王鈺佳，李婉玉，蔡雨晨，張凌晶，翁凌，孫樂常，曹敏杰

(集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)是淡水魚中的代表性魚類，由于其生命力強，分布地域廣，是常用的研究對象[1-2]。魚死后的生化變化直接影響魚肉的品質(zhì)和價值，而由內(nèi)源酶引起的魚肉蛋白質(zhì)降解是導(dǎo)致魚肉質(zhì)構(gòu)軟化的主要原因[3]。特別是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteases，MMP)由于可以降解膠原蛋白，對肌肉軟化起著重要的作用。因此，研究其內(nèi)源性抑制劑對于揭示魚死后肌肉質(zhì)構(gòu)變化規(guī)律有重要意義[4]。

MMP是一種含鋅、鈣依賴性的內(nèi)肽酶，它負(fù)責(zé)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，參與胚胎發(fā)育、器官形態(tài)發(fā)生、骨重塑等許多生物學(xué)過程。在魚類中，MMP在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用。在MMP中，MMP-2(EC 3.4.24.24)和MMP-9(EC 3.4.24.35)因與明膠降解有關(guān)，被歸類為明膠酶[5-6]。在不同魚類中已經(jīng)檢測到明膠酶的存在，如太平洋巖魚(Sebastessp.)[7]、魚(Seriolaquinqueradiata)[8]、大西洋鱈魚(Gadusmorhua)、花狼魚(Anarhichasminor)和大西洋鮭魚(Salmosalar)等[9]。明膠酶被認(rèn)為參與了膠原蛋白的代謝，使肌肉纖維蛋白降解，導(dǎo)致魚體軟化[10]。在生物體內(nèi)，MMP的活性受內(nèi)源性抑制劑的調(diào)控，如組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloprotease,TIMPs)、α2-巨球蛋白、肝素和反轉(zhuǎn)錄富含半胱氨酸蛋白(reversion inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs,RECK)等[11]。

蛋白質(zhì)的功能通常是通過蛋白質(zhì)之間的相互作用來調(diào)節(jié)的，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的解析為分析酶相互作用及催化機理提供了研究基礎(chǔ)。對部分MMP與TIMPs晶體結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，TIMPs直接與MMP活性位點的催化區(qū)域的Zn2+結(jié)合，從而抑制酶的活性[12-13]。然而，由于一些MMP的晶體結(jié)構(gòu)難以獲得，因此它們與抑制劑的相互作用及抑制機理研究甚少。近年來，由于生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，對已知序列進(jìn)行三維建模獲得其結(jié)構(gòu)的方法已非常成熟，在探究分子間相互作用方面也已廣泛使用，為一些難以獲得晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的研究提供了新方法，這些方法也被用于解釋酶和抑制劑的相互作用關(guān)系及抑制機理[14-15]。

與哺乳動物MMP的研究相比，魚類MMP的研究還相當(dāng)匱乏，特別是對MMP內(nèi)源性抑制劑的研究則更少。因此，本研究利用分子生物學(xué)手段，在大腸桿菌中克隆并表達(dá)了相對分子質(zhì)量為37 ku的鰱魚MMP-2催化結(jié)構(gòu)域(rHm-MMP-2c)，利用此酶進(jìn)一步從鰱魚肌肉中篩選分離了一種對rHm-MMP-2c有抑制作用的蛋白質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)為載脂蛋白A-I(Apo A-I)。為探究Apo A-I與rHm-MMP-2c的相互作用機理，對這2個蛋白質(zhì)同源建模并進(jìn)行分子對接，探究其相互作用方式，為研究MMP-2及其抑制劑提供了一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鰱魚購于福建省廈門市集美區(qū)菜市場(2～3 kg/條)，即殺后取肌肉放置于冰上，立即用于實驗。

分子克隆所用引物均在廈門博瑞生物科技有限公司合成；U-Clone Master Mix，美國Evomic公司；表達(dá)載體pET30a(+)-V29H(V29H)，美國EMD生物科學(xué)公司；合成熒光底物Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap (Dnp)-Ala-Arg-NH2(MOCA)，日本Peptide Institute公司；TEV酶，美國Sigma公司；Ni-NTA親和柱、DEAE-Sepharose和Phenyl Sepharose，美國GE Healthcare產(chǎn)品；鰱魚I型膠原蛋白，集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院實驗室制備；其他試劑均為分析級。

1.2 實驗方法

1.2.1 rHm-MMP-2c的克隆及表達(dá)

RNA提取步驟參考總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，cDNA按PrimeScript TM Ⅱ 1st Strand cDNA合成試劑盒說明書合成。利用DNAMAN軟件設(shè)計引物5’-CGAGAATCTTTATTTCCAAGGTTCTGTCGACAAGCCCAAGTGGGGACAGAAAAAC-3’和5’-AGTTAGCTTGCGGCCGCAGAGTCGACACCATACAG

CTCCTGGATGCCTTTAA-3’(引物均含有SalI酶切位點)。構(gòu)建鰱魚MMP-2催化結(jié)構(gòu)域克隆載體，將測序正確的質(zhì)粒和V29H載體質(zhì)粒分別用SalⅠ單酶切處理，用U-Clone Master Mix將截斷的rHm-MMP-2c基因片段和線性化的質(zhì)粒V29H在50 ℃下連接1 h，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中篩選陽性菌并測序，測序正確的質(zhì)粒命名為V29H-rHm-MMP-2c。重組蛋白表達(dá)方法參考文獻(xiàn)[16]，利用SDS-PAGE和明膠酶譜檢測表達(dá)結(jié)果，用Lowry法測定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2 rHm-MMP-2c抑制劑的純化

將新鮮的鰱魚敲擊致死后，取肌肉150 g，加入8倍體積的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH=8.0，用組織搗碎機搗碎，在12 000 r/min下離心20 min并用絹布過濾。上清液60 ℃加熱30 min，在冰上冷卻至室溫后再次離心，上清液用50%～90%的硫酸銨分級沉淀，用上述緩沖液溶解沉淀并充分透析，透析后體積為40～50 mL。將透析后的樣品依次上樣于DEAE-Sepharose陰離子交換柱和Phenyl Sepharose層析柱(5 mL)，測定A280值和抑制活性，收集有抑制活性部分進(jìn)行電泳分析。

1.2.3 抑制劑的質(zhì)譜分析

純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，將樣品在凝膠狀態(tài)下用測序級胰蛋白酶酶解后，用串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(5800 MALDI-TOF/TOF,AB SCIEX)進(jìn)行分析。質(zhì)譜條件：激光源為335 nm的Nd:YAG激光器，加速電壓為2 000 V，掃描范圍為800～4 000 u。選擇信噪比大于50的母離子進(jìn)行二次質(zhì)譜(MS/MS)分析，二次質(zhì)譜(MS/MS)激光疊加2 500次。

1.2.4 rHm-MMP-2c酶活力測定

rHm-MMP-2c酶活力測定采用Nagase[17]描述的方法并略加修改，在900 μL的20 mmol/L Tris-HCl(含1 mmol/L Ca2+、1 μmol/L Zn2+、pH= 8.0)(buffer A)中加入50 μL rHm-MMP-2c和50 μL的10 μmol/L合成熒光底物MOCA，在37 ℃下反應(yīng)30 min后，加入1.5 mL終止液(V(甲醇)∶V(異丙醇)∶V(蒸餾水)=35∶30∶35)終止反應(yīng)。在激發(fā)波長為328 nm、發(fā)射波長為393 nm下測定反應(yīng)釋放的Mca-Pro-Leu-Gly熒光強度。酶活力單位(U)定義為每分鐘釋放1 nmol Mca-Pro-Leu-Gly所需的酶量。

1.2.5 抑制劑對rHm-MMP-2c的抑制酶活力測定

將800 μL buffer A、50 μL rHm-MMP-2c(3 μmol/L)和100 μL(3 μmol/L)抑制劑混勻，在4 ℃下孵育30 min后加入10 μmol/L合成熒光底物MOCA，于37 ℃下反應(yīng)30 min，加入1.5 mL終止液終止反應(yīng)，在激發(fā)波長為328 nm、發(fā)射波長為393 nm下測定反應(yīng)釋放的Mca-Pro-Leu-Gly熒光強度，抑制率=(1-A/B)×100%，式中：A為實驗組的熒光吸收值；B為對照組的熒光吸收值。

1.2.6 抑制劑對rHm-MMP-2c的抑制動力學(xué)分析

根據(jù)節(jié)1.2.5活性測定方法測定內(nèi)源性抑制劑的抑制活性，分別測定抑制劑濃度為0,3,5,10 μmol/L的rHm-MMP-2c的活性(rHm-MMP-2c濃度為0,3,6,10 μmol/L)，并計算反應(yīng)初速率，分析抑制劑對MMP-2的抑制類型。參考陳清西[18]的方法進(jìn)行抑制動力學(xué)分析，根據(jù)所得數(shù)據(jù)計算半抑制濃度(IC50)。

1.2.7 抑制劑對rHm-MMP-2c降解I型膠原的抑制作用分析

rHm-MMP-2c可有效降解膠原蛋白，為探究抑制劑(Apo A-I)的抑制作用，將純化的rHm-MMP-2c與I型膠原蛋白在4 ℃下進(jìn)行孵育。反應(yīng)系統(tǒng)總量為150 μL，由50 μL I型膠原蛋白(40 μg)、50 μL rHm-MMP-2c(20 ng)和50 μL buffer A(含或不含20 ng Apo A-I)組成，分別在4 ℃孵育0,24,48,72,96 h。陽性對照為50 μL I型膠原、50 μL rHm-MMP-2c、50 μL buffer A(含10 mmol/L EDTA)。陰性對照為50 μL I型膠原蛋白和100 μL buffer A。在4 ℃下孵育96 h，取樣進(jìn)行電泳分析。

1.2.8 分子對接

分子對接是一種研究蛋白質(zhì)與配體相互作用的有效方法[19]。根據(jù)人MMP-2(PDB:1AV1)的晶體結(jié)構(gòu)，用Swissmodel(https://swissmodel.expasy.org/)三維建模獲得了不同物種魚類的MMP-2c的結(jié)構(gòu)。用I-TASSER服務(wù)器(http://hdl.handle.net/1808/12854)預(yù)測Apo A-I的結(jié)構(gòu)[20]。MOCA的三維結(jié)構(gòu)在Chem3D Ultra(8.0)中繪制得到。用Autodock Vina(1.1.3)進(jìn)行來自不同物種的MMP-2c與熒光底物MOCA的分子對接。rHm-MMP-2c與Apo A-I的對接使用ZDOCK服務(wù)器(http://zdock.umassmed.edu/)完成。結(jié)合力、結(jié)合能和結(jié)合位點的結(jié)果用PDBePISA(https://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html)和Discovery Studio(2019)處理。

1.3 統(tǒng)計分析

本文中所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并進(jìn)行誤差分析。制圖及排版在PowerPoint 2019和Adobe Illustrator CS5上完成。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 rHm-MMP-2c的分子克隆

從NCBI(GenBank:KR822184.1)中獲得鰱魚MMP-2的全長cDNA序列(2 792 bp)，通過DNAMAN(8.0)分析得到，其編碼332個氨基酸殘基的催化結(jié)構(gòu)域(MMP-2c)，設(shè)計引物進(jìn)行克隆，預(yù)測相對分子質(zhì)量為37.3 ku，pI為4.38。BLASTp分析結(jié)果顯示，鰱魚MMP-2與草魚(Ctenopharyngodonidella)MMP-2同源性為98%(GenBank:ADU34084.1)，與斑馬魚(Daniorerio)MMP-2同源性為93%(GenBank:AAH76545.1)，與日本海參(Apostichopusjaponicus)MMP-2同源性為92%(GenBank:AYL88763.1)。在rHm-MMP-2c催化結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)了3個纖連蛋白結(jié)構(gòu)域(Fibronectin Ⅱ domain,Fn)。有研究表明，F(xiàn)n區(qū)對MMP-2的催化活性起著至關(guān)重要的作用[21]。另外，MMP-2的Zn2+結(jié)構(gòu)域(ZBG)和位于催化結(jié)構(gòu)中心的序列HFGHXLGLXHS在不同的物種中是保守的，序列中的3個組氨酸殘基與Zn2+結(jié)合密切相關(guān)，對酶活性的維持起著重要的作用[22]。在rHm-MMP-2c中，位于催化結(jié)構(gòu)中心的保守序列為His290到Ser301(HEFGHALGLEHS)，其中3個組氨酸(His290、His294和His300)和ZBG結(jié)合并發(fā)揮催化作用(見圖1)。

2.2 rHm-MMP-2c的原核表達(dá)與鑒定

rHm-MMP-2c在上清液中表達(dá)，由于載體含有可溶標(biāo)簽麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)，需經(jīng)TEV酶酶解切掉MBP才能得到目的蛋白(見圖2a)，用Ni-NTA親和層析柱即可除去MBP[23]。純化得到目的蛋白rHm-MMP-2c，其相對分子質(zhì)量為37 ku(見圖2b的第6泳道)，與理論值37.3 ku一致。明膠酶譜驗證了酶的活性(見圖2b的第7泳道)，顯示了其降解明膠的活性。

由于魚肌肉中MMP-2的含量很少，而天然MMP-2的純化又非常困難，因此對MMP-2的研究大多是通過對其進(jìn)行克隆和表達(dá)來進(jìn)行的[24]。此前，Wang等[25]對鯉魚MMP-2的催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了克隆和表達(dá)。然而，鯉魚MMP-2的催化結(jié)構(gòu)域表達(dá)在沉淀中進(jìn)行，復(fù)性過程繁瑣復(fù)雜，不利于大量純化和應(yīng)用。在本研究中，rHm-MMP-2c可以在上清液中高效表達(dá)并有活性，易于分離純化，有利于篩選其內(nèi)源性抑制劑。

2.3 rHm-MMP-2c抑制劑的純化

為除掉樣品中大部分雜蛋白質(zhì)，對鰱魚肌肉樣品60 ℃加熱后進(jìn)行50%～90%硫酸銨鹽析，根據(jù)目標(biāo)蛋白的特性采用柱層析純化。預(yù)處理后的樣品經(jīng)透析后上樣于DEAE-Sepharose陰離子交換柱，活性峰出現(xiàn)在0～0.2 mol/L的NaCl階段洗脫處，如圖3a所示，抑制酶活力呈單一峰型，收集活性部分進(jìn)行下一步層析。當(dāng)硫酸銨濃度為2 mol/L時，樣品能有效吸附在Phenyl-Sepharose疏水層析柱上，降低鹽濃度可以將目的蛋白洗脫下來。由圖3b可以看出，大部分的雜蛋白在流洗部分被除去，目的蛋白在硫酸銨濃度為0.5 mol/L左右被洗脫下來，抑制酶活性峰與蛋白質(zhì)峰一致。收集具有抑制活性部分，用buffer A透析后保存，進(jìn)行電泳處理及后續(xù)抑制活性測定。2次柱層析之后，抑制劑已經(jīng)被高度純化，得到相對分子質(zhì)量為28 ku的單一蛋白質(zhì)條帶(見圖3c的泳道4)。

2.4 rHm-MMP-2c抑制劑的質(zhì)譜鑒定

為了獲得抑制劑的一級結(jié)構(gòu)信息，對蛋白質(zhì)進(jìn)行了質(zhì)譜分析。選擇信噪比大于50的肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，二級質(zhì)譜分析結(jié)果如圖4a所示，共得到11個含有146個氨基酸殘基的多肽(見表1)。將質(zhì)譜/質(zhì)譜分析結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較(見圖4b)，得到的序列與鰱魚的Apo A-I序列(gi|295314922)相似性為100%，證明純化后的蛋白質(zhì)為Apo A-I。Apo A-I是一種主要的載脂蛋白，可以參與機體內(nèi)脂蛋白的代謝，維持正常血脂代謝的平衡[26-27]。本研究獲得的Apo A-I相對分子質(zhì)量為28 ku，與鯉魚中純化的Apo A-I(27.5 ku)一致。研究表明，在虹鱒魚、大西洋鮭、日本鰻鱺、紅鰭東方鲀等硬骨魚中發(fā)現(xiàn)有2個亞型Apo A-I，這些不同亞型的出現(xiàn)可能是由于一些特征譜系的硬骨魚類和鰩鰭魚類進(jìn)化中全基因組復(fù)制導(dǎo)致，而Apo A-I的許多亞型在不同的組織中有不同的調(diào)節(jié)方式[28-29]。

表1 二級質(zhì)譜所得抑制劑的肽段序列Tab.1 Peptide sequences of inhibitor obtained from MS/MS起止位點Start-end sites肽段序列Peptide sequences22-32 DEAPSQLDHVK33-43 TALQLYLDQMK60-78 DYKEFLGQSVDNLHGYFEK79-98 AFETITPVGAQVLEATAPQR111-120 QIEPMRAELR126-146 HOEEYTEELKPFVDDYMV167-175 IGPNWEETK189-196 VTEYLQDVKVR197-213 TKLEPTIQEYKDQMEK231-244 MTDLGEQVKPHFEK246-251 FEAVQK

2.5 Apo A-I對rHm-MMP-2c降解I型膠原的抑制

將鰱魚I型膠原和rHm-MMP-2c置于4 ℃孵育96 h，檢測冷藏時酶對I型膠原蛋白的降解情況，結(jié)果顯示，酶能消化I型膠原蛋白的β鏈、α1鏈和α2鏈(見圖5泳道1～5)。金屬蛋白酶抑制劑EDTA可完全抑制rHm-MMP-2c的酶活性(見圖5泳道8)。在Apo A-I存在下，rHm-MMP-2c對I型膠原蛋白的降解被抑制70%(見圖5泳道6)。Apo A-I對rHm-MMP-2c的抑制力較EDTA弱，主要原因可能是其分子量大，但這也證明了Apo A-I可以有效抑制由該酶引起的膠原蛋白在4 ℃下的降解。

魚肉冷藏過程中膠原蛋白的降解是其軟化的重要原因，而膠原蛋白的降解與魚體內(nèi)存在的內(nèi)源酶密切相關(guān)[30]。有研究表明，在魚死后的冷藏過程中都能檢測到MMP活性，MMP對膠原蛋白的降解作用是導(dǎo)致魚類肌肉在冷藏過程中軟化的主要原因[31]。本研究表明，在冷藏過程中，rHm-MMP-2c對I型膠原蛋白有降解作用，而Apo A-I作為內(nèi)源性抑制劑可以在一定程度上抑制其降解進(jìn)程。

2.6 Apo A-I對rHm-MMP-2c的抑制動力學(xué)

抑制動力學(xué)研究可以闡釋抑制劑與酶的相互作用機制。如圖6a所示，不同濃度的Apo A-I對不同濃度rHm-MMP-2c的抑制曲線均交于原點，表明Apo A-I對rHm-MMP-2c的抑制是可逆的。利用不同濃度的抑制劑Apo A-I、底物MOCA與rHm-MMP-2c測定反應(yīng)初速率，以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，初速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，根據(jù)曲線的交點可知其抑制類型。如圖6b所示，不同濃度的線性回歸曲線交于Y軸的正半軸，表現(xiàn)為競爭抑制，即不改變酶的最大反應(yīng)速度vm，酶的Km隨著抑制劑濃度的增加而增加。用二次作圖法求出雙倒數(shù)圖的斜率，計算得出Apo A-I的抑制常數(shù)Ki為1.31 μmol/L。

根據(jù)rHm-MMP-2c抑制活性檢測方法，測定不同濃度的特異性抑制劑Apo A-I對rHm-MMP-2c的抑制率。如圖6c所示，以不同濃度的Apo A-I(0,3,5,10 μmol/L)為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，計算出Apo A-I對rHm-MMP-2c的半抑制濃度(IC50)為3.33 μmol/L。Sarker等[32]從人類血清中發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白原是MMP-2的反競爭抑制劑，其與MMP-2之間的IC50為6.76 μmol/L。而Apo A-I的IC50值與之相比更小，說明Apo A-I對rHm-MMP-2c的抑制作用優(yōu)于纖維蛋白原。

2.7 分子對接

分子對接可以直觀地展示rHm-MMP2c-MOCA體系和rHm-MMP2c-Apo A-I體系之間的結(jié)合方式。rHm-MMP-2c-MOCA體系對接的結(jié)合自由能為-36 kJ/mol，rHm-MMP2c-Apo A-I體系最佳對接結(jié)果的自由能為-49.4 kJ/mol，這表明，Apo A-I與rHm-MMP2c的結(jié)合比MOCA更強，親和力更高。

為了探究MOCA與不同物種MMP-2催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位置，由NCBI檢索可知，草魚(Ctenopharyngodonidella)、斑馬魚(Daniorerio)、日本海參(Apostichopusjaponicus)與鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)的序列相似性均在92%以上，用人(Homosapiens)MMP-2c的晶體結(jié)構(gòu)(PDB:1EAK)為模板對MMP-2c進(jìn)行建模后，采用Autodock vina(1.1.3)對酶和底物進(jìn)行分子對接。將不同物種MMP-2c與MOCA的對接結(jié)果進(jìn)行疊加發(fā)現(xiàn)，鰱魚MMP-2c(Hm-MMP-2c)與MOCA的對接位置與其他3種不同，Hm-MMP-2c與MOCA的結(jié)合位點位于其催化腔的催化區(qū)域(見圖7a)。從圖7b中可以看到，Gly76、Leu78、Tyr282、Ala309、Pro310、Tyr312可以與MOCA形成氫鍵，維持整個體系的穩(wěn)定性。在鰱魚中，與MOCA相互作用的殘基來自催化結(jié)構(gòu)域和ZBG區(qū)域，而其他3種魚的MMP-2c則通過Fn結(jié)合區(qū)域與MOCA結(jié)合。以草魚MMP-2c(Ci-MMP-2c)和MOCA為例(見圖7c)，位于Fn區(qū)域的Gly227和Asp94分別與MOCA形成氫鍵，而Glu162、Asp188、Ser189等Fn區(qū)域的殘基和MOCA主要以范德華力為主。由鰱魚、草魚MMP-2c與MOCA的對接結(jié)果可知，雖然酶的一級、二級結(jié)構(gòu)相似，但它們與同一底物的結(jié)合可能存在較大差異。對比rHm-MMP-2c與Apo A-I對接的結(jié)果，該抑制劑主要通過氫鍵作用于rHm-MMP-2c的Fn區(qū)，包括Asp75、Leu78、Leu286、His300、Glu302、Ile311、Tyr312、Thr313、Lys316、Leu77、His290和Val287(見圖7e)。Apo A-I與rHm-MMP-2c在MOCA結(jié)合的催化區(qū)域發(fā)生相互作用，以往的報道表明，催化腔內(nèi)的殘基在抑制劑結(jié)合中發(fā)揮重要作用[33]。可以推測，Apo A-I形成的空間位阻堵住了底物的入口，從而抑制了rHm-MMP-2c的活性。

3 結(jié)論

本研究以鰱魚為對象，在大腸桿菌中高效表達(dá)并純化了MMP-2的催化結(jié)構(gòu)域(rHm-MMP-2c)。以rHm-MMP-2c為靶標(biāo)，從鰱魚肌肉中篩選并純化了一種內(nèi)源性抑制劑，質(zhì)譜分析鑒定為載脂蛋白A-I(Apo A-I)。Apo A-I為rHm-MMP-2c的競爭型抑制劑，其抑制常數(shù)(Ki)為1.31 μmol/L，半抑制濃度(IC50)為3.33 μmol/L。rHm-MMP-2c在4 ℃時降解I型膠原蛋白，Apo A-I的加入可有效抑制其降解速率。分子對接結(jié)果表明，Apo A-I和rHm-MMP-2c主要以氫鍵相互作用為主，Apo A-I形成的空間位阻阻礙了底物與酶催化活性中心接近，從而抑制酶的活性。