李永健，姚翠鸞

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

大黃魚(Larimichthyscrocea)主要分布于我國東南沿海，是我國海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖量最大的經(jīng)濟(jì)魚類。然而，病害頻發(fā)已經(jīng)成為制約大黃魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要瓶頸之一[1-2]。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類重要的先天性模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)，通過識(shí)別包括來自細(xì)菌、真菌及病毒等病原體中的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖(peptidoglycan，PGN)、鞭毛蛋白(flagellin)、多聚核苷酸(Poly I:C，CpG-DNA)等共有的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMPs)，激活宿主下游免疫信號(hào)傳導(dǎo)通路及炎癥反應(yīng)[3]。典型TLR家族成員的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包括胞外富含亮氨酸(leucine rich repeats，LRR)的結(jié)構(gòu)域(主要識(shí)別不同病原的PAMPs)、一個(gè)跨膜區(qū)(transmembrane region，TM)，以及一個(gè)胞內(nèi)的Toll/白細(xì)胞介素-1受體(Toll/Il-1Receptor，TIR)結(jié)構(gòu)域。TLRs激活后可招募胞內(nèi)的接頭蛋白及信號(hào)分子，通過MyD88(myeloid differentiation primary response gene 88)依賴或MyD88非依賴途徑，向下游進(jìn)行免疫信號(hào)傳遞[4]。

迄今為止，已經(jīng)在人類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了10種不同的TLR，在小鼠中發(fā)現(xiàn)了13種[5]。根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、進(jìn)化關(guān)系及它們識(shí)別的PAMPs配體，將TLR分為TLR1、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR11等6個(gè)亞家族[6]。其中TLR1、TLR4、TLR5亞家族成員主要分布在細(xì)胞膜上，主要識(shí)別細(xì)菌、真菌產(chǎn)生的脂肽、脂多糖、肽聚糖等PAMPs[7-9]。TLR3、TLR7、TLR11亞家族成員主要存在于內(nèi)體膜上[10]，通過識(shí)別病毒、細(xì)菌等病原體的雙鏈及單鏈RNA或CpG DNA激活免疫[11]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)魚類存在20余種TLRs，雖然其多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于哺乳動(dòng)物，但是對(duì)其序列及結(jié)構(gòu)分析表明，它們也分屬于哺乳動(dòng)物的6個(gè)TLR亞家族[12]。

TLR1亞家族主要識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖和脂肽，在抗細(xì)菌免疫中發(fā)揮重要作用。哺乳動(dòng)物TLR1亞家族的主要成員包括TLR1、TLR2、TLR6和TLR10[13]。但是，魚類TLR1亞家族包括TLR1、TLR2、TLR14、TLR18、TLR25[14]和TLR28[15]，提示來自魚類的TLR可能與哺乳動(dòng)物存在較大差異。

TLR25是近年來在魚類中發(fā)現(xiàn)的TLR1亞家族的新成員，目前，已經(jīng)在達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)[16]、齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[17]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[18]中得到鑒定。研究表明，這些魚類的TLR25均具有典型TLR分子的三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。在免疫反應(yīng)中，達(dá)氏鱘的TLR25可以被LPS、Poly I:C刺激所誘導(dǎo)[16]；齊口裂腹魚的TLR25主要存在于細(xì)胞質(zhì)，可能參與識(shí)別LPS與Poly I:C[18]；而脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、脂磷壁酸質(zhì)(Lipoteichoic acid，LTA)和酵母聚糖能夠顯著誘導(dǎo)尼羅羅非魚TLR25的表達(dá)上調(diào)[17]。在尼羅羅非魚中發(fā)現(xiàn)兩種類型的TLR25，其中截短的TLR25可以誘導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子和I型干擾素(IFN-I)的表達(dá)[18]，提示不同魚類的TLR25可能存在較大差異，它們?cè)隰~類的免疫反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用。但是，作為一種重要的經(jīng)濟(jì)魚類，大黃魚TLR25的序列尚未得到鑒定，它在大黃魚免疫反應(yīng)中的功能，也尚未見報(bào)道。

本研究擬克隆一個(gè)大黃魚TLR25的cDNA，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并在此基礎(chǔ)上，研究其在大黃魚不同組織及免疫刺激后在大黃魚腎細(xì)胞(LCK)中的時(shí)空表達(dá)特征，為深入了解大黃魚TLR25在免疫反應(yīng)中的作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚、細(xì)胞系及免疫刺激

大黃魚(體重(300±25.6)g，體長(24±3)cm)購自福建寧德，取樣前馴養(yǎng)1周。取4尾大黃魚，解剖取出肌肉、脾臟、胃、腸、血液、頭腎、鰓、肝臟、腎臟、皮膚、心臟和大腦等12種組織或器官(n= 4)，迅速置于液氮中凍存，并保存于-80 °C超低溫冰箱中，用于總RNA提取。

大黃魚LCK細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存。采用含有10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胎牛血清及1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))雙抗的MEM培養(yǎng)基，在28 ℃下培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后，用胰酶將其消化并傳代至6孔板，細(xì)胞量約為2×106ind/孔，待細(xì)胞貼壁程度達(dá)到80 %以上后，分別用溶于PBS的LPS(50 μg/mL)與Poly I:C(20 μg/mL)進(jìn)行刺激，刺激后6、12、24、48 h分別取樣。對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)加入等體積PBS(0.01 mol/L，pH=6.8)。每個(gè)樣本設(shè)置3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)及3個(gè)平行重復(fù)(n=3)。取樣前先使用滅菌PBS洗滌細(xì)胞1～2次，洗滌后于冰上加入RNA裂解液裂解，吹勻后吸出，用于RNA提取。

1.2 RNA提取及cDNA合成

從-80 °C保存的大黃魚12種組織及收集的LCK細(xì)胞中提取總RNA，具體操作參照廠家說明書(Eastep? Super Total RNA，Promega)。

分別以上述總RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript?II 1st Strand cDNA，諾唯贊)制備cDNA模板，每個(gè)反應(yīng)使用1 μg總RNA，所制備的cDNA用于后續(xù)的LcTLR25 cDNA的克隆與熒光定量PCR(qPCR)分析。

1.3 LcTLR25基因的克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中預(yù)測(cè)的TLR25(XM_010729650.3)序列信息，設(shè)計(jì)大黃魚TLR25特異性引物L(fēng)cTLR25-F、LcTLR25-R(見表1)。以健康大黃魚各個(gè)組織混合的cDNA為模板擴(kuò)增LcTLR25編碼區(qū)序列。PCR體系為：ddH2O 12.2 μL、5×PCR buffer 4 μL、dNTP mix 1.6 μL、LcTLR25-F 0.5 μL、LcTLR25-R 0.5 μL、各組織混合的cDNA模板1 μL、高保真Taq酶0.2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋鹤冃?8 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 90 s(55個(gè)循環(huán))；72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物條帶。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物Tab.1 The primers used in this study

使用膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit，OMEGA)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收?；厥债a(chǎn)物用于連接至pMD19-T線性載體(Promega)，連接體系為：純化后PCR產(chǎn)物4.5 μL、Solution I 5 μL、PMD-19-T線性載體0.5 μL。連接條件為16 ℃水浴12 h。連接后載體經(jīng)轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞后，挑單克隆培養(yǎng)及菌液PCR檢測(cè)，檢測(cè)出的陽性菌液送至廈門鉑瑞測(cè)序公司測(cè)序。

1.4 序列及結(jié)構(gòu)分析

使用NCBI網(wǎng)站中BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源比對(duì)、相似性分析及氨基酸序列預(yù)測(cè)；氨基酸序列的多重比對(duì)使用Clustomega(http://www.clustal.org/omega/)進(jìn)行；分子量、等電點(diǎn)等使用EXPASY(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)；保守的結(jié)構(gòu)域及其功能在SMART網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de)進(jìn)行分析；亞細(xì)胞定位在BUSCA(http://busca.biocomp.unibo.it/)網(wǎng)站進(jìn)行在線分析。

1.5 進(jìn)化樹的構(gòu)建

在NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇來自其他物種TLR1亞家族成員TLR1、TLR2、TLR18、TLR14、TLR25的氨基酸序列及部分其他TLR家族成員的氨基酸序列。使用MEGA X軟件(https://www.megasoftware.net/)對(duì)相關(guān)基因序列進(jìn)行鄰位相接法(NJ method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，用Bootstrap法評(píng)估1000次。

1.6 定量PCR檢測(cè)LcTLR25轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化

采用qPCR檢測(cè)LcTLR25在肌肉、脾臟、胃、腸、血液、頭腎、鰓、肝臟、腎臟、皮膚、心臟和大腦等組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，以及LPS或Poly I:C刺激后LcTLR25在LCK細(xì)胞系中的表達(dá)變化。用LcTLR25的特異性引物qTLR25-F和qTLR25-R，并以β-actin為內(nèi)參，擴(kuò)增目的基因。qPCR反應(yīng)體系為：2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，正反向特異性引物各0.4 μL，模板2 μL，ddH2O補(bǔ)齊20 μL。qRT-PCR程序反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s(40個(gè)循環(huán))；60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。實(shí)驗(yàn)方法參照諾唯贊ChamQTM Universal SYBR? qPCR Master Mix 說明書。目的基因表達(dá)的相對(duì)定量參照2-ΔΔCT方法確定[19]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用軟件GraphPad Prism 8對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本差異顯著性分析(Student’sttest)，并做圖。差異顯著性水平為P<0.05，差異極顯著性水平為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 LcTLR25基因的cDNA序列

利用基因特異性引物L(fēng)cTLR25-F和LcTLR25-R擴(kuò)增后獲得約2868 bp特異性單一條帶，測(cè)序后對(duì)序列進(jìn)行BLASTX分析。結(jié)果顯示該序列與尼羅羅非魚的TLR25同源性最高(80.43%)，與其他魚類TLR25同源性約64.09%～67.66%，推測(cè)本研究所獲得的為大黃魚TLR25基因序列。

通過SMART在線分析推測(cè)大黃魚及其他硬骨魚TLR25的保守功能域，結(jié)果見表2。預(yù)測(cè)的LcTLR25蛋白質(zhì)包括5個(gè)胞外的LRR，分別位于82—105 aa、111—133 aa、205—228 aa、229—250 aa、262—313 aa(LRR CT)；一個(gè)跨膜區(qū)，位于315—337 aa；一個(gè)典型的胞內(nèi)TIR同源域，位于371—521 aa(見圖1，表2)。與其他魚類的TLR25相比，大黃魚LRR數(shù)量較少，其TLR25氨基酸起始序列對(duì)應(yīng)其他硬骨魚TLR25序列約278—291 aa處(表2中虛線表示)。

注：ATG為起始密碼子，TAG為終止密碼子；首尾大寫斜體部分表示序列克隆所用引物位置；灰色底紋部分氨基酸序列分別表示5個(gè)LRR，其中前4個(gè)灰色底紋部分表示LRR(82—105 aa、111—133 aa、205—228 aa及229—250 aa)，灰色底紋加下劃線為LRR_CT(262—313 aa)；下劃線部分表示跨膜結(jié)構(gòu)域(315—337 aa)；方框及灰色底紋序列為TIR結(jié)構(gòu)域(371—521 aa)。Notes:The start codon (ATG) and the stop codon(TAG) are capitalized,capital italic section indicate the position of primers used for sequence cloning,the amino acid sequence in gray shadows indicate the LRRs(82—105 aa,111—133 aa,205—228aa,229—250 aa and 262—313 aa) and the underlined sequence is emphasized as LRR_CT,transmembrane domain (315—337 aa) is underlined,sequence in gray box is the TIR domain (371—521 aa).圖1 大黃魚TLR25基因的編碼區(qū)Fig.1 The cDNA sequences and deduced amino acid sequences of LcTLR25

表2 與不同硬骨魚TLR25結(jié)構(gòu)域的比較Tab.2 Comparison of the predicted conserved domains of TLR25 from different teleost

序列分析表明，該序列包含699 bp的5’非翻譯區(qū)(UTR)、564 bp的3’ UTR、1605 bp的完整開放讀碼框(ORF)，起始密碼子為“ATG”，終止密碼子為“TAG”，編碼534個(gè)氨基酸(見圖1)。Expasy預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量為61.09 kD，理論等電點(diǎn)(pI)為8.35；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)LcTLR25定位于細(xì)胞膜。

2.2 序列一致性分析

2.3 進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明(見圖2)，從大黃魚中擴(kuò)增得到的LcTLR25與來自其他魚類的TLR25聚為一支，其中與同樣來自鱸形目(Perciformes)的尼羅羅非魚的TLR25顯示出較近的親緣關(guān)系；TLR1亞家族的其他成員分別聚類到其相應(yīng)的分支；而其他TLRs亞家族成員也分別聚類到其相應(yīng)的分支。

注：達(dá)氏鱘(Acipenser dabryanus)TLR21、TLR22和TLR25引自文獻(xiàn)[16]，尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)TLR25引自文獻(xiàn)[18])。Notes:The TLR21,TLR22,and TLR25 sequence of Dabry’s Sturgeon was from reference [16],and the TLR25 sequence of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) was from reference [18]).圖2 大黃魚TLR25基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree produced using the neighbor-joining algorithm

2.4 大黃魚TLR25的組織表達(dá)譜

通過qPCR方法在大黃魚12個(gè)組織(腦、鰓、心臟、頭腎、腎臟、胃、腸、肝臟、脾臟、皮、肌肉、血液)中檢測(cè)了LcTLR25基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。結(jié)果表明，LcTLR25在腸、肌肉、心臟、血液、腦、脾臟、腎臟及頭腎中均有表達(dá)。其中：在腸組織中的表達(dá)量最高；其次為肌肉、心臟、血細(xì)胞和腦組織；在頭腎及腎臟組織中的表達(dá)量較低；而在胃、肝臟、鰓及皮膚中未檢測(cè)到其表達(dá)(CT值>35)(結(jié)果見圖3)。

2.5 大黃魚TLR25的刺激表達(dá)譜

LCK細(xì)胞經(jīng)LPS、Poly I:C刺激后，qPCR檢測(cè)結(jié)果表明：LcTLR25基因表達(dá)水平在LPS刺激后6 h時(shí)極顯著上調(diào)(P<0.01)并達(dá)到最大值，約為對(duì)照組表達(dá)水平的3.1倍；隨后逐漸下降，但是在刺激后12 h時(shí)LcTLR25表達(dá)水平仍然顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，約為對(duì)照組的2.3倍；但刺激后24 h及48 h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平。

在Poly I:C刺激后6 h時(shí)，LcTLR25表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，大約為對(duì)照組的70 %；隨后逐漸增加，在刺激后24 h時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，約為對(duì)照組的1.5倍；但是在刺激后48 h時(shí)，恢復(fù)至對(duì)照組水平。

3 討論

本研究克隆到2868 bp的大黃魚TLR25基因cDNA序列，其開放閱讀框1605 bp，編碼534個(gè)氨基酸。BLASTN及多重比對(duì)結(jié)果顯示大黃魚TLR25堿基序列與尼羅羅非魚TLR25具有最高的序列同源性。氨基酸序列分析及蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)顯示LcTLR25具有5個(gè)典型的亮氨酸重復(fù)LRRs，1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，并具有1個(gè)典型的TIR結(jié)構(gòu)域(見圖1)，提示其屬于典型的TLR家族。大黃魚TLR25與魚類TLR25分子氨基酸序列一致性約64%～77%。來自尼羅羅非魚、達(dá)氏鱘、草魚等的TLR25大多包含815～852個(gè)氨基酸，具有6～9個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域(見表2)。

LcTLR25包含較短的ORF，僅編碼534個(gè)氨基酸，與其他魚類TLR25相比，LcTLR25缺少了N端2～3個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域(見表2)。這是由于本實(shí)驗(yàn)克隆到的LcTLR25 cDNA在697—699 bp處由大多數(shù)魚類TLR25中的“TGG”突變?yōu)?“TGA”，造成翻譯終止，下一個(gè)密碼子700—702 bp處的“AAA”變?yōu)椤癆TG”，造成了翻譯起始位點(diǎn)后移，因此導(dǎo)致大黃魚的TLR25編碼區(qū)較短。在魚類的進(jìn)化過程中，由于基因組倍增及演化，導(dǎo)致了其基因型的多樣性。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)魚類的許多功能基因存在不同基因型或者多種剪接體[21]。與其他物種相比，這種較短的LcTLR25基因可能是選擇及進(jìn)化的結(jié)果[22-23]，這也可能導(dǎo)致了魚類TLR比哺乳動(dòng)物更為豐富多樣。進(jìn)化分析表明，LcTLR25與其他魚類的TLR25聚為一支，并與其他成員一起聚為硬骨魚的TLR1家族(見圖2)，說明本研究獲得的序列可能為魚類保守的TLR25，也分屬于TLR1亞家族。

組織表達(dá)分析顯示，大黃魚TLR25在腸組織中表達(dá)量最高，其次是肌肉和腦(見圖3)。齊口裂腹魚TLR25在腦中表達(dá)量最高[16]，鯉魚TLR25在肌肉中表達(dá)量最高[24]，與本研究結(jié)果相似。但是尼羅羅非魚TLR25在脾臟組織中表達(dá)量較高[17]，說明不同魚類TLR25的組織表達(dá)水平可能存在差異，也有可能與魚的生理狀態(tài)有關(guān)。推測(cè)大黃魚TLR25基因可能在腸道內(nèi)具有重要功能。

大黃魚腎臟細(xì)胞中的LcTLR25能夠被LPS顯著誘導(dǎo)(見圖4)。Qi等[16]研究發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚TLR25的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平可以被LPS、LTA和酵母聚糖顯著誘導(dǎo)[17]；另外達(dá)氏鱘、齊口裂腹魚的TLR25也表現(xiàn)出相似的研究結(jié)果[16-17]。TLR1亞家族主要識(shí)別來自細(xì)菌的PAMPs[25]，LPS作為一種內(nèi)毒素，能夠誘導(dǎo)多種TLR及其下游關(guān)鍵因子的表達(dá)增加[26]，提示LcTLR25可能參與LPS誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。經(jīng)Poly I:C刺激后，LcTLR25在刺激早期表達(dá)下調(diào)；然而在達(dá)氏鱘、齊口裂腹魚及尼羅羅非魚中，Poly I:C刺激均可誘導(dǎo)TLR25的表達(dá)上調(diào)[16-18]。這有可能與LcTLR25包含較少的LRR有關(guān)，也有可能是由于不同類型的細(xì)胞導(dǎo)致，詳細(xì)機(jī)制還有待于深入研究。

綜上所述；本實(shí)驗(yàn)克隆獲得的大黃魚TLR25基因，包含典型的TLRs家族結(jié)構(gòu)域，為硬骨魚類特有的TLR1家族成員；LcTLR25在大黃魚腸組織中表達(dá)量最高；LPS可顯著誘導(dǎo)LcTLR25表達(dá)上調(diào)，但是Poly I:C不能誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)，提示LcTLR25可能更多參與LPS誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。