曹運成，魯 平，李宜諾，代孟麗，鄭云嬌，馮 凡

（宿州學院生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000）

發(fā)酵工藝是現(xiàn)代生物工程中的一項以舊改新的技術(shù)。利用不同微生物之間的互相影響，應用多種微生物之間的高效發(fā)酵功能，為社會提供更多高質(zhì)量食品或?qū)⑽⑸镏苯討糜诠まr(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[1]。迄今為止，人類對發(fā)酵工藝的研究腳步從未停止，孜孜不倦地致力于提高微生物和一些食物殘留物的利用率，不斷增加各種產(chǎn)品的生產(chǎn)效率，使發(fā)酵產(chǎn)品的工藝更加簡單、更加節(jié)約能源等， 并尋求更好的方法將發(fā)酵這種方法應用到更廣泛的領(lǐng)域[2]。發(fā)酵技術(shù)的一個重要應用是防止有機物的腐爛，另一個重要應用是使口味平淡的食品原料發(fā)生感官、物理和營養(yǎng)方面的變化，改善風味和口感，它在人類的飲食文化歷史中有著重要的作用。近年來，我國發(fā)酵食品工業(yè)化水平逐年提高，白酒、酸奶等產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)展迅速，其他產(chǎn)品（如腐乳、發(fā)酵腸等）工業(yè)化程度相對較低。因此，提高我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品工業(yè)化水平，參與國際競爭很有必要?？莶菅勘U菌屬一類廣泛分布在自然環(huán)境中的需氧型革蘭氏陽性好氧菌。單個細胞長1.4~3.0 μm，菌落表面為粗糙的、不透明的微黃色，具有耐酸、耐鹽易保存等特點[3]。由于枯草芽孢桿菌需靠氧氣生長繁殖，所以會出現(xiàn)低氧環(huán)境，從而阻礙有害微生物的生長，并促進其他厭氧有益菌（如乳酸菌） 繁殖[4]。乳酸桿菌是一類桿狀厭氧型革蘭氏陽性菌，可發(fā)酵葡萄糖并產(chǎn)生大量乳酸，最適生存pH 值為5.5~6.0，在自然界中廣泛存在[5]?？莶菅挎邨U菌與乳酸菌共發(fā)酵將使發(fā)酵工藝更加簡單、更加節(jié)約時間。兩者均為不嚴格的好氧、厭氧菌，雖有矛盾，但可共存。枯草芽孢桿菌利用液體和發(fā)酵罐中的氧為乳酸菌的發(fā)酵提供缺氧環(huán)境，而同步發(fā)酵的乳酸菌能及時利用掉枯草芽孢桿菌糖化作用產(chǎn)生的還原糖，從而促進發(fā)酵，為進一步開展益生菌的共發(fā)酵食品開發(fā)奠定研究基礎(chǔ)[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：玉米粉。

試驗菌株：枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌。

試驗試劑：葡萄糖標準品（AR），中國藥品生化制品檢定所提供；福林試劑（AR）、碳酸鈉（AR）、硝酸鋁（AR）、無水乙醇（AR）、亞硝酸鈉（AR）、蛋白胨（BR）、牛肉膏（BR）、七水硫酸錳（AR）、氫氧化鈉（AR），國藥集團化學試劑有限公司提供；氯化鈉（AR）、七水硫酸鎂（AR），無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司提供；酵母粉（BR），濟南杰輝商貿(mào)有限公司提供；吐溫-80（BC），上海國藥試劑集團提供；葡萄糖（AR），北京奧秘佳得醫(yī)藥科技有限公司提供；乙酸鈉（AR），東莞市勛源化工有限公司提供；檸檬酸氫二胺（AR），鄭州美孚化工產(chǎn)品有限公司提供；磷酸氫二鉀（GR），鄭州天之昊化工產(chǎn)品有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計，南京新飛達光電科學技術(shù)公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，聯(lián)鯨精密儀器公司產(chǎn)品；pH計，杭州美控自動化技術(shù)公司產(chǎn)品；離心機，力康發(fā)展公司產(chǎn)品；電子天平，上海贊維衡器公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋，盛科信德科技公司產(chǎn)品；層流潔凈工作臺，安泰空氣技術(shù)公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，常州市億能實驗儀器廠產(chǎn)品；恒溫振蕩搖床，常州梅香儀器公司產(chǎn)品；全自動氨基酸分析儀，陽奇特爾科技公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的制備

（1） DNS 試劑。酒石酸鉀鈉18.2 g，溶于50 mL蒸餾水加熱，再依次加入3,5 -二硝基水楊酸0.03 g，氫氧化鈉2.1 g，苯酚0.5 g，攪拌溶解，冷卻后蒸餾水定容至100 mL，裝入棕色瓶中避光保存[6]。

（2） 0.9%生理鹽水。電子天平稱量1.8 g 固體氯化鈉，將其充分溶解在200 mL 蒸餾水中，于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

（3） 12%Na2CO3。先稱量12 g 的Na2CO3，將其充分溶解在100 mL 蒸餾水后定容至容量瓶中，即可得質(zhì)量分數(shù)為12%的Na2CO3溶液。

（4） 10% Al(NO3)3。準確稱量10 g 的Al(NO3)3，溶解移至100 mL 容量瓶中定容。

（5） 1 mol/L NaOH。準確稱量4 g 氫氧化鈉固體，待完全溶解后，冷卻至室溫后玻璃棒引流定容至100 mL 容量瓶中。

1.3.2 培養(yǎng)基的制備

（1） MRS 液體培養(yǎng)基。蛋白胨5 g，牛肉浸取物（牛肉膏） 5 g，酵母粉2.5 g，葡萄糖10 g，乙酸鈉2.5 g，檸檬酸氫二胺1 g，吐溫-80 0.5 mL，磷酸氫二鉀1 g，七水硫酸鎂0.1 g，七水硫酸鈾0.025 g，蒸餾水500 mL，調(diào)節(jié)pH 值6.2~6.4；于121 ℃下高壓蒸汽滅菌15 min[7]。

（2） LB 液體培養(yǎng)基。酵母粉1.0 g，胰蛋白胨2 g，氯化鈉2 g，蒸餾水200 mL，調(diào)節(jié)pH 值7.3 左右，于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

（3） 發(fā)酵培養(yǎng)基。取玉米粉5 g 于100 mL 蒸餾水中，自然pH 值，搖晃均勻，于115 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3.3 方法

（1） 菌種活化。于無菌操作臺中，從微生物培養(yǎng)平板中用接種環(huán)挑取枯草芽孢桿菌單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中37 ℃下以轉(zhuǎn)速180 r/min 振蕩培養(yǎng)直至菌液光密度為20，將乳酸桿菌接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下以轉(zhuǎn)速180 r/min 振蕩培養(yǎng)直至菌液光密度為5，備用[8]。

（2） 混菌發(fā)酵。分別從2 種活化菌液中用移液槍移取1 mL 的枯草芽孢桿菌菌液和乳酸桿菌菌液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃下以轉(zhuǎn)速180 r/min 振蕩培養(yǎng)，每隔24 h 取樣檢測[9]。

（3） 還原糖的檢測。取6 支15 mL 試管分別加入葡萄糖標準液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，每支試管補加蒸餾水至1 mL 后，各試管中添加DNS試劑2 mL，沸水浴2 min，流水冷卻，蒸餾水補至15 mL；于波長540 nm 處測其吸光度，制作標準曲線。

還原糖標準曲線見圖1。

圖1 還原糖標準曲線

發(fā)酵液中葡萄糖含量的測定：取適量樣品于離心管中，于4 ℃下以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，取上清液用于還原糖測定。用DNS 比色法[10]測定葡萄糖的含量（與葡萄糖標準曲線的制作的方法一致，將葡萄糖標準液用樣品上清液代替即可），將所測的吸光度代入葡萄糖標準曲線回歸方程中，計算得葡萄糖含量。

（4） pH 值的檢測。取發(fā)酵液2 mL 于燒杯中，加入18 mL 的0.9%生理鹽水，充分攪拌溶解，pH儀測其pH 值[11]。

（5） 總酚的測定。取1 支規(guī)格為25 mL 的試管，依次加入20 mL 蒸餾水，2 mL 12%Na2CO3溶液，1 mL福林酚溶液，補加1 mL 樣液定容至25 mL，避光1.5 h 后，于波長765 nm 處測其吸光度[12]?？偠喾拥臉饲谱饕晕舛葹榭v坐標，沒食子酸的質(zhì)量分數(shù)為橫坐標。

總酚標準曲線見圖2。

圖2 總酚標準曲線

（6） 總酮的測定。取1 支15 mL 試管，加入0.5 mL的樣品，再加入30%乙醇4.5 mL 和15%NaNO2溶液0.3 mL，反應6 min 后加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL繼續(xù)反應6 min 后，加入1 mol/L NaOH 溶液4 mL，用30%的乙醇定容至10 mL，反應15 min 后于波長510 nm 處以蒸餾水為對照，測其吸光度[13]。將數(shù)值代入標準曲線回歸方程Y=0.313 9X+0.005 2，相關(guān)系數(shù)為0.999 2，計算得黃酮質(zhì)量。

總酮標準曲線見圖3。

圖3 總酮標準曲線

（7） 氨基酸的測定。使用全自動氨基酸分析儀進行分析。其工作機理：樣品中的氨基酸在pH 值較低時攜帶正電荷，在陽離子交換樹脂上均被吸附，但其吸附強度不同，堿性氨基酸結(jié)合力最強，其次為中性氨基酸，酸性氨基酸結(jié)合力最弱。按照氨基酸分析儀設(shè)定的洗脫程序，用不同離子強度、pH 值的緩沖液依次將氨基酸按不同吸附力進行洗脫。分離后的氨基酸與茚三酮試劑在高溫反應器中進行衍生反應，生成可被分光光度計檢測的有色物質(zhì)，隨后于檢測器中被檢測出來[14]。

（8） 數(shù)據(jù)的處理。每組試驗作3 個平行組，運用Excel 計算平均值和方差，并運用Origin 8.6 軟件對發(fā)酵液數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發(fā)酵糖化率的變化

枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發(fā)酵糖化率的變化見圖4。

圖4 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發(fā)酵糖化率的變化

由圖4 可知，發(fā)酵周期內(nèi)糖化率呈上升趨勢，在發(fā)酵96 h 前，其糖化率處于持續(xù)增長狀態(tài)，說明其還原糖含量也在不斷增多。96 h 后糖化率略有下降，發(fā)酵120 h 后發(fā)酵液中的還原糖含量基本穩(wěn)定。

2.2 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發(fā)酵pH 值的變化

與發(fā)酵液的糖化率相對應，枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發(fā)酵的過程中會有一定量的乳酸積累，通過測定發(fā)酵液的pH 值加以研究。

枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌聯(lián)合發(fā)酵的pH 值變化見圖5。

圖5 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌聯(lián)合發(fā)酵的pH值變化

發(fā)酵216 h 過程中，其pH 值呈下降狀態(tài)，說明發(fā)酵液的酸度不斷增加。48 h 后發(fā)酵液pH 值大幅度下降，96 h 后其發(fā)酵的pH 值基本穩(wěn)定在4.5 左右。

2.3 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發(fā)酵總酚變化

枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌混合發(fā)酵的總酚變化見圖6。

圖6 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌混合發(fā)酵的總酚變化

由圖6 可知，發(fā)酵8 d 內(nèi)發(fā)酵液中的總酚質(zhì)量濃度始終處于上升趨勢。在發(fā)酵第2~4 天及最后1 d其總酚的增長幅度最為顯著，在發(fā)酵的第4~7 天其總酚質(zhì)量濃度變化曲線較為平穩(wěn)。酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度在不同溫度、不同蔗糖添加量和pH 值條件下也有所不同。此次發(fā)酵試驗是在恒溫條件下進行，隨著發(fā)酵時間的推移，蔗糖不斷分解為還原糖，蔗糖含量逐漸降低，酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度也隨之增加，通常在pH 值低于4 時，酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度較低，由圖5可知其發(fā)酵液最低pH 值大于4，因此發(fā)酵整體總酚質(zhì)量濃度處于增長狀態(tài)。

2.4 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發(fā)酵總酮的分析

枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌混合發(fā)酵的總酮變化見圖7。

圖7 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌混合發(fā)酵的總酮變化

由圖7 可知，枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌混合發(fā)酵過程中，總酮質(zhì)量濃度的變化趨勢：發(fā)酵初始階段黃酮質(zhì)量濃度明顯升高，之后增加較為緩慢，在120 h 后其總酮質(zhì)量濃度仍緩慢增加，最后2 d 其總酮質(zhì)量濃度分別為0.092 8，0.097 8 mg/mL 兩者相差不大，總酮質(zhì)量濃度基本趨于穩(wěn)定。由陳玲等人[14]研究可知，在發(fā)酵過程中隨著還原糖含量的不斷增加，酒精含量也會不斷增加，因此出現(xiàn)如圖7 這種質(zhì)量濃度變化是因為隨著發(fā)酵時間不斷推移，酒精含量不斷增加；玉米粉中黃酮溶解量不斷增加。其中影響酒精含量的因素有溫度、枯草芽孢桿菌接種量、糖濃度等因素。由于試驗在恒溫環(huán)境下進行的，所以可以忽略溫度對發(fā)酵液的影響，而枯草芽孢桿菌的接種量越多其發(fā)酵速度就越快，糖化率也就越高，從而導致酒精含量增加，使發(fā)酵液的總酮質(zhì)量濃度增加。由于最后恒量玉米粉中的大部分黃酮已被萃取，使其黃酮的萃取趨于穩(wěn)定。

2.5 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發(fā)酵氨基酸合成代謝分析

氨基酸峰面積變化圖見圖8。

圖8 氨基酸峰面積變化圖

取發(fā)酵樣液2 mL 于離心管中，于4 ℃下以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min 取上清液，使用針筒過濾器過濾放入冰箱保存，用于氨基酸的測定。其中要注意發(fā)酵液必須過濾以防止損壞機器，還需注意樣液量必須為2 mL，以保證氨基酸檢測儀順利吸取樣液。取發(fā)酵過程中具有代表性的3 d 進行分析。

由圖8 可知，精氨酸、甘氨酸、賴氨酸含量在發(fā)酵過程中持續(xù)下降，胱氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、纈氨酸、蛋氨酸含量在不斷升高，其中苯基丙氨酸含量最高。苯基丙氨酸、蛋氨酸、丙氨酸在72~96 h 期間峰面積的增長速度明顯加快，在此階段賴氨酸的峰面積下降速度明顯加快；氨基酸的消耗可能與微生物的生長消耗有關(guān)，微生物滋生的越多，其氨基酸的消耗也就越多，這也側(cè)面說明枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌在此時生長較旺盛。

3 結(jié)論

以玉米粉為基質(zhì)，枯草芽孢桿菌與乳酸菌共同發(fā)酵后其糖化率、總酮、總酚含量不斷增加，pH 值不斷下降，基本穩(wěn)定在4.5 左右，發(fā)酵液中除無色氨酸外，其余氨基酸基本含有，除微生物對氨基酸的消耗外，丙氨酸、賴氨酸、苯基丙氨酸、谷氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、酪氨酸含量都較高，這2 種菌的共同發(fā)酵大大提升了其傳統(tǒng)發(fā)酵工藝的速率，也提升了氨基酸的種類與含量，賦予了發(fā)酵食品更好的品質(zhì)，更加值得在發(fā)酵工藝中推廣。