凌娜，徐貴國(guó)，李瑋璐，劉小瑞

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076）

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）是一種極端嗜鹽、無(wú)細(xì)胞壁、營(yíng)光合自養(yǎng)的單細(xì)胞真核綠藻。藻體富含β-胡蘿卜素、甘油、多糖、蛋白質(zhì)素等多種活性物質(zhì)，常作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚(yú)、蝦、貝類(lèi)幼體的餌料[1,2]。銅是細(xì)胞內(nèi)多種酶的活性中心，如質(zhì)體藍(lán)素、銅/鋅超氧化物歧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、抗壞血酸氧化酶、多酚氧化酶等，參與細(xì)胞中光合作用的電子傳遞、葉綠素、維生素以及蛋白質(zhì)和碳水化合物的生物合成，是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的微量元素。銅缺乏會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞生長(zhǎng)受抑，光合作用和呼吸作用速率降低；但銅過(guò)量也會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng)，如生長(zhǎng)不良、光合作用受抑制，嚴(yán)重時(shí)甚至死亡[3,4]。

采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）可以獲得特定條件或狀態(tài)下細(xì)胞中全部的轉(zhuǎn)錄本，揭示生物體中一些特殊的生物學(xué)現(xiàn)象及其發(fā)生機(jī)制；分析表達(dá)基因差異可從整體上詮釋基因的結(jié)構(gòu)與功能[5]。RNA-Seq 已廣泛應(yīng)用于植物、動(dòng)物以及人的各種生理、病理?xiàng)l件下RNA 的測(cè)序和分析[6-8]，在植物或藻類(lèi)中篩查出大量的脅迫導(dǎo)致的差異表達(dá)基因，對(duì)這些差異基因進(jìn)行功能注釋和代謝通路分析，可探究植物或藻類(lèi)響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)理[9-12]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)也應(yīng)用于杜氏鹽藻的測(cè)序和分析中。劉軍立等[13]用RNA-Seq 技術(shù)篩查出了杜氏鹽藻中與淀粉和脂質(zhì)代謝路徑相關(guān)的關(guān)鍵酶，如磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶、淀粉磷酸化酶、乙酰輔酶A 羧化酶等。朱立強(qiáng)等[14]對(duì)杜氏鹽藻全轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序和功能注釋分析，建立了該藻的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。高鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，杜氏鹽藻細(xì)胞內(nèi)與光合作用、碳固定和血紅素生物合成、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、剪接體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和內(nèi)吞作用以及淀粉的降解、甘油的合成等相關(guān)的基因顯著上調(diào)[15,16]。

鹽藻對(duì)銅脅迫的反應(yīng)是一個(gè)極其復(fù)雜的生理過(guò)程，不僅引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生理學(xué)的變化，還能導(dǎo)致細(xì)胞中多個(gè)基因和信號(hào)通路的改變。本研究基于Illumina HiSeq2500 技術(shù)平臺(tái)，探討在銅脅迫下杜氏鹽藻的轉(zhuǎn)錄本在不同信號(hào)途徑上的表達(dá)，篩查銅脅迫下的差異表達(dá)基因，并注釋這些基因的功能和聚類(lèi)分析，深度挖掘銅脅迫下杜氏鹽藻中與光合作用相關(guān)的基因的表達(dá)，為揭示鹽藻銅處理下正常的生物學(xué)現(xiàn)象和銅耐受的機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）來(lái)源于寧波大學(xué)海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，采用f/2 培養(yǎng)基，在（24±1）℃，pH 7～8，光強(qiáng)54～90 μmol/（m2·s），光暗周期12h∶12h 下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)正常f/2 培養(yǎng)基培養(yǎng)的對(duì)照組和銅處理組。前期銅對(duì)鹽藻生長(zhǎng)72 h 的EC50為9.55 mg/L[17]，選擇與1/2 EC50相當(dāng)?shù)? mg/L CuCl2作為銅處理組，培養(yǎng)72 h，每組3 次重復(fù)。

1.2 杜氏鹽藻無(wú)參轉(zhuǎn)錄組的構(gòu)建

1.2.1 RNA 提取及樣品檢測(cè)

培養(yǎng)完成時(shí)收集鹽藻細(xì)胞，采用Invitrogen 公司的Trizol 試劑盒提取藻細(xì)胞中總RNA，然后檢測(cè)提取的RNA 樣品濃度、純度和長(zhǎng)度等質(zhì)量，確保符合文庫(kù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 文庫(kù)構(gòu)建

質(zhì)檢合格后，用帶有Oligo（dT）磁珠富集真核生物的mRNA，然后加入裂解緩沖液，將mRNA 消化成150～200 nt 的短片段；以短片段mRNA 為模板，用6 堿基隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，然后合成cDNA 第二鏈，并利用試劑盒純化雙鏈cDNA；純化后的cDNA 進(jìn)行黏性末端修復(fù)，隨后在cDNA的3'-端加上poly-A 并連接接頭，最后選擇片段大小和PCR 擴(kuò)增構(gòu)建cDNA 文庫(kù)。

1.2.3 文庫(kù)質(zhì)檢

構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測(cè)片段大小，ABI StepOnePlus Real-Time PCR System定量文庫(kù)濃度。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析

1.3.1 上機(jī)測(cè)序及數(shù)據(jù)質(zhì)控

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析委托成都生命基線有限公司和上海美吉有限公司完成。采用Illumina HiSeqTM2500 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，得到的原始數(shù)據(jù)參照公司標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)控，獲得可用于后續(xù)分析的高質(zhì)量clean reads。Clean reads 經(jīng)Trinity 軟件de novo 組裝，過(guò)濾掉低質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄本，獲得transcript可用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄本注釋和定量分析等。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄本功能注釋

將組裝得到的轉(zhuǎn)錄本與6 大功能性數(shù)據(jù)庫(kù)（NR、GO、COG、KEGG、Pfam 和Swiss-Prot）比對(duì)進(jìn)行基因注釋?zhuān)瑥恼w水平評(píng)估轉(zhuǎn)錄本組裝的完整性；同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本的SNP 和SSR 結(jié)構(gòu)。

1.3.3 差異表達(dá)基因分析

基因在轉(zhuǎn)錄本水平表達(dá)的高低是其豐度的直接反應(yīng)，采用DEGseq 軟件（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DEGseq.html）篩 選 出正常培養(yǎng)及銅脅迫條件下不同樣本中表達(dá)量顯著變化的基因，對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO 和KEGG Pathway 富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

通過(guò)Illumina HiSeq2500 對(duì)對(duì)照組和銅處理組鹽藻的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序和組裝，篩除冗余序列和短片段后獲得的cleans reads 中分別獲得57 093 個(gè)transcripts 和41 418 個(gè)unigenes。大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度分布在200～1 000 bp。Transcript 和unigene 的N50和GC 含量分別為2 306 bp、56.19%和2 118 bp、57.23%。表明測(cè)序質(zhì)量較高，轉(zhuǎn)錄本適合后續(xù)注釋分析。

2.2 功能注釋

對(duì)照組與銅處理組鹽藻細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的所有unigene 與NR、GO、COG、KEGG、Swiss-Prot 和InterPro 幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比和功能注釋。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有36 422 個(gè)unigenes 注釋到這幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，其中NR、COG、KEGG、Swiss-Prot 和InterPro 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)上的unigenes 分別有22 204、19 524、15 345、12 136 和18 016 個(gè)，重疊區(qū)域共有unigene 7 605 個(gè)（圖1）。

圖1 功能注釋韋恩圖Fig.1 Venn diagram of functional annotation

2.3 物種同源性比對(duì)

在NR 數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)獲得的unigene 的同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，注釋的unigene 與變異小球藻（Chlorella variabilis）、胸狀盤(pán)藻（Gonium pectorale）、長(zhǎng)棘卷尾藻（Volvox carteri f.nagariensis）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtli）、亞橢圓球藻C-169（Coccomyxa subellipsoidea C-169）、原鞘小球藻（Auxenochlorella protothecoides）的同源性較高，分別達(dá)到25.60%、14.02%、12.02%、10.42%、7.29%和7.08%；與綠色杜氏藻（Dunaliella viridis）和杜氏鹽藻（Dunaliella salina）的相似性僅為1.42%和0.92%（圖2）。原因可能是在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中鹽藻的全基因組序列和注釋信息尚不全面，有很多unigene 沒(méi)有被比對(duì)上，導(dǎo)致同源性比對(duì)時(shí)同物種的相似性較低。

圖2 物種同源性比對(duì)Fig.2 Homology comparison of species

2.4 COG 注釋

基于COG 功能注釋?zhuān)?9 524 個(gè)unigene 主要參與代謝、細(xì)胞過(guò)程及信號(hào)、信息的儲(chǔ)存與加工及其他4 個(gè)大類(lèi)，又被細(xì)分為22 個(gè)類(lèi)別，其中最豐富的類(lèi)群是“翻譯后修飾、蛋白折疊、伴侶（1 418）”、“翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源（862）”、“復(fù)制、重組和修復(fù)（841）”、“胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和液泡運(yùn)輸（836）”、“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（760）”和“轉(zhuǎn)錄（594）”。另外，還參與糖類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換、無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的unigene 分別為585、563、509、429、359、286。尚有10009 個(gè)unigene 功能未知（表1）。

表1 COG 功能注釋Tab.1 COG functional annotation

2.5 差異表達(dá)基因聚類(lèi)分析

采用DESeq2 軟件對(duì)獲得的基因/轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選條件為Padjust<0.05，|log2FC|≥1。結(jié)果在銅處理組和正常培養(yǎng)組的鹽藻細(xì)胞中共篩選出3 799 個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中表達(dá)上調(diào)的基因?yàn)? 350 個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因?yàn)? 499 個(gè)（圖3-A）。根據(jù)FPKM 值進(jìn)行表達(dá)模式聚類(lèi)分析，紅色代表unigene 在樣本中表達(dá)量較高，藍(lán)色表示表達(dá)量較低。圖3-B 為3 799 個(gè)差異表達(dá)基因熱圖分析，其中基因結(jié)構(gòu)和功能相似的基因聚為一類(lèi)，這些基因群可能在鹽藻生命活動(dòng)及新陳代謝中發(fā)揮類(lèi)似的功能。

圖3 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)及模式分析Fig.3 Statistics and pattern analysis of differentially expressed genes（DEGs）

2.6 差異表達(dá)基因的GO 富集分析

采用Blast2GO 軟件對(duì)銅處理后的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析，發(fā)現(xiàn)有1 719 個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）富集到GO 的三個(gè)類(lèi)別。在生物學(xué)進(jìn)程（Biologcial process，BP）中，差異表達(dá)基因主要富集在DNA 代謝進(jìn)程（DNA metabolic process,194）、細(xì)胞對(duì)脅迫和刺激的響應(yīng)（Cellular response to stress and stimulus，126 和128）、細(xì)胞周期進(jìn)程（Cell cycle process，65）、染色體組織（Chromosome organization，57）、DNA 復(fù)制（DNA replication，45）、有絲分裂細(xì)胞周期進(jìn)程（Mitotic cell cycle process，34）、組蛋白磷酸化（Histone phosphorylation，9）、端粒組織和維持（Telomere organization and maintenance，36）、細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)（Cell cycle checkpoint，21）、結(jié)構(gòu)內(nèi)穩(wěn)態(tài)（Anatomical structure homeostasis，18）。在細(xì)胞組分（Cellular component,CC）中，差異基因主要參與膜組分（Integral component of membrane，812）、質(zhì)體（Plastid，129）、葉綠體（Chloroplast，122）的合成。差異基因的分子功能（Molecular function,MF）主要富集在DNA 結(jié)合（DNA binding，226）、RNA 聚合酶活性（RNA polymerase，28）、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性（Histone methyltransferase activity，43）等（圖4）。

圖4 差異表達(dá)基因的GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

2.7 差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析

將銅處理后的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 富集分析，以P<0.5 為篩選條件，-log10（P-value）和DEGs 數(shù)量為橫坐標(biāo)（圖5）。差異基因顯著富集的途徑為光合作用（Photosynthesis，25）、DNA 復(fù)制（DNA replication，26）、RNA 聚合酶（RNA polymerase，21）、同源重組（Homologous recombination，27）、嘧啶代謝（Pyrimidinemetabolism，39）、嘌呤代謝（Purinemetabolism，39）等，說(shuō)明銅處理主要影響鹽藻細(xì)胞的生長(zhǎng)、遺傳發(fā)育和基礎(chǔ)代謝。

圖5 差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

2.8 與光合作用及糖酵解相關(guān)的差異表達(dá)基因

KEGG 富集分析表明，銅處理顯著誘導(dǎo)了與光合作用及糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)。這些基因主要與光系統(tǒng)膜蛋白復(fù)合物、光合電子傳遞鏈、天線蛋白、碳固定和糖酵解等有關(guān)。在銅處理下PSII 蛋白復(fù)合物編碼基因psbA、psbB、psbC、psbE、psbH、psbM、psbP、psbO、psbZ 以及PSI 蛋白復(fù)合物psaC 表達(dá)上調(diào)。編碼細(xì)胞色素b6/f 復(fù)合物亞基的基因petB 和petC 表達(dá)上調(diào)，而編碼PetH 蛋白的基因表達(dá)下調(diào)。編碼ATP 合成酶α、β 和c 亞基的3 個(gè)基因表達(dá)也上調(diào)。而編碼光捕獲復(fù)合物葉綠素的基因lhca3和lhcb4 表達(dá)上調(diào)，lhca1 和lhcb2 的基因表達(dá)下調(diào)（表2）。這些基因在光合作用電子傳遞和ATP 合成中發(fā)揮重要作用。銅是光合作用中電子傳遞體質(zhì)體藍(lán)素的活性中心，通過(guò)蛋白質(zhì)中銅離子的氧化還原變化來(lái)傳遞電子。本研究結(jié)果表明，適量的銅能顯著激活鹽藻細(xì)胞中PSI-LHCI 超復(fù)合物，加快光合電子傳遞，促進(jìn)鹽藻的生長(zhǎng)和光合作用。

表2 與光合作用及糖酵解相關(guān)的DEGs 表達(dá)Tab.2 Expressions of DEGs related to photosynthesis and glycolysis

銅處理還影響鹽藻細(xì)胞中與碳固定及糖酵解相關(guān)的基因表達(dá)，如編碼核酮糖1,5 二磷酸羧化酶大亞基（RbcL）、轉(zhuǎn)酮醇酶（TktA）、蘋(píng)果酸脫氫酶（Mdh1）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（Gapdh）、磷酸丙糖異構(gòu)酶（Tpi）的基因表達(dá)上調(diào)，而編碼檸檬酸合成酶（Cs）、琥珀酸脫氫酶（Sdh）、丙酮酸激酶（Pyk）的基因表達(dá)下調(diào)（表2）。結(jié)果表明，適量的銅可以促進(jìn)鹽藻細(xì)胞中碳代謝及糖酵解過(guò)程，加速細(xì)胞的碳同化作用。

2.9 與離子轉(zhuǎn)運(yùn)及脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因

植物和藻類(lèi)已經(jīng)進(jìn)化出一個(gè)復(fù)雜的自穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外銅的攝入、運(yùn)輸、分配及銅脅迫響應(yīng)系統(tǒng)。銅的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中有多種蛋白參與，包括銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、金屬伴侶蛋白、P 型ATP 酶等[18]。由表2 可知，編碼銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P1B-型ATPase 的基因copA、copB，鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因zip，及液泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因vps-4 和vps-36 表達(dá)上調(diào)。與ABC 超家族跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因表達(dá)也升高，主要有抗氧化防御系統(tǒng)和熱休克蛋白/分子伴侶。銅脅迫還激活了鹽藻細(xì)胞中抗氧化防御系統(tǒng)及熱休克蛋白網(wǎng)絡(luò)，表現(xiàn)為編碼Cu/Zn-SOD 和過(guò)氧化氫酶Cat 的基因顯著上調(diào)；熱休克蛋白/分子伴侶網(wǎng)絡(luò)中hsp20、hsp33、dnaK 和dnaJC13 的基因顯著上調(diào)，而hsp70、groEL、dnaJC7 和dnaJC11 的基因顯著下調(diào)（表2）。

2.10 基因結(jié)構(gòu)分析

2.10.1 SSR 標(biāo)記分析

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeats，SSR），又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列（simple tandem repeats,STRs）或微衛(wèi)星標(biāo)記（microsatellite），是一類(lèi)由幾個(gè)核苷酸（1～6 個(gè)）為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的重復(fù)序列，廣泛分布于真核生物基因組中，也是目前應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)之一。本研究發(fā)現(xiàn)41 418 條unigene 序列中各種SSR 位點(diǎn)18 097個(gè)，SSR 發(fā)生頻率為43.69%。從SSR 重復(fù)類(lèi)型中發(fā)現(xiàn)，杜氏鹽藻轉(zhuǎn)錄組中出現(xiàn)最多的是三核苷酸重復(fù)，占總SSR 位點(diǎn)數(shù)目的65.64%；其次是單核苷酸重復(fù)和雙核苷酸重復(fù)，分別占總SSR 位點(diǎn)數(shù)量的13.65%和18.68%。在三核苷酸重復(fù)中，AGC/CTG 這種SSR 重復(fù)位點(diǎn)最多，占87.51%；其中重復(fù)次數(shù)為1～5 和6～10 的SSR 位點(diǎn)最多，分別占總SSR 的23.98%和56.78%（圖7）。這些重復(fù)序列可作為杜氏鹽藻獨(dú)特的分子標(biāo)記，用于后續(xù)SSR 引物設(shè)計(jì)、基因定位、譜系分析、親緣關(guān)系鑒定等。

圖7 杜氏鹽藻中SSR 重復(fù)基元的類(lèi)型Fig.7 SSR repeat motifs in green alga Dunaliella salina

2.10.2 SNP 位點(diǎn)分析

單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）指堿基序列上單個(gè)核苷酸的變異，包括轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失，是第三代分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，可用于分析基因功能與表型性狀之間的關(guān)系。目前尚未有關(guān)于杜氏鹽藻SNP 標(biāo)記的相關(guān)報(bào)道。本研究中，杜氏鹽藻轉(zhuǎn)錄組分析共有41 418 條unigene，檢測(cè)到35 282 個(gè)SNP 位點(diǎn)，平均每條unigene 含有0.85 個(gè)SNP 位點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)換22 884 個(gè)（64.86%），顛換12 398 個(gè)（35.14%）。6 種單核苷酸變異中，A-G 和C-T 發(fā)生的頻率最高，分別達(dá)到33.33%和31.52%；其他4 種單核苷變異中，A-C、A-T、C-G 和G-T 的頻率分別為10.47%、7.18%、7.07%和10.42%（圖8）。本研究極大地豐富了杜氏鹽藻SNP 的位點(diǎn)信息，為后續(xù)鹽藻分子遺傳和表型性狀的分析提供一定的參考依據(jù)。

圖8 杜氏鹽藻中SNP 位點(diǎn)分析Fig.8 SNP site analysis in green alga Dunaliella salina

3 討論

銅是植物和藻類(lèi)生長(zhǎng)所必需的一種微量金屬元素，廣泛存在于水體和土壤環(huán)境中，高濃度時(shí)對(duì)水生和陸地生物具有一定的毒性。銅對(duì)杜氏鹽藻的生長(zhǎng)、光合色素的合成、蛋白質(zhì)和多糖的含量等均有一定的影響[17]，低濃度下促進(jìn)藻類(lèi)的生長(zhǎng)，高濃度下抑制藻類(lèi)的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出典型的hormesis 效應(yīng)[19,20]。但是，銅脅迫對(duì)杜氏鹽藻基因表達(dá)和信號(hào)通路的影響以及銅的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等機(jī)制目前尚不清楚。

本研究通過(guò)RNA-Seq 技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平探討杜氏鹽藻基因表達(dá)與銅脅迫之間的關(guān)系。從對(duì)照組和銅處理組共得到41 418 個(gè)unigenes，篩選出3 799個(gè)差異表達(dá)基因，其中2 350 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1 449個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。這些差異表達(dá)基因主要富集在光合作用、DNA 復(fù)制、RNA 聚合酶、同源重組等基礎(chǔ)代謝過(guò)程。光合作用中與光系統(tǒng)膜蛋白復(fù)合物、光合電子傳遞鏈、ATP 的合成、碳固定、糖酵解等相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。結(jié)果表明，一定濃度的銅離子可以促進(jìn)鹽藻的生長(zhǎng)和光合作用，而光合作用的增強(qiáng)反過(guò)來(lái)提高鹽藻對(duì)銅的耐受性。

植物和藻類(lèi)細(xì)胞中，銅的同化和運(yùn)輸受到銅轉(zhuǎn)運(yùn)體CTR/COPT 家族的調(diào)控，并通過(guò)P-型ATPase泵入細(xì)胞進(jìn)行跨膜運(yùn)輸[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，銅處理可特異性地激活一系列編碼銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體、液泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、抗氧化防御系統(tǒng)及熱休克蛋白超家族基因的表達(dá)。結(jié)果表明，銅可以通過(guò)銅轉(zhuǎn)運(yùn)體或伴侶轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，然后轉(zhuǎn)移到葉綠體中的質(zhì)體藍(lán)素，最終導(dǎo)致光合作用和碳代謝的增強(qiáng)。另一方面，細(xì)胞中過(guò)量的銅可以通過(guò)液泡轉(zhuǎn)運(yùn)體被泵入或泵出細(xì)胞。

本研究與其他類(lèi)似的研究報(bào)道結(jié)果一致。Beauvais-Flück 等[21]報(bào)道，在10-6mol/L 銅環(huán)境下暴露2 h 后，萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和伊樂(lè)藻（Elodea nuttallii）共有1 397 個(gè)和1 258 個(gè)基因差異表達(dá)。這些基因主要參與能量代謝、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞過(guò)程、應(yīng)激、抗氧化代謝和發(fā)育等。氧化戊糖磷酸途徑、硝酸鹽代謝和金屬處理等代謝過(guò)程僅在伊樂(lè)藻中被發(fā)現(xiàn)，而細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、多胺代謝、線粒體電子傳遞和三羧酸循環(huán)等為萊茵衣藻所特有。銅和H2O2脅迫處理可誘導(dǎo)褐藻長(zhǎng)囊水云（Ectocarpus siliculosus）發(fā)生氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為激活oxylipin 信號(hào)通路，抑制肌醇信號(hào)通路。銅脅迫特異性地激活了一系列編碼ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、P1B 型ATP 酶、ROS 解毒系統(tǒng)等基因的表達(dá)，誘導(dǎo)游離脂肪酸含量的增加[22]。另有研究發(fā)現(xiàn)，杜氏鹽藻通過(guò)提高光合作用、碳固定、蛋白質(zhì)合成等基因的表達(dá)增強(qiáng)其耐鹽性[16]。

與此同時(shí)，預(yù)測(cè)和鑒定差異基因功能時(shí)，發(fā)現(xiàn)僅有55.04%的基因有明確的功能注釋信息，尚有39.04%的差異基因功能未知。杜氏鹽藻基因組信息尚未完全解析，提示這些未知基因可能是新基因，它們?cè)邴}藻銅耐受方面可能發(fā)揮重要作用。這方面有待于進(jìn)一步的挖掘和探討。課題組計(jì)劃在下一步實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)杜氏鹽藻中與銅脅迫相關(guān)的路徑如光合作用、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化應(yīng)激、逆境脅迫等相關(guān)的基因和代謝通路進(jìn)行深入的挖掘和剖析，并進(jìn)行基因表達(dá)分析和功能驗(yàn)證，明確銅脅迫對(duì)杜氏鹽藻的生長(zhǎng)及代謝活動(dòng)的影響。本研究結(jié)果可為深入的探索和挖掘新基因、揭示新基因的功能以及鹽藻銅耐受機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。