丁玲玲,沈蘇琴,汪曉曼

南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院/南京市婦幼保健院檢驗科,江蘇南京 210009

卵巢癌是常見的女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤,死亡率位居婦科惡性腫瘤首位,全球年齡標(biāo)準(zhǔn)化的5年凈生存率在30%～50%之間[1]。卵巢癌發(fā)病隱匿,早期缺乏特異性的臨床癥狀,80%的患者初診時已處于晚期。晚期卵巢癌患者復(fù)發(fā)率高,臨床轉(zhuǎn)歸差,5年生存率低于30%[2-3],因此根據(jù)卵巢癌的臨床病理特征對其轉(zhuǎn)歸進(jìn)行早期預(yù)測并實施個體化干預(yù),對優(yōu)化治療方案,改善預(yù)后,提高治療效果具有十分重要的意義。分泌型白細(xì)胞蛋白酶抑制因子(SLPI)是一種黏膜上皮細(xì)胞分泌的非糖基化單鏈多肽蛋白,通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲功能,誘發(fā)腫瘤的發(fā)生發(fā)展,已被證實是某些惡性腫瘤不良預(yù)后評估的重要標(biāo)志物[4]。睪素2(SPOCK2)是一類富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白/骨連接素蛋白,該基因在惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要功能,作為潛在的致癌基因是某些惡性腫瘤不良預(yù)后的指標(biāo)及治療靶點[5]。本研究通過檢測卵巢癌患者血清中SLPI、SPOCK2水平,分析SLPI、SPOCK2表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,旨在明確其在卵巢癌患者不良預(yù)后評估中的臨床價值,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年1月至2019年11月于本院治療的67例卵巢癌患者和同期于本院體檢的48例健康者為納入研究,分別作為卵巢癌組和對照組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理學(xué)確診為卵巢癌;(2)術(shù)前未接受卵巢癌相關(guān)治療;(3)術(shù)后嚴(yán)格按照卵巢癌診療規(guī)范進(jìn)行相應(yīng)治療;(4)具備完整臨床資料和隨訪資料。排出標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他惡性腫瘤者;(2)合并心、腦、腎、肝等器官功能障礙者;(3)術(shù)前行放療、化療和激素治療者;(4)臨床資料、隨訪資料不完整者。卵巢癌組年齡41～73歲,平均(55.16±9.88)歲;正常對照組年齡39～72歲,平均(54.32±10.12)歲。兩組一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)通過,且均獲得患者知情同意。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集 留取患者靜脈血5 mL,室溫靜置20 min,3 000 r/min離心10 min,取上清-80 ℃保存待測。

1.2.2指標(biāo)檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中SLPI、SPOCK2水平(試劑盒購于上海滬震實業(yè)有限公司),嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。SLPI檢測范圍為62.5～4 000.0 pg/mL,SPOCK2檢測范圍為0.312～20.000 ng/mL。

1.2.3生物信息學(xué)分析 通過基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析(GEPIA)在線網(wǎng)站(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析426例卵巢癌組織和88例正常卵巢組織中SLPI、SPOCK2表達(dá)。利用Kaplan-Meier法(http://www.kmplot.com)分析SLPI、SPOCK2表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后生存情況的關(guān)系。

1.2.4隨訪 對卵巢癌患者進(jìn)行術(shù)后隨訪,以首次手術(shù)日期為隨訪開始時間,每隔3個月,采用電話形式或門診復(fù)查形式,以2021年11月為隨訪截止時間,隨訪結(jié)局變量為復(fù)發(fā)或無復(fù)發(fā)。

2 結(jié) 果

2.1卵巢癌患者與健康者組織及血清中SLPI、SPOCK2水平的比較 在線GEPIA數(shù)據(jù)庫對426例卵巢癌組織和88例正常對照組織中SLPI和SPOCK2表達(dá)水平進(jìn)行比較,卵巢癌組織中SLPI和SPOCK2蛋白水平均高于正常對照組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。卵巢癌組血清SLPI、SPOCK2水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.038、2.203,均P<0.05),見表1。

表1 2組間血清SLPI、SPOCK2水平比較

注:*P<0.05。

2.2SLPI、SPOCK2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 SLPI、SPOCK2的陽性表達(dá)率在不同F(xiàn)IGO分期、腫瘤分化程度、有/無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及有/無腹水的卵巢癌患者間進(jìn)行比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而SLPI、SPOCK2的陽性表達(dá)率在不同年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小(以腫瘤最大徑表示)以及病理類型的患者間比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 SLPI、SPOCK2表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)分析

2.3SLPI、SPOCK2表達(dá)與卵巢癌患者生存關(guān)系分析 Kaplan-Meier法對數(shù)據(jù)庫中的424例卵巢癌患者的生存分析顯示,隨著SLPI和SPOCK2水平的增加,患者的生存率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SLPI和SPOCK2的危險率(HR)分別為1.4和1.5(HR大于1為疾病的危險因素),提示SLPI和SPOCK2高表達(dá)是卵巢癌患者不良預(yù)后的危險因素。見圖2。

注:Low SLPI TPM表示SLPI低表達(dá),High SLPI TPM表示SLPI高表達(dá); Low SPOCK2 TPM表示SPOCK2低表達(dá),High SPOCK2 TPM表示SPOCK2高表達(dá)。

2.4多因素Logistic回歸模型分析影響卵巢癌患者不良預(yù)后的危險因素 以卵巢癌患者的治療結(jié)局為因變量(1=復(fù)發(fā),0=無復(fù)發(fā)),進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示:FIGO分期Ⅲ+Ⅳ期、腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水、SLPI陽性表達(dá)、SPOCK2陽性表達(dá)是卵巢癌患者不良預(yù)后的危險因素(均P<0.05),見表3。根據(jù)Logistic回歸模型分析結(jié)果,構(gòu)建卵巢癌不良預(yù)后風(fēng)險預(yù)測模型:Z=-2.926+1.549X1+1.928X2+1.066X3+1.353X4+1.674X5+2.015X6,其中,X1為FIGO分期,X2為分化程度,X3為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,X4為腹水,X5為SLPI陽性,X6為SPOCK2陽性。變量賦值情況見表4。

表3 多因素Logistic回歸模型分析影響卵巢癌不良預(yù)后的危險因素

表4 變量賦值情況

2.5卵巢癌不良預(yù)后風(fēng)險預(yù)測模型診斷效能 使用ROC曲線對卵巢癌不良預(yù)后的預(yù)測效能進(jìn)行評估,曲線下面積(AUC)為0.817(95%CI:0.703～0.901,P<0.001),以Youden指數(shù)最大值(0.727)為最佳臨界點,模型靈敏度為0.852,特異度為0.875,提示該模型對卵巢癌不良預(yù)后預(yù)測效果較好。見圖3。

圖3 卵巢癌不良預(yù)后風(fēng)險預(yù)測模型的ROC曲線

3 討 論

卵巢癌是一種細(xì)胞形態(tài)、臨床表現(xiàn)和遺傳背景均有不同特征的異質(zhì)性疾病,臨床多采用手術(shù)、化療和放療等治療方案,但因卵巢癌具有高復(fù)發(fā)率和多藥耐藥性,患者5年生存率較低[6]。基于此,尋找相關(guān)的生物標(biāo)記物用于卵巢癌患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的預(yù)測,可為卵巢癌的個體化治療方案提供有價值的科學(xué)依據(jù)。SLPI在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá),且與腫瘤患者的不良預(yù)后關(guān)系密切[7-9]。SLPI作為促癌因子,通過Elk-1信號通路調(diào)控MMP-2/9的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲,誘導(dǎo)了胃癌的發(fā)生、發(fā)展[10]。最新研究表明,耐藥性卵巢癌細(xì)胞株中SLPI表達(dá)上調(diào),過表達(dá)SLPI基因抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長[11]。細(xì)胞實驗證實,SLPI基因過表達(dá)促進(jìn)SKOV3細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白PCNA和Cyclin D1的表達(dá),或者抑制胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)、凋亡正相關(guān)蛋白BAX、Cleaved Caspase-9的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖[12]。

通過在線GEPIA數(shù)據(jù)庫對426例卵巢癌組織和88例正常對照組織中SLPI表達(dá)進(jìn)行分析比較,除個別SLPI表達(dá)過高或過低離散點(由卵巢癌患者個體差異因素造成)外,卵巢癌組織和正常對照組織標(biāo)本中的表達(dá)水平明顯聚集于兩個不同平均值附近,而且卵巢癌組織中SLPI平均表達(dá)水平顯著高于正常對照組織。但GEPIA在線網(wǎng)站并未提供426例卵巢癌組織中SLPI水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系,然而在實際診療過程中,存在卵巢癌患者臨床病理特征不一致、臨床治療方式也不一致的情況,為了明確SLPI表達(dá)水平與卵巢癌臨床特征性的相關(guān)性,彌補GEPIA在線網(wǎng)站的不足之處,筆者對本研究入組的67例卵巢癌患者血清中SLPI表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理特征(包含年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、FIGO分期、病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腹水等特征)細(xì)分后,進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。研究發(fā)現(xiàn),卵巢癌患者血清中SLPI水平明顯高于正常對照組,且FIGO分期Ⅲ+Ⅳ期的卵巢癌患者,腫瘤低分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腹水的卵巢癌患者,血清中SLPI水平顯著高于FIGO分期Ⅰ+Ⅱ期、腫瘤中高分化及沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和沒有腹水的卵巢癌患者。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示,隨著SLPI表達(dá)水平的增加,患者的生存率顯著降低,且SLPI的危險率(HR)為1.4,提示SLPI水平升高是卵巢癌患者不良預(yù)后的重要風(fēng)險因素。SLPI參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展,可能與SLPI通過保護(hù)顆粒蛋白前體免受降解,促進(jìn)Cyclin D等的表達(dá)及抑制抗細(xì)胞增殖因子IGFBP-3的表達(dá),激活NF-κB促進(jìn)血管發(fā)生密切相關(guān),以上數(shù)據(jù)充分表明,SLPI是一種潛在卵巢癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)與總生存率評估的重要生物學(xué)指標(biāo)。已有研究證實,腦膠質(zhì)瘤中SPOCK2基因上調(diào)表達(dá)可通過與其家族成員SPOCK1及SPOCK3結(jié)合,解除SPOCK1及SPOCK3對MMP2的抑制作用,由此消除其他SPOCK家族成員對MT-MMPs的失活作用,導(dǎo)致ECM重塑,進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲,該研究提示SPOCK2對細(xì)胞侵襲性的影響是通過與其家族其他成員相互作用實現(xiàn)的[13-14]。另一研究證實,乳腺癌細(xì)胞中SPOCK2的mRNA高表達(dá)與腦轉(zhuǎn)移具有很強的相關(guān)性[15]。本研究中,通過在線GEPIA數(shù)據(jù)庫分析,除個別SPOCK2表達(dá)過高或過低離散點(由卵巢癌患者個體差異因素造成)外,卵巢癌組和正常對照組內(nèi)標(biāo)本明顯聚集于兩個不同平均值附近,且卵巢癌組織中SPOCK2平均表達(dá)水平顯著高于正常對照組織。進(jìn)一步,為了明確SPOCK2表達(dá)水平與卵巢癌臨床特征性的相關(guān)性,彌補GEPIA數(shù)據(jù)庫的不足之處,我們對本研究入組的67例卵巢癌患者血清中SPOCK2表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理特征(包含年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、FIGO分期、病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腹水等特征)細(xì)分后,進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。研究發(fā)現(xiàn),血清中SPOCK2水平在不同患者的FIGO分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹水中具有顯著差異性,提示SPOCK2基因與卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴散密切相關(guān)。生存曲線分析表明,隨著SPOCK2表達(dá)水平的增加,卵巢癌患者的生存率降低,SPOCK2的危險率(HR)為1.5,提示SPOCK2水平升高是卵巢癌患者不良預(yù)后的重要風(fēng)險因素。分析原因可能是SPOCK2具有調(diào)控卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)基因的功能,SPOCK2基因?qū)е履[瘤細(xì)胞遷移微環(huán)境的改變,進(jìn)而造成病情的進(jìn)展。以上數(shù)據(jù)表明,SPOCK2是另外一種卵巢癌患者潛在的病情監(jiān)測及判斷預(yù)后的評價指標(biāo)。多因素Logistic回歸模型對卵巢癌預(yù)后的危險因素進(jìn)行分析,結(jié)果顯示血清SLPI、SPOCK2高表達(dá)是卵巢癌復(fù)發(fā)與不良預(yù)后的獨立危險因素,與FIGO Ⅲ+Ⅳ期、腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹水等因素一起構(gòu)成卵巢癌不良預(yù)后風(fēng)險預(yù)測模型。使用ROC曲線對模型的預(yù)測能力進(jìn)行評估,AUC為0.817(95%CI:0.703～0.901,P<0.05),以Youden指數(shù)最大值(0.727)為最佳臨界點,該模型靈敏度為0.852,特異度為0.875,提示該模型對卵巢癌不良預(yù)后預(yù)測效果較好。綜上所述,卵巢癌患者血清中SLPI和SPOCK2陽性表達(dá),能夠成為FIGO分期,腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水等臨床病理特征的有力補充,由此構(gòu)建卵巢癌風(fēng)險預(yù)測模型具有良好的評估效果,進(jìn)而對卵巢癌的治療方案進(jìn)行個體化指導(dǎo),提高預(yù)后質(zhì)量,因此具有重要的臨床應(yīng)用價值。