fisher 公司提供；分析純的甲醇、三氯甲烷和氨水，北京化工廠提供；水，娃哈哈飲用純凈水提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 對照品及供試品溶液

分別精密稱定檳榔次堿、去甲檳榔次堿、檳榔堿和去甲檳榔堿對照品適量，使用50%甲醇溶解制備得到對應(yīng)單標(biāo)儲備液。移取各儲備液適量，甲醇稀釋單標(biāo)儲備液，分別得到檳榔次堿、去甲檳榔次堿、檳榔堿和去甲檳榔堿的質(zhì)量濃度為121.220，114.650，754.300，184.709 μg/mL 的混合對照品溶液。稱取0.5 g 檳榔粉末至100 mL 錐形瓶中，加入1 mL 氨水浸潤30 min，加入三氯甲烷- 甲醇（4∶1） 40 mL混勻，超聲30 min 過濾，取20 mL 續(xù)濾液低溫揮干，加10 mL 甲醇溶解殘渣，過0.22 μm 有機濾膜備用。

1.3.2 色譜條件

檳榔中生物堿的HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 檳榔中生物堿的HPLC 色譜圖

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Origin 8.0 對處理數(shù)據(jù)并作圖，使用SPSS 28.0 完成聚類分析與主成分分析統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考查

2.1.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限

取混合對照品溶液適量，50%甲醇進行梯度稀釋。分別精密吸取上述混合對照品溶液，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準曲線。將混合對照品溶液用甲醇-水溶液逐級稀釋，分別進樣測定，至信噪比S/N=10 時定為定量限，信噪比S/N=3時定為檢測限。

生物堿分析的線性關(guān)系、定量限和檢測限見表1。

表1 生物堿分析的線性關(guān)系、定量限和檢測限

2.1.2 精密度

取一定濃度混合對照品溶液，連續(xù)進樣6 次考查日內(nèi)精密度，檳榔次堿、去甲檳榔次堿鹽酸鹽、氫溴酸檳榔堿及去甲檳榔堿峰面積RSD 分別為0.409%，0.640%，0.150%，0.270%。取一定濃度混合對照品溶液，連續(xù)進樣6 d 考查日間精密度，檳榔次堿、去甲檳榔次堿鹽酸鹽、氫溴酸檳榔堿以及去甲檳榔堿峰面積RSD 分別為3.386%，3.260%，0.470%，0.500%。因此，日內(nèi)、日間精密度RSD 均低于5.000%，說明儀器測試結(jié)果符合測試要求。

2.1.3 重復(fù)性和穩(wěn)定性

平行制備6 份供試品溶液，考查重復(fù)性。結(jié)果顯示，檳榔次堿、去甲檳榔次堿鹽酸鹽、氫溴酸檳榔堿以及去甲檳榔堿峰面積RSD 分別為2.686%，4.930%，1.995%，4.400%，表明方法重復(fù)性良好。取同1 份供試品溶液分別在0，2，4，12，16，24 h分別進樣，考查日內(nèi)穩(wěn)定性，檳榔次堿、去甲檳榔次堿鹽酸鹽、氫溴酸檳榔堿以及去甲檳榔堿峰面積RSD 分別為3.434%，4.835%，2.560%，4.592%。表明24 h 內(nèi)穩(wěn)定性滿足測試要求。

2.1.4 回收率

取檳榔飲片粉末9 份，每份約0.25 g，精密加入3 個水平（80%、100%和120%） 的混合對照品溶液，每個水平制樣3 份，進樣測試加標(biāo)回收率。生物堿回收率范圍均在86.900%~118.191%，RSD（%）均小于3.000%，表明該法回收率良好。

檳榔飲片中4 種生物堿的回收率（μg/mL，n=3）見表2。

表2 檳榔飲片中4 種生物堿的回收率（μg/mL，n=3）

2.2 前處理加工工藝過程中生物堿含量變化規(guī)律

為避免檳榔鮮果污染及腐壞，一般選擇在檳榔產(chǎn)地進行剝皮、煮洗、清潔及干燥過程。經(jīng)在廣西等地實地探訪產(chǎn)地初加工過程后，綜合當(dāng)?shù)販囟取穸鹊葪l件，選擇煮洗溫度40 ℃，干燥溫度45 ℃及Na2CO3濃度為基礎(chǔ)條件，分別浸泡煮洗檳榔鮮果30，50，70，90 min，煮洗后晾曬干燥30，40，50，60 min，清洗檳榔表面油脂的Na2CO3濃度為0，0.25，0.30，0.35，0.40 mol/L。

檳榔樣本前處理工藝中生物堿質(zhì)量濃度測定結(jié)果（μg/mL） （n=3） 見表3。

表3 檳榔樣本前處理工藝中生物堿質(zhì)量濃度測定結(jié)果（μg/mL） （n=3）

由表3 可知，①檳榔中生物堿質(zhì)量濃度順序為檳榔堿>去甲基檳榔堿>去甲基檳榔次堿>檳榔次堿；②未經(jīng)處理的檳榔果的生物堿中檳榔堿含量最高，且在40 ℃下煮洗90 min，烘干30 min，并使用0.35 mol/L Na2CO3溶液清洗時檳榔堿的含量最高，去甲基檳榔堿趨勢一致；③干燥過程導(dǎo)致檳榔堿的損失最嚴重，在45 ℃下干燥60 min，煮洗50 min，并使用0.25 mol/L Na2CO3溶液清洗時檳榔堿的含量相對較低；④其次為煮洗工序，在40 ℃下煮洗50 min，烘干60 min，并使用0.25 mol/L Na2CO3溶液清洗時檳榔堿的含量均最低（見圖2）。由于檳榔生物堿是水溶性物質(zhì)，浸泡煮洗檳榔鮮果，導(dǎo)致生物堿溶于水中造成損失，以煮洗30 min 為參照，煮洗過程中檳榔堿最高損失達到4.39%，而干燥過程加速了檳榔堿的揮發(fā)損失，以干燥時間（45 ℃） 30 min 為參照，檳榔堿損失率達到72.5%。但檳榔堿在Na2CO3溶液中溶解度降低，進而減小了檳榔堿的損失，顯示出檳榔堿質(zhì)量濃度的峰值1 803.288±118.966 μg/mL；⑤檳榔次堿、去甲基檳榔堿及去甲基檳榔次堿在各工藝下的變化趨勢與檳榔堿幾乎一致。

圖2 檳榔前處理工藝中4 種生物堿質(zhì)量濃度變化規(guī)律

檳榔前處理工藝中4 種生物堿質(zhì)量濃度變化規(guī)律見圖2。

2.3 多元統(tǒng)計分析

2.3.1 聚類分析

在SPSS 28.0 軟件中將16 批檳榔樣品的4 種質(zhì)量濃度測定結(jié)果進行標(biāo)準化運算，以標(biāo)準化得分為變量進行系統(tǒng)聚類分析，選用組間聯(lián)接，度量標(biāo)準選用“平方歐式距離”得到樹狀圖。圖2 中“0~25”的標(biāo)度是將各類檢測對象的不同評價指標(biāo)按統(tǒng)一尺度映射后的結(jié)果。

檳榔不同前處理工藝聚類分析樹狀圖見圖3。

圖3 檳榔不同前處理工藝聚類分析樹狀圖

由圖3 可知，當(dāng)標(biāo)度為10 時，將12 個前處理工藝所得樣本聚為3 類：煮洗時間30，50，70 min歸為第一類，檳榔堿與總生物堿含量均較低，可見前處理工藝中的煮洗時間對檳榔生物堿含量的損失影響較高；Na2CO3濃度0，0.35 mol/L，煮洗90 min聚為第二類，樣品中所含檳榔堿質(zhì)量濃度較高，檳榔次堿、去甲檳榔次堿、去甲檳榔堿含量相似且遠低于檳榔堿。第三類為干燥時間30，40，50 min 和Na2CO3濃度0.25，0.30 mol/L 處理樣本，其中檳榔堿含量高，數(shù)值接近，且為主要生物堿成分；干燥時間各參數(shù)下樣本分別分布在兩類中，且對生物堿損失影響較低。綜上所述，前處理加工工藝中煮洗時間對檳榔中生物堿質(zhì)量濃度的影響程度高于干燥時間及Na2CO3清洗溶液濃度。

2.3.2 主成分分析

對16 批檳榔樣品進行主成分分析（PCA），提取出3 個主成分，貢獻率分別為75.4%，21.7%和2.9%，主成分累計貢獻率達到97.1%，因此這2 個成分已足夠?qū)η疤幚砉に囍猩飰A質(zhì)量濃度進行評價。主成分1 以Na2CO3濃度影響為主，干燥時間影響為輔；主成分2 以干燥時間影響為主、煮洗時間為輔。提取3 個成分做得分圖，可見分類結(jié)果與聚類分析的分類結(jié)果一致，說明各前處理加工過程中4 種生物堿和質(zhì)量濃度變化明顯，且檳榔的煮洗和干燥過程對檳榔堿質(zhì)量濃度變化具有較大影響。

主成分得分圖見圖4。

圖4 主成分得分圖

3 結(jié)論

檳榔食用和藥用的歷史悠久，其中4 類生物堿含量分布直接影響其藥效活性。鮮果經(jīng)過煮洗、去油、干燥等主要前處理加工工藝后得到要用檳榔產(chǎn)品。選取鮮果檳榔為研究對象，基于HPLC 技術(shù)建立了鮮果檳榔及初加工后檳榔樣本中4 類生物堿的分析方法，考查了檳榔前處理加工工藝下4 種生物堿的含量變化規(guī)律。結(jié)果表明，4 種生物堿中檳榔堿為主要成分，含量普遍較高，可高達1 803.288±118.966 mg/kg，其余成分含量分布為檳榔堿> 去甲基檳榔堿> 去甲基檳榔次堿> 檳榔次堿；經(jīng)處理加工后的生物堿存在一定損失，其中煮洗工藝影響程度> 干燥工藝> Na2CO3溶液清洗工藝。但在40 ℃下煮洗90 min，烘干30 min，并使用0.35 mol/L Na2CO3溶液清洗時檳榔堿的損失量最??；而在45 ℃下干燥60 min，煮洗50 min，并使用0.25 mol/L Na2CO3溶液清洗時檳榔堿的損失最高可達72.5%。根據(jù)4 種生物堿含量的變化規(guī)律，經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)前處理工藝主要分為2 類：煮洗工藝和其他工藝。

研究了檳榔從鮮果到成品加工過程中4 種生物堿的含量變化特征，并找出對各成分有顯著影響的加工工序，為藥用檳榔飲片的成分研究及藥效品質(zhì)評價提供科學(xué)依據(jù)。