付 香，王賀新，王 碟，王 欣，任 瀚，婁 鑫

（大連大學(xué)生命健康學(xué)院，遼寧 116622）

木霉屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目叢梗孢科，其有性型為子囊菌門糞殼菌綱肉座菌目肉座菌科的肉座菌屬，具有廣譜、高效的抑菌功能活性并且能夠促進(jìn)植物的生長發(fā)育[1-3]。21 世紀(jì)以前的研究大多集中在木霉生物防治機(jī)制與應(yīng)用方面，而對木霉促生作用機(jī)理的研究較少，近年來木霉作為生物肥料的研究越來越廣泛[4-6]，其主要參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育[7-9]、降解或抑制根際有害物質(zhì)的產(chǎn)生[10-12]、提高養(yǎng)分利用效率[13-14]等過程。木霉的次級代謝產(chǎn)物中包含大量植物激素或激素類似物[9]，如吲哚乙酸、赤霉素等，可以參與調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育過程[15-16]。木霉能夠促進(jìn)土壤養(yǎng)分的循環(huán)轉(zhuǎn)化，能夠產(chǎn)生有機(jī)酸促使磷酸鹽溶解[17]，還可以提高植株根際土壤的全磷、有效磷、全氮、水解氮、全鉀、速效鉀含量，增加馬尾松幼苗對養(yǎng)分的吸收利用效率[18]。當(dāng)植株處于非生物脅迫條件下，木霉的存在可以減少植株活性氧的積累，提高植株對抗非生物脅迫的能力，接種哈茨木霉和綠色木霉后的玉米幼苗可以減輕干旱脅迫和鹽堿脅迫帶來的損傷[19-20]，接種棘孢木霉后的番茄植株也會消除低溫和干旱脅迫帶來的負(fù)面影響，只是相較于低溫脅迫，對干旱脅迫的緩解作用更為明顯[21]。不同種的木霉因形態(tài)結(jié)構(gòu)和次級代謝產(chǎn)物的差異[22]，導(dǎo)致生物活性和功能發(fā)揮存在較大的不同[23]。黃瓜土壤中施用哈茨木霉可以顯著提高黃瓜總根長、根體積、根尖數(shù)以及葉片的凈光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度和水分利用效率等[24]，施用擬康氏木霉和棘孢木霉可以顯著提高葉綠素、硝態(tài)氮含量以及硝酸還原酶活性[25]。長枝木霉菌肥可以顯著提高蘋果砧木的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量[26]。施用綠色木霉可以顯著提高番茄防御酶活性和酚類物質(zhì)水平等[27]。木霉種類和寄主植物的不同以及土壤中其他微生物的影響都會對木霉促生機(jī)理的研究產(chǎn)生一定影響。隨著新的木霉菌株不斷被開發(fā)和利用，其作用機(jī)制的深入研究和實(shí)際應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)展。因此，收集和鑒定木霉屬種類資源并對其促生能力進(jìn)行測試對木霉資源的開發(fā)利用具有重要價(jià)值。目前關(guān)于木霉促生機(jī)理的研究主要集中在蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物上，在果樹方面的研究較少，且沒有特定的優(yōu)良菌種能夠用于生產(chǎn)實(shí)踐[28-29]。另外，植株水培條件下關(guān)于木霉促生機(jī)理的研究也比較少，沒有具體的參考與研究實(shí)踐標(biāo)準(zhǔn)。

藍(lán)莓是杜鵑花科越橘屬植物，其果實(shí)具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[30-32]。在種植過程中，病菌侵害和水肥施用不當(dāng)?shù)葐栴}都會降低其果實(shí)品質(zhì)并影響其生長速度[33-35]。藍(lán)莓菌根一般認(rèn)為是歐石楠菌，存在于藍(lán)莓根系中，促進(jìn)藍(lán)莓的養(yǎng)分吸收[36-37]，由于藍(lán)莓根系不發(fā)達(dá)，缺少根毛[38]，關(guān)于藍(lán)莓根際促生菌的研究比較有限，研究起來也比較復(fù)雜，收集和開發(fā)多種藍(lán)莓根際促生菌資源以及研究根際促生菌對藍(lán)莓的影響機(jī)制都對促進(jìn)藍(lán)莓養(yǎng)分吸收、改善藍(lán)莓生長和生理特性具有重要意義。有研究報(bào)道稱木霉能夠防治藍(lán)莓根腐病[39-40]、促進(jìn)藍(lán)莓的根系分枝，但未見木霉對藍(lán)莓植株具體生長和生理特性影響的報(bào)道，需要進(jìn)一步研究。

在前期藍(lán)莓水培試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，在相同條件下有白色絲狀真菌侵染的藍(lán)莓植株較其他植株生長更為旺盛。從有絲狀真菌侵染的藍(lán)莓根系中分離出1 株真菌，對該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特性研究，將其鑒定分類，并利用水培技術(shù)，以3 月生藍(lán)豐藍(lán)莓幼苗為試驗(yàn)材料，將該菌株制成1×108cfu/g 孢子懸浮液，研究其對藍(lán)莓幼苗生長及生理狀態(tài)的影響，以期為藍(lán)莓促生菌的研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以前期染菌的藍(lán)莓根系為材料進(jìn)行菌物分離。菌物回接所用的3 月生藍(lán)豐藍(lán)莓幼苗由大連森茂現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司提供。

1.2 木霉的分離與鑒定

取健康無病害的藍(lán)莓根系組織，采用組織表面滅菌法將根段進(jìn)行消毒處理，并將根段放于孟加拉紅培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)，設(shè)置培養(yǎng)箱溫度為28 ℃，待觀察到根段的剪口處生長出真菌的菌絲之后，在潔凈工作臺上挑取剪口處的菌絲接種到新的培養(yǎng)皿中進(jìn)行純化，直至得到單一菌株（菌株A）。

將得到的純化菌株A 接種到PDA 平板上，在28 ℃條件下恒溫暗培養(yǎng)；從24 h 之后開始，每隔12 h 測量1 次菌落的直徑并觀察菌落的形狀，記錄菌落的顏色變化。在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48 h時(shí)，即菌絲還未見孢子產(chǎn)生時(shí)，挑取菌絲，使用臺盼藍(lán)染液對其進(jìn)行染色鏡檢，觀察分生孢子梗的形態(tài)和特征。培養(yǎng)3 d 后，菌落即可明顯觀察到綠色或暗綠色孢子，挑取菌落的分生孢子同樣使用臺盼藍(lán)染液進(jìn)行染色制片，在低倍和高倍光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子的形狀和顏色，采用分類學(xué)方法進(jìn)行鑒定[41-42]。

采用改良的SDS 法提取菌株總DNA，PCR 擴(kuò)增該菌株的ITS 序列。將擴(kuò)增后產(chǎn)物送交給生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序得到核苷酸序列后，登錄NCBI 與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行BLAST 比對，獲取與其相似度較高的菌種核酸序列。將其從GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲取的序列與測序回來的菌株A 序列導(dǎo)入Mega 7.0 軟件中，構(gòu)建菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行菌種親緣關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3 菌株A 對藍(lán)莓生長發(fā)育影響的研究

試驗(yàn)地點(diǎn)在遼寧省大連市金州區(qū)大連森茂現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司溫室大棚。將培養(yǎng)7 d 的菌株A 用無菌水配制成濃度為5×106cfu/g 的孢子懸浮液備用。以3 月生藍(lán)豐扦插幼苗為試驗(yàn)材料，采用水培方式培養(yǎng)，營養(yǎng)液以Hoagland 和Arnon 營養(yǎng)液為基礎(chǔ)，微量元素參照其他通用配方。營養(yǎng)液用無菌去離子水配制，利用硫酸將其pH 值調(diào)整為4.0～4.5。試驗(yàn)首先挑選長勢一致的藍(lán)莓幼苗，轉(zhuǎn)移到普通水培營養(yǎng)液中進(jìn)行2 周的適應(yīng)性轉(zhuǎn)水培養(yǎng)，在此基礎(chǔ)上再次挑選長勢一致的幼苗進(jìn)行下一步試驗(yàn)。將5×106cfu/g 孢子懸浮液稀釋成1×108cfu/g 孢子懸浮液。試驗(yàn)設(shè)定2 組，以無菌營養(yǎng)液為對照，以施用1×108cfu/g 孢子懸浮液為菌株處理，各處理15 株。試驗(yàn)所使用的水培容器為高15 cm、直徑8 cm、容量900 mL 的玻璃制廣口瓶，外部用黑色膜布包裹以避免透光影響根系的生長。在處理后40 d 測定株高、葉面積、根體積以及葉片光合參數(shù)，并取樣測定單株生物量及葉片色素、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）、可溶性糖、脯氨酸含量。

使用卷尺（精確到1 mm）測量株高，打孔稱重法測定葉面積。采用LI-6400/XT 光合測定系統(tǒng)于8：30—11：00 測定光合參數(shù)：凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs），計(jì)算水分利用效率（WUE），氣溫18～20 ℃，葉溫22 ℃，光強(qiáng)1 000 μmol·m-2·s-1；于19：00—21：00 暗環(huán)境下測定呼吸速率（Rd），氣溫18～20 ℃，葉溫22 ℃，測定部位為從頂部往下數(shù)第4片葉，每個(gè)處理隨機(jī)測3 株，3 次重復(fù)。根體積、SOD 活性和MDA、可溶性糖、脯氨酸含量分別采用排水法、氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法[43]、硫代巴比妥（TBA）法[44]、蒽酮比色法[45]、茚三酮比色法[46]測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 軟件整理數(shù)據(jù)并制圖，采用SPSS 26 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌落形態(tài)特征

PDA 培養(yǎng)條件下，菌落生長迅速，培養(yǎng)3 d（圖1-A），菌落會產(chǎn)生比較致密平坦的棉絮狀或致密叢束狀的氣生菌絲，該菌株表面的顏色多呈白色，有非常明顯的同心圓環(huán)狀產(chǎn)孢區(qū)，并且在同心環(huán)上產(chǎn)生稠密的分生孢子，接近中央的分生孢子呈暗綠色。培養(yǎng)7 d（圖1-B），菌落為暗綠色，產(chǎn)生大量分生孢子。

圖1 菌落形態(tài)特征

2.1.2 菌落生長速度

從接種24 h 后每隔12 h 測量1 次菌落直徑，如圖2 所示，菌落生長速度較快，產(chǎn)孢量大，能快速擴(kuò)繁，其中在48～60 h 時(shí)間段內(nèi)菌落生長的速度最快，菌株在28 ℃恒溫暗培養(yǎng)3 d 即鋪滿整個(gè)平板。

圖2 菌落生長速度

2.1.3 菌株顯微特征

如圖3 所示，菌絲為有隔分枝，菌絲的寬度為2.1～2.5 μm，分生孢子梗是菌絲的短側(cè)枝，菌絲具有長的主軸，側(cè)分支呈現(xiàn)較短的分叉，側(cè)枝上的分枝對稱或互生，形成二級或三級分枝，分枝角度為銳角或接近于直角，在分枝末端形成類似瓶狀的小梗，末端形成分生孢子團(tuán)。分生孢子形狀多為卵圓形或橢圓形，簇生于小梗的頂端，長2.5～4.2 μm，寬1.5～3.8 μm，顏色多呈綠色或者無色。根據(jù)該菌的形態(tài)特征將其初步鑒定為棘孢木霉。

圖3 菌絲和分生孢子

2.1.4 菌株分子鑒定結(jié)果

測序得到菌株的基因序列，長577 bp。將所得序列輸入GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 同源性比對，得出的登錄號為MG781721.1。采用鄰位相連算法（Neighbor-Joining Method）獲得分支系統(tǒng)樹，置信度檢測通過自舉分析（bootstrap），設(shè)置自展數(shù)據(jù)集的次數(shù)為1 000 次。使用Mega 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和聚類分析，將獲得的序列導(dǎo)入Mega 7.0 軟件中，構(gòu)建菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Kimura 雙參數(shù)模型計(jì)算各序列的分化距離，省略缺少和不確定的位點(diǎn)。系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）的結(jié)果表明，待測菌株A 與已知的棘孢木霉在同一個(gè)分支中。由此進(jìn)一步證明，待測菌株A 為棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。

圖4 基于ITS 基因序列的木霉系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株處理對藍(lán)莓幼苗生長發(fā)育的影響

2.2.1 菌株處理對藍(lán)莓幼苗生長的影響

菌株處理對藍(lán)莓幼苗的株高和葉面積均無顯著影響，但顯著提高了藍(lán)莓幼苗的根體積和單株生物量，菌株處理的根體積和單株生物量分別為對照的1.40 倍和1.62 倍（表1）。

表1 菌株處理對藍(lán)莓幼苗生長及生物量的影響

2.2.2 菌株處理對藍(lán)莓幼苗葉片色素含量的影響

植物葉片色素含量是植株生理特征的重要指標(biāo)。菌株處理的藍(lán)莓幼苗葉片色素含量相較于對照均有所變化，其中葉綠素a 含量和類胡蘿卜素含量分別為對照的1.26 倍和1.32 倍，且均差異顯著；葉綠素b 含量和總?cè)~綠素含量均與對照差異不顯著（表2）。

表2 菌株處理對藍(lán)莓幼苗葉片色素含量的影響 mg/g

2.2.3 菌株處理對藍(lán)莓幼苗葉片光合參數(shù)和呼吸速率的影響

接種菌株A 對藍(lán)莓幼苗葉片的光合和呼吸速率有一定的促進(jìn)作用。菌株處理的藍(lán)莓幼苗葉片Gs、Tr、Ci、Rd 均有改善和提升，其中Gs 和Rd 分別為對照的3.08 倍和1.58 倍，差異均極顯著；Tr 和Ci分別為對照的1.30 倍和1.16 倍，差異均顯著。但菌株處理對藍(lán)莓幼苗葉片Pn 和WUE 均未產(chǎn)生顯著影響（圖5）。說明菌株處理可以提高藍(lán)莓幼苗葉片的蒸騰速率和呼吸速率，促進(jìn)藍(lán)莓幼苗的氣孔開放和蒸騰作用。

圖5 菌株處理對藍(lán)莓幼苗葉片光合參數(shù)的影響

2.2.4 菌株處理對藍(lán)莓幼苗抗氧化酶和抗逆性指標(biāo)的影響

菌株處理會影響藍(lán)莓抗氧化酶活性和抗逆性指標(biāo)，對藍(lán)莓植株的防御機(jī)制起到一定的加強(qiáng)作用。菌株處理對藍(lán)莓葉片MDA 含量和可溶性糖含量均有顯著影響，分別為對照的1.28 倍和1.30 倍；而對藍(lán)莓葉片SOD 活性和脯氨酸含量均無顯著影響（圖6）。說明菌株處理會改善藍(lán)莓幼苗葉片的抗氧化酶活性，增強(qiáng)藍(lán)莓幼苗的抗逆性，但對藍(lán)莓幼苗葉片SOD 活性和脯氨酸含量均未起到顯著調(diào)節(jié)的作用。

圖6 菌株處理對藍(lán)莓幼苗抗逆性指標(biāo)的影響

3 討論與結(jié)論

根際益生菌的開發(fā)與應(yīng)用是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，促生機(jī)理主要包括調(diào)節(jié)植物激素水平[47]，合成抗生素、嗜鐵素、溶解酶等次級代謝產(chǎn)物[48]，增強(qiáng)植物對生物和非生物脅迫的抗性[49-50]，活化土壤中養(yǎng)分[51]等。在植物根際促生菌中，木霉菌種類豐富，生長速度快且抗逆性強(qiáng)，世界分布范圍廣泛，可充分體現(xiàn)生物防治劑和生物肥料的特點(diǎn)。在以往傳統(tǒng)的真菌分類學(xué)上，一般都是將形態(tài)學(xué)特征作為主要鑒定標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)對水培藍(lán)莓根系中1 株白色絲狀真菌進(jìn)行分離和鑒定，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定，該菌株與棘孢木霉的特征基本一致，將其鑒定為棘孢木霉，并將該菌株用于藍(lán)莓水培試驗(yàn)。

在植株根系施用微生物菌劑能夠促進(jìn)植株的生長，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)[52-53]。Yedidia 等[54]在溫室栽培和水培黃瓜系統(tǒng)中接種哈茨木霉可以顯著提高黃瓜根長、根表面積和根尖數(shù)量，能夠改善植株的營養(yǎng)吸收狀態(tài)，通過研究得出，植物營養(yǎng)水平的提高可能與接種哈茨木霉后根系總體的有益生長效果直接相關(guān)。水稻經(jīng)棘孢木霉浸種后再播種，株高和地上部干重也顯著高于對照[55]，且與對照相比，水稻根際土壤氮含量顯著提高，氮轉(zhuǎn)化效率也明顯改善，有效促進(jìn)了水稻生物量和產(chǎn)量的提升。在本試驗(yàn)中，菌株處理的藍(lán)莓幼苗根體積顯著高于對照，單株生物量也明顯增加，這與在黃瓜、水稻中的研究結(jié)果一致。可能是施加木霉菌株孢子懸浮液后，木霉不僅可以定殖到藍(lán)莓根系中，還能夠活化氮、磷、鉀等養(yǎng)分元素，促使藍(lán)莓根系對養(yǎng)分元素的吸收，使得藍(lán)莓幼苗的生長明顯提高。

光合作用是植物生長的基礎(chǔ)，能夠反映植物的生長勢[56]，微生物菌劑的施用會對植株光合色素、氣體交換參數(shù)以及呼吸速率產(chǎn)生影響[57-59]。在番茄幼苗根際土壤中施用木霉，葉綠素含量顯著提高[60]。與未接種木霉的甘蔗植株相比，接種木霉的甘蔗植株改變了作物營養(yǎng)、葉綠素和類胡蘿卜素濃度，促使植株光合速率、氣孔導(dǎo)度和水分利用效率均明顯增強(qiáng)，這些級聯(lián)反應(yīng)促使了甘蔗根和莖的發(fā)育[61]。玉米經(jīng)木霉菌處理后，葉片的光合色素含量顯著上升，光合特性也顯著增強(qiáng)[19]。本試驗(yàn)利用營養(yǎng)液水培法，通過施加木霉菌株孢子懸浮液發(fā)現(xiàn)，施用木霉能夠顯著提高藍(lán)莓幼苗葉片葉綠素a 和類胡蘿卜素含量，增強(qiáng)了藍(lán)莓幼苗的光合和呼吸過程，同時(shí)促進(jìn)了葉片氣孔的開放，提高了葉片的蒸騰速率，有利于水分和無機(jī)營養(yǎng)的吸收，增加了胞間CO2濃度，促進(jìn)了葉片的光合碳同化過程，為藍(lán)莓植株生長提供更多的有機(jī)營養(yǎng)。

根際益生菌可以誘導(dǎo)植物抗病相關(guān)防御酶發(fā)生變化，增強(qiáng)植物體的抗病防御能力[27]。超氧化物歧化酶是植物體內(nèi)存在的抗氧化金屬酶[62]，木霉可以對植株SOD 活性產(chǎn)生影響，番茄植株經(jīng)木霉處理后葉片SOD 活性明顯提高[63]，在本研究中，藍(lán)莓葉片SOD 活性相對于對照有所降低，但無顯著性差異，可能是因?yàn)槟久故┘拥剿{(lán)莓根系，藍(lán)莓根部釋放的化學(xué)信號吸引木霉在藍(lán)莓根部附著、滲透和定殖，形成藍(lán)莓根系和木霉的共生體系，木霉寄生到藍(lán)莓根系細(xì)胞中對藍(lán)莓根系細(xì)胞有損傷，導(dǎo)致地上部葉片膜系統(tǒng)遭到一定程度的破壞，自由基積累過多。丙二醛是植物體氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，脯氨酸含量和可溶性糖含量的變化也一直是植物抗逆性研究的重要指標(biāo)[64-65]。在木霉緩解水稻干旱性脅迫的研究中[66]，木霉定殖導(dǎo)致丙二醛、脯氨酸含量的降低和酚類物質(zhì)水平的提高，緩解了干旱性脅迫帶來的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藍(lán)莓植株處于非脅迫狀態(tài)下，菌株處理顯著提高了藍(lán)莓葉片丙二醛、可溶性糖含量，說明木霉可以雙向調(diào)節(jié)抗氧化酶和抗逆性指標(biāo)的變化，通過激活和調(diào)節(jié)植株的防御機(jī)制來增強(qiáng)植株應(yīng)對生物和非生物脅迫的能力，本試驗(yàn)?zāi)久咕暧欣谠鰪?qiáng)藍(lán)莓的抗脅迫能力，提高藍(lán)莓的生理特性。

綜上所述，對水培藍(lán)莓根系中的絲狀真菌進(jìn)行分離，并通過形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，將該菌株鑒定為棘孢木霉。在水培藍(lán)莓回接培養(yǎng)試驗(yàn)條件下，該菌株能夠顯著促進(jìn)藍(lán)莓葉片和根系生長，顯著提高藍(lán)莓幼苗葉片丙二醛、可溶性糖、光合色素含量，顯著增強(qiáng)藍(lán)莓幼苗葉片的光合特性，說明該菌株的促生效果明顯，能在一定程度上改善藍(lán)莓幼苗的生長和生理特性。但在田間栽培條件下，木霉對藍(lán)莓植株的促生效果會受到土壤中其他微生物的影響，其促生機(jī)理及互作機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究初步探討了木霉對藍(lán)莓生長發(fā)育的影響，以期為木霉資源的開發(fā)和藍(lán)莓栽培中施用微生物菌劑的應(yīng)用提供理論參考。