張 爽，劉敏芳，劉 帆，馬曉艷

（浙江方圓檢測集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州 310018）

0 引言

可食用著色劑是一類能賦予食品色澤或改善食品色澤的物質(zhì)，目前我國常用的食品著色劑種類繁多，根據(jù)其合成途徑可分為天然著色劑和合成著色劑兩類，按其溶解性質(zhì)又可分為水溶性和脂溶性著色劑[1]。合成著色劑著色艷麗、價(jià)格低廉，被廣泛使用于食品加工行業(yè)，然而合成著色劑主要以苯胺染料為原料，經(jīng)過磺化、鹵化、偶氮化等有機(jī)反應(yīng)合成，對(duì)人體具有一定的危害作用，長期攝入可致癌、致畸[2-3]。因此，我國對(duì)相關(guān)合成著色劑制定了嚴(yán)格的管控標(biāo)準(zhǔn)，其中GB 2760—2014 規(guī)定靛藍(lán)、新紅、亮藍(lán)、誘惑紅、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅是允許在食品中限量使用的，并明確規(guī)定了其最大使用限量[4]。

目前，合成著色劑的檢測方法主要有紫外分光光度法[5]、薄層色譜法[6-7]、毛細(xì)管電泳法[8]、高效液相色譜法[9-10]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[11-12]。其中，紫外分光光度法在混合著色劑的檢測方面存在互相干擾的問題，薄層色譜法和毛細(xì)管電泳法靈敏度低且重現(xiàn)性較差，在合成色素的準(zhǔn)確定性和定量方面存在一定局限性。高效液相色譜法能夠有效分離各種合成著色劑，其中GB 5009.141—2016 和GB 5009.35—2016 均采用了高效液相色譜法檢測合成著色劑[13-14]，現(xiàn)行國標(biāo)GB 5009.35—2016 中只能同時(shí)測定7 種合成著色劑，難以滿足市場監(jiān)管要求。串聯(lián)質(zhì)譜法具有快速、靈敏、高通量和選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，其在分析物精準(zhǔn)定性與定量上具有較大優(yōu)勢，是非常有效的合成著色劑檢測技術(shù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，Waters corporation 公司產(chǎn)品；Thermo Scientific 型離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；旋蒸儀，東京理化器械株式會(huì)社產(chǎn)品；GL Sciences WondaSil C18型色譜柱（4.6 mm I.D.×250 mm，5 μm）、甲醇、乙酸銨為色譜純，乙醇、氨水為分析純。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：靛藍(lán)（indigotine，純度99.0%）、新紅（new red，純度92.0%）、亮藍(lán)（brilliant blue FCF，純度83.0%）、誘惑紅（allura red AC，純度80.0%）、檸檬黃（tartrazine，純度90.0%）、日落黃（sunset yellow，純度87.0%）、莧菜紅（amaranth，純度81.0%）、胭脂紅（ponceau 4RC，純度75.0%），標(biāo)準(zhǔn)樣品均為壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司提供。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取靛藍(lán)、新紅、亮藍(lán)、誘惑紅、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)品（精確到0.000 1 g） 配制成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。根據(jù)實(shí)際需要配成混標(biāo)溶液，使用時(shí)再將混標(biāo)溶液稀釋成梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 色譜-質(zhì)譜條件

利用GL Sciences WondaSil C18（4.6 mm I.D.×250 mm，5 μm） 柱進(jìn)行分離。流動(dòng)相：A 相，甲醇；B 相，20 mmol/ L 乙酸銨水溶液。柱溫35 ℃，樣品溫度25 ℃，進(jìn)樣體積5 μL，流速1.0 mL/min。液相色譜流出液分流后進(jìn)質(zhì)譜檢測。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

離子化模式：電噴霧離子源；霧化氣流速為1.50 L/min；分析模式：負(fù)離子模式；干燥氣流速10 L/min；曲形脫溶劑管（CDL） 溫度200 ℃；檢測器電壓1.70 kV；加熱模塊溫度200 ℃；離子源電壓4.5 kV；質(zhì)譜采集范圍（m/z） 200~600；離子累積時(shí)間100 ms。

1.3 樣品預(yù)處理

將樣品攪拌均勻制成肉糜后，精確稱取10 g 樣品于50 mL 比色管中，加入乙醇-氨水溶液30 mL，將比色管置于超聲波清洗儀中超聲提取30 min，用乙醇- 氨- 水溶液（7∶2∶1，V/V） 定容至刻度。搖勻，倒入離心管中進(jìn)行離心（以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心10 min），將上清液倒入燒杯中，加熱使乙醇和氨蒸發(fā)。待樣液少于10 mL 時(shí)，冷卻至溫室。加入檸檬酸溶液，調(diào)節(jié)pH 值到4.0 左右，再加入聚酰胺，攪均后倒入G3 漏斗中，進(jìn)行抽濾，分別用pH 值為4.0，溫度為60 ℃的水、甲醇-甲酸（V/V，6∶4）、熱蒸餾水各沖洗3 次，最后再用5 mL 乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V） 溶液，解析3~5 次。收集全部解析液，用乙酸中和，蒸干，最后用流動(dòng)相定容到5.0 mL。定容后經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，濾液進(jìn)行上機(jī)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法選擇

8 種可食用著色劑均為水溶性著色劑，可直接用水進(jìn)行提取。由于肉制品中脂肪和蛋白含量較高，可用乙醇進(jìn)行分離，故選用乙醇的水溶液進(jìn)行提取效果較好，同時(shí)再加入部分氨水，會(huì)起到更好的提取著色劑的效果，因此試驗(yàn)選用氨水-乙醇的水溶液來提取樣品。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與精密度

用超純水配制8 種可食用著色劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用流動(dòng)相將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成一系列質(zhì)量濃度，以峰面積和質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8 種著色劑的保留時(shí)間、監(jiān)測離子、線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)（R2） 及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。

表2 8 種著色劑的保留時(shí)間、監(jiān)測離子、線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.2.2 檢出限、定量限、回收率的確定

分別在空白樣品中添加3 種不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述預(yù)處理方法進(jìn)行前處理。

肉制品中8 種可食用著色劑的回收率、檢出限（LOD，S/N=3）、定量限（LOQ，S/N=10） 及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

表3 肉制品中8 種可食用著色劑的回收率、檢出限、定量限及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

由表3 可知，在低、中、高3 種加標(biāo)水平，8 種可食用著色劑的回收率分別為50.3%~89.1%，52.6%~103.2%，67.0%~91.6%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.6%~9.0%，5.4%~8.9%，5.6%~8.6%，符合日常檢測的要求。

2.3 樣品確證

由于高效液相色譜法存在對(duì)目標(biāo)峰定性不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，容易產(chǎn)生誤判。而利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量、定性的方法，造成誤判的可能將大大減小。以日落黃為例。

日落黃的色譜圖見圖1，日落黃的提取離子流圖見圖2。

圖1 日落黃的色譜圖

圖2 日落黃的提取離子流圖

首先，可通過二極管陣列檢測器與離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜的保留時(shí)間進(jìn)行定性。在色譜圖上顯示的日落黃的保留時(shí)間為23.4 min，在提取離子流圖上顯示的日落黃的保留時(shí)間為23.5 min，保留時(shí)間幾乎相同，有細(xì)微差別是正常的，這是因?yàn)槟繕?biāo)物是先經(jīng)過二極管陣列檢測器進(jìn)行檢測，然后才進(jìn)入到質(zhì)譜被檢測到。所以這樣不會(huì)造成錯(cuò)找目標(biāo)化合物的色譜峰。其次，可通過精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性。

日落黃的三級(jí)質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 日落黃的三級(jí)質(zhì)譜圖

建立了利用液相色譜質(zhì)譜法測定肉制品中可能濫用的8 種可食用著色劑的分析方法。LCMS-IT-TOF方法的檢出限如下：新紅檢出限0.15 mg/kg，定量限0.5 mg/kg；靛藍(lán)、誘惑紅、檸檬黃的檢出限1.50 mg/kg，定量限5.0 mg/kg；亮藍(lán)、日落黃檢出限0.75mg/kg，定量2.5 mg/kg；胭脂紅、莧菜紅檢出限0.30 mg/kg，定量限1.0 mg/kg。液相方法的定量限如下：靛藍(lán)定量限0.40 mg/kg，亮藍(lán)定量限1.04 mg/kg，檸檬黃定量限0.16 mg/kg，莧菜紅定量限0.24 mg/kg，日落黃定量限0.28 mg/kg，胭脂紅和誘惑紅定量限0.32 mg/kg，新紅定量限0.20 mg/kg。8 種可食用著色劑的線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10%，3 個(gè)水平的加標(biāo)回收率為50.3%~103.2%，高效液相色譜的加標(biāo)回收率為70.6%~99.5%。將該方法應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測，并通過離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)、快速簡便、多級(jí)質(zhì)譜分析、專屬性強(qiáng)、定性準(zhǔn)確的優(yōu)勢對(duì)陽性樣品進(jìn)行了確證，能夠有效地避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，可滿足肉制品中的合成食用色素的分析及確證要求，在食品安全控制中具有很好的實(shí)用性。

因此，利用高效液相色譜對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量，離子阱- 飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行定性的方法簡便、快速且可同時(shí)對(duì)陽性樣品進(jìn)行確證，大大節(jié)約了時(shí)間及提升了風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測的能力。

3 結(jié)論

建立了利用液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜法，測定肉制品中可能濫用的8 種可食用著色劑的分析方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證各指標(biāo)均滿足日常檢測要求。與現(xiàn)有的檢測標(biāo)準(zhǔn)相比，該方法增加了所檢測的合成著色劑種類。同時(shí)，由于利用高效液相色譜對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量，利用離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行定性，該方法能夠準(zhǔn)確快速地對(duì)陽性樣品進(jìn)行確證，大大節(jié)約了時(shí)間及提升了風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測的能力。將該方法應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測，能夠有效地避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，可滿足肉制品中的合成食用色素的分析及確證要求，在食品安全控制中具有很好的實(shí)用性。