向 前 韓玉超 李 閃

結(jié)直腸癌(CRC)是高發(fā)于結(jié)直腸內(nèi)的消化道常見(jiàn)惡性腫瘤[1]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,在個(gè)體遺傳易感性的基礎(chǔ)上,由行為因素、環(huán)境以及生活方式等多種因素共同導(dǎo)致的結(jié)果[2-4]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)是真核細(xì)胞周期重要調(diào)控因子,可與細(xì)胞周期蛋白的結(jié)合驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程[5]。白細(xì)胞介素-33(IL-33)屬于白細(xì)胞介素-1家族,與多種消化道惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[6]。既往研究表明,基因表達(dá)差異、慢性炎癥狀態(tài)與CRC腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移以及侵襲密切相關(guān)[7-8]。但目前臨床上關(guān)于CRC患者癌組織中CDK1、IL-33表達(dá)是否于不同組織中存在差異,且差異是否會(huì)影響CRC腫瘤惡性生物學(xué)行為臨床研究較少。基于此,本文特探討CRC患者癌組織中CDK1、IL-33表達(dá)與腫瘤惡性生物學(xué)行為的關(guān)系,以其明確CDK1、IL-33表達(dá)與腫瘤惡性生物學(xué)行為關(guān)系,為CRC診斷及治療提供新思路,報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2019年6月于我院進(jìn)行就診的CRC患者66例的病理組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn):①病理組織確診為CRC[9];②臨床資料完整;③接受手術(shù)治療前未進(jìn)行CRC相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并內(nèi)分泌疾病;②合并其他惡性腫瘤;③患者精神異常。另選取66例患者中癌旁組織(距離癌組織邊緣最短距離>5 cm)37例。

1.2 方法

研究標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定液(北京康佳宏原生物科技有限公司)固定、石蠟包埋、4 μm厚度連續(xù)切片。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行染色,石蠟切片后依次放入二甲苯[國(guó)藥錦奇(上海)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)]中進(jìn)行脫蠟,梯度無(wú)水乙醇水化(福州邁新公司生產(chǎn)),加3%雙氧水(H2O2,福州邁新公司生產(chǎn))溶液以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,再用磷酸緩沖鹽溶液(PBS,福州邁新公司生產(chǎn))沖洗三遍,每次3 min,用濾紙吸干切片組織周?chē)鶳BS,加入一抗(CDK1抗體、IL-33抗體,紐普生物生產(chǎn)),讓抗體充分將組織進(jìn)行無(wú)氣泡覆蓋,置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜,次日拿出放置于室溫下進(jìn)行復(fù)溫1 h,甩去一抗,PBS流動(dòng)沖洗三遍,每次3 min。甩干PBS后,擦干組織,加入二抗(快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物,紐普生物生產(chǎn)),讓抗體充分將組織進(jìn)行無(wú)氣泡覆蓋,放于濕盒內(nèi)20 min,PBS流動(dòng)沖洗三遍,每次3 min。滴加DAB染色液(蒸餾水0.85 mL,依次加入A、B、C液各50 μl,充分進(jìn)行混勻,福州邁新公司生產(chǎn)),使組織被充分覆蓋,放于顯微鏡下觀察顯色反應(yīng),顯色反應(yīng)完成后用自來(lái)水沖洗組織1 min,將切片置入蘇木精染液(上海恒遠(yuǎn)生物生產(chǎn))2 min,自來(lái)水沖洗30 s;放入1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒,再放入流水下沖洗30 s;氨水返藍(lán)30 s,再用流水沖洗30 s,再將切片依次放入95%酒精-無(wú)水乙醇-二苯甲各5 min,進(jìn)行脫水封片。胞質(zhì)和(或)胞核中發(fā)現(xiàn)棕黃色或者黃褐色顆粒則表示細(xì)胞染色陽(yáng)性,再于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取高倍視野(400倍)觀察每張切片,并計(jì)數(shù)細(xì)胞500個(gè),依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占比不同分為以下五類(lèi)等級(jí):0分,陽(yáng)性細(xì)胞占比<5%;1分,陽(yáng)性細(xì)胞占比5%～25%;2分,陽(yáng)性細(xì)胞占比26%～50%;3分,陽(yáng)性細(xì)胞占比51%～75%;4分,陽(yáng)性細(xì)胞占比76%～100%。根據(jù)著色強(qiáng)度再進(jìn)行半定量判定,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):不著色為0分;著色弱(淡黃色)為1分;中等著色(黃色)為2分;強(qiáng)著色(棕褐色)為3分。免疫反應(yīng)的得分=陽(yáng)性細(xì)胞的占比得分×免疫染色強(qiáng)度得分:陰性表達(dá)兩者乘積為0分,免疫組織化學(xué)反應(yīng)(-);弱陽(yáng)性表達(dá)兩者乘積為1～4分(+),中度陽(yáng)性表達(dá)兩者乘積為5～8分(++),強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)兩者乘積為9～12分(+++)。IL-33抗原陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞胞質(zhì)中觀察到有黃色顆粒,與背景顏色比較,無(wú)色計(jì)0分、淡黃色計(jì)1分、黃顏色計(jì)2分及棕褐色計(jì)3分;陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分:顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)代表性視野計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率,陽(yáng)性表達(dá)率<5%(-,0分)、5%～25%(+,1分)、26%～50% (++,2分)和>50%(+++,3分),本研究中將“-～+”視為低表達(dá),“++～+++”視為高表達(dá)。陰性對(duì)照用PBS標(biāo)本,陽(yáng)性對(duì)照用實(shí)驗(yàn)室已知陽(yáng)性標(biāo)本。

基于上述現(xiàn)狀，提出的改善思路為：在深南大道主輔路匯入點(diǎn)設(shè)置預(yù)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)輔道進(jìn)入交通主路節(jié)點(diǎn)聯(lián)動(dòng)組織，改善城市干道節(jié)點(diǎn)通行能力. 當(dāng)主線預(yù)信號(hào)紅燈亮起時(shí)，輔路的預(yù)信號(hào)綠燈亮起，輔路車(chē)輛可快速進(jìn)入左轉(zhuǎn)、掉頭車(chē)道，避免沖突.

1.3 隨訪

指定一名護(hù)士通過(guò)患者門(mén)診復(fù)診、電話或微信隨訪方式對(duì)患者及其家屬進(jìn)行為期3年隨訪,以掌握患者CRC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及生存情況,隨訪的截止日期為2022年6月,并統(tǒng)計(jì)CRC患者無(wú)進(jìn)展生存期(PFS),其中PFS為患者術(shù)后至第一次發(fā)生CRC疾病進(jìn)展或死亡時(shí)間[10]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

CRC是一種消化道惡性腫瘤,可嚴(yán)重威脅人類(lèi)生存健康,據(jù)近幾年流行病學(xué)調(diào)查資料顯示,其發(fā)病率正呈明顯上升趨勢(shì),且趨于年輕化[11]。其中手術(shù)切除是CRC優(yōu)選的治療方法,術(shù)后患者5年生存率可達(dá)90%以上,但如果合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,患者生存率則會(huì)顯著降低[12-13]。因此,CRC的早期篩查、早期診斷是治療CRC的關(guān)鍵。

2 結(jié)果

2.1 CDK1、IL-33在CRC組織與癌旁組織中表達(dá)差異對(duì)比

軍隊(duì)能執(zhí)行，因?yàn)橐箅m然簡(jiǎn)潔，但抓住了根本，只要簡(jiǎn)單的條款做到了，其他要求也就做到；企業(yè)員工難執(zhí)行，是因?yàn)橐筇嗔?，不一定抓到要害，?guī)定太多，做到這條，違了那條，久而久之，難以堅(jiān)持。

CDK1、IL-33在CRC組織中表達(dá)水平均高于癌旁組織(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 CDK1、IL-33在CRC組織與癌旁組織中表達(dá)差異對(duì)比(例,%)

2.2 CDK1、IL-33表達(dá)與CRC臨床病理特征的關(guān)系

截止2022年6月,CDK1高表達(dá)患者無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)為33.58個(gè)月,短于CDK1低表達(dá)患者35.12個(gè)月(logRankχ2=5.627,P<0.05),IL-33高表達(dá)患者PFS為33.95個(gè)月,短于IL-33低表達(dá)患者35.64個(gè)月(logRankχ2=4.696,P<0.05),見(jiàn)圖1、2。

冰醋酸(CH3COOH)、硝酸(HNO3)、鹽酸(HCl)、氫氧化鉀(KOH)、氫氧化鈉(NaOH)、碳酸鈉(NaCO3)、硝酸鐵(Fe(NO3)3)、鄰苯二甲酸氫鉀(C8H5KO4)、四氯化碳(CCl4)、無(wú)水乙酸銅(Cu2(CH3COO)4)、吡啶(C5H5N)、硫酸銅(CuSO4)、硫酸鉛(PbSO4)均為分析純。

表2 CDK1、IL-33表達(dá)與CRC臨床病理特征的關(guān)系(例,%)

2.3 不同CDK1、IL-33表達(dá)水平患者PFS對(duì)比

低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期高的CRC患者腫瘤組織中CDK1、IL-33表達(dá)水平越高(P<0.05),見(jiàn)表2。

圖1 不同CDK1表達(dá)水平PFS圖

圖2 不同IL-33表達(dá)水平PFS圖

2.4 多因素分析

在66例CRC組織中,CDK1高表達(dá)率為59.09%(39/66),IL-33高表達(dá)率為68.18%(45/66),其中IL-33高表達(dá)同時(shí)CDK1高表達(dá)36例,兩者表達(dá)情況呈正相關(guān)(P<0.05),見(jiàn)表4。

表3 多因素分析

2.5 CDK1與IL-33表達(dá)的相關(guān)性

CDK1高表達(dá)、IL-33高表達(dá)、腫瘤細(xì)胞低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期Ⅲ期均是患者病情進(jìn)展的危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表3。

表4 CDK1表達(dá)與IL-33表達(dá)的相關(guān)性/例

3 討論

應(yīng)用SPSS 22.0版軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料(%),采用卡方檢驗(yàn);相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman秩相關(guān)性檢驗(yàn);P<0.05,數(shù)據(jù)間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用GraphPad Prism5.0軟件、Kaplan-Meier生存曲線分析CDK1、IL-33與CRC患者3年P(guān)FS的相關(guān)性,選用Log-rank法,檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)P<0.05。

本研究顯示,CRC腫瘤細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期中CDK1、IL-33表達(dá)水平存在差異,且腫瘤細(xì)胞低分化、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期越高,腫瘤組織中CDK1、IL-33表達(dá)水平越高,其PFS則相對(duì)較短,說(shuō)明CDK1、IL-33表達(dá)與腫瘤惡性生物學(xué)行為可能存在關(guān)聯(lián)。分析原因可能為:CDK1可調(diào)控真核細(xì)胞有絲分裂細(xì)胞周期G1/S和G2/M期,與CRC的發(fā)生、進(jìn)展以及預(yù)后情況息息相關(guān),在多種腫瘤細(xì)胞中CDK1表達(dá)失調(diào)呈現(xiàn)出過(guò)度表達(dá)狀態(tài),能直接導(dǎo)致人體細(xì)胞周期生理過(guò)程出現(xiàn)紊亂,細(xì)胞分化過(guò)程發(fā)生障礙,促進(jìn)CRC細(xì)胞的惡性增殖與轉(zhuǎn)化[14-15]。而細(xì)胞白介素在機(jī)體免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)與細(xì)胞活化增殖環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用,其中IL-33為白介素家族中主要的促進(jìn)癌變因子,可與其受體蛋白ST2結(jié)合活化核轉(zhuǎn)錄因子κB與促分裂原活化蛋白激酶,以及信號(hào)通路上調(diào)環(huán)氧化酶2分泌和通過(guò)前列腺素E2途徑改變巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與極化,從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,重塑腫瘤微環(huán)境,繼而促進(jìn)CRC侵襲與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[16-17];這均進(jìn)一步提示CDK1、IL-33表達(dá)情況與CRC疾病進(jìn)展密切相關(guān),當(dāng)二者在患者CRC組織中表達(dá)水平上調(diào)時(shí),預(yù)示患者腫瘤組織惡性程度越高,更易轉(zhuǎn)移且易發(fā)生預(yù)后不良,PFS進(jìn)一步縮短[18-19]。

本研究還發(fā)現(xiàn),CDK1與IL-33表達(dá)呈正相關(guān),說(shuō)明CDK1與IL-33表達(dá)相互影響。分析原因可能為,IL-33參與機(jī)體炎癥、感染以及免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)活動(dòng),其可通過(guò)激活過(guò)磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路,有效抑制細(xì)胞線粒體凋亡通路,維持腫瘤細(xì)胞存活機(jī)制,減弱腫瘤細(xì)胞自我凋亡能力,從而促進(jìn)CDK1顯著表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞周期進(jìn)程,使細(xì)胞周期由G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)向異常M期方向推進(jìn),促進(jìn)CRC腫瘤細(xì)胞異常增殖與轉(zhuǎn)化[20]。

鋁土礦中w(SiO2)≥10%，換算得到w(Si)≥4.67%，試液中的硅主要以石英態(tài)和可溶性硅酸鹽形式存在，石英態(tài)形式存在的二氧化硅在鹽酸溶解過(guò)程中不參與反應(yīng)，而以可溶性硅酸鹽形式存在的硅會(huì)與鈣結(jié)合生成不溶性的硅酸鈣，在溶解過(guò)濾過(guò)程中可被有效地去除，因此硅不會(huì)干擾硫酸根的測(cè)定。

綜上,CRC患者癌組織中CDK1、IL-33在CRC組織中存在異常高表達(dá),二者與腫瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān),且二者表達(dá)存在相關(guān)性。