宋素香 徐 琳

子癇前期(preeclampsia,PE)是產(chǎn)科的常見病、多發(fā)病,屬于妊娠期高血壓疾病的一種,具有發(fā)病率高,預后差的特點[1-2]。多發(fā)生于孕周20周左右,表現(xiàn)為高血壓,蛋白尿和水腫。其病理機制多于滋養(yǎng)層細胞的異常侵襲和增殖有關(guān)[3-4]。據(jù)流行病學調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),在全球范圍內(nèi),子癇的發(fā)病率明顯增加,可能與人們的生活習慣,自然和社會的環(huán)境變化有關(guān)[5-6]。但是,目前的治療方案對于PE的治療效果不佳,所以,亟需對其發(fā)病機制進行探索,從而為子癇的治療提供新的靶點。有研究表明,骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)與妊娠期疾病有一定相關(guān)性,比如妊高癥等[7-8]。因此,本研究以BMSCs作為研究對象,以滋養(yǎng)層細胞系JEG-3細胞為種子細胞,提取其外泌體,觀察其對JEG-3細胞學行為的影響。

外泌體(Exosome,Exo)是一類可以攜帶遺傳信息的雙層囊泡結(jié)構(gòu)。外泌體多由細胞分泌,并且通過旁分泌的方式將遺傳信息傳遞至旁系細胞中,進而起到信息交流的作用。尤其在腫瘤細胞中,外泌體的作用甚為重要,因為外泌體可以擺脫細胞之間的局限,進而影響臨近細胞和組織的生物學行為,比如增殖等[9]。在本研究中,通過提取BMSCs來源的外泌體,與滋養(yǎng)層細胞系JEG-3細胞共培養(yǎng),然后利用ERK1/2蛋白抑制劑AZD0364進行干預后,對BMSCs-Exo對滋養(yǎng)層細胞系JEG-3細胞生物學行為的影響,以及對其作用機制進行深入探討。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞和實驗動物

本研究以滋養(yǎng)層細胞系JEG-3細胞為種子細胞,惠贈于上海生物化學與細胞生物學研究所的楊力博士;采購20只SPF級SD大鼠,購自山東省青島市黃島區(qū)實驗動物中心(SCXK(魯)2019-2889)。月齡6～7個月,體重398～412 g。

1.2 BMSCs的培養(yǎng)和鑒定

根據(jù)文獻中的實驗方法[10],取成熟SD大鼠的后腿骨髓組織,然后應(yīng)用差速培養(yǎng)法提取和培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)以備用。采用流式細胞儀檢測方法,檢測BMSCs的表面蛋白CD29和CD44的表達。

1.3 BMSCs來源外泌體的提取和鑒定

1.3.1 外泌體的提取 本研究采用超速離心法進行收集細胞的外泌體。待細胞融合率達80%以上時,棄掉原有上清液,棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌3次,加入2 mL的DMEM培養(yǎng)基,于溫度37 ℃、CO2濃度5%的細胞培養(yǎng)箱中孵育48 h。收集培養(yǎng)液,于4 ℃條件下以300 r·min-1(離心半徑5 cm)離心10 min;轉(zhuǎn)移上清于離心管,于4 ℃條件下以2000 r·min-1(離心半徑5 cm)離心20 min;取上清,經(jīng)0.22 μm過濾器過濾后轉(zhuǎn)移至離心管中,于4 ℃條件下以10 000 r·min-1(離心半徑5 cm)離心70 min;取沉淀,用PBS洗滌1次,于4 ℃條件下以10 000 r·min-1(離心半徑5 cm)離心70 min;小心棄去上清,即得到外泌體沉淀,于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 透射電子顯微鏡法鑒定 在外泌體沉淀中加入100 μL PBS重新懸浮外泌體,并采用馬爾文Nanosight納米顆粒追蹤分析儀分析外泌體粒徑分布。

1.3.3 Western blot法鑒定 采用RIPA裂解液提取總蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,電泳結(jié)束后,轉(zhuǎn)膜封閉一抗(兔抗鼠CD63、CD9、CD81,濃度為1∶10000),4 ℃過夜孵育后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG二抗,室溫避光孵育10 min,于凝膠成像分析系統(tǒng)顯影并拍照。

1.4 滋養(yǎng)層細胞系JEG-3細胞攝取及內(nèi)化外泌體

在外泌體沉淀中加入100 μL PBS重新懸浮外泌體后加入4 μL熒光探針PKH67溶液,于室溫下孵育10 min;加入1 mL的10%BSA溶液進行固定,超速離心法外泌體。將JEG-3細胞接種于預先鋪有蓋玻片的24孔板中,每孔接種300 μL細胞液(細胞濃度約1.0×106個·mL-1),每組接種3個復孔。加入10 μL的鬼筆環(huán)肽,室溫下避光孵育20 min,棄去染色劑,使用PBS洗滌3次,使用4%的多聚甲醛溶液固定30 min;PBS清洗后指甲油封片,于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 細胞分組

根據(jù)實驗?zāi)康?將滋養(yǎng)層細胞系JEG-3細胞分成3組,其中實驗組細胞加入BMSCs來源的外泌體,將提純后的100 μg BMSCs-Exo 與PBS溶液混合后,加入到滋養(yǎng)層細胞系JEG-3細胞中;抑制劑組細胞加入外泌體后,再加入ERK1/2蛋白的抑制劑AZD0364,將AZD0364用PBS溶液稀釋為0.25 mg/mL,將提純后的100 μg BMSCs-Exo 與PBS溶液混合,聯(lián)合0.5 mL的BIXO2188溶劑加入到滋養(yǎng)層細胞系JEG-3細胞中;對照組細胞加入等量的PBS溶液作為對照。

1.6 CCK-8試劑盒檢測細胞的增殖

根據(jù)試劑盒要求,配置各個試劑,將實驗組細胞,抑制劑組細胞和對照組細胞重懸后,接種于96孔板,按照說明書要求設(shè)置對比孔。然后加入CCK-8試劑盒中的檢測試劑,37 ℃恒溫避光孵育15 min,酶標儀測定各組細胞的吸光度(OD值)。

1.7 Transwell 試劑盒檢測細胞侵襲

將實驗組細胞,抑制劑組細胞和對照組細胞重懸后,收集各組細胞,按照Transwell 試劑盒的說明書要求,將各組細胞接種于Transwell侵襲上室,37 ℃恒溫避光孵育2 h,然后更換無血清的培養(yǎng)基,Transwell下室加入含血清的培養(yǎng)基,37 ℃恒溫避光孵育24 h,加入結(jié)晶紫試劑,常溫避光孵育15 min,倒置光學顯微鏡觀察下室細胞數(shù),則為細胞侵襲數(shù)量。

1.8 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測ERK1/2和核因子NF-κB的表達

將實驗組細胞,抑制劑組細胞和對照組細胞重懸后,收集各組細胞,應(yīng)用 Trizol 法提取上述3組細胞中的總RNA,然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA,其目的是可以方便保存,防止降解。采用熒光定量PCR試劑盒分析上述各組細胞中的DNA樣本,Tm值設(shè)置為53.7 ℃,采用2-△△CT法進行分析。引物設(shè)計由上海生工公司設(shè)計并檢測合格(表1)。

表1 ERK1/2和核因子NF-κB的引物序列

1.9 Western-blot檢測ERK1/2和NF-κB的蛋白表達

方法同1.3.3,抗體選擇兔抗鼠ERK1/2和NF-κB一抗。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的培養(yǎng)和鑒定

結(jié)果顯示,原代BMSCs呈多角形,貼壁生長(圖1 A)。P2代BMSCs細胞成長梭形(圖1 B);流式細胞儀檢測細胞表明CD29蛋白表達為99.5%,CD44蛋白表達為100%(圖1 C-D),見圖1。

A為原代BMSCs;B為P2代BMSCs;C-D為BMSCs細胞表面CD29和CD44表達。圖1 骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)和鑒定

2.2 BMSCs來源外泌體的鑒定結(jié)果

透射電子顯微鏡結(jié)果顯示,外泌體為杯口狀結(jié)構(gòu),外泌體直徑150～180 nm。Western Blot可以檢測到外泌體的分子標志物CD63、CD9和CD81的表達。見圖2。

圖2 Western Blot檢測結(jié)果

2.3 滋養(yǎng)層細胞系JEG-3細胞攝取及內(nèi)化PKH67標記的外泌體

結(jié)果顯示,外泌體與JEG-3細胞共培養(yǎng)的過程中,可見JEG-3細胞可以攝取并內(nèi)化PKH67標記的外泌體。

2.4 細胞增殖結(jié)果

應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測外泌體和腫瘤細胞共培養(yǎng)后對細胞增殖水平的作用,結(jié)果顯示,實驗組細胞增殖率明顯高于對照組,而抑制劑組細胞的增殖率明顯低于實驗組(P<0.05)。見圖3。

圖3 細胞增殖結(jié)果

2.5 細胞侵襲能力結(jié)果

結(jié)果顯示,實驗組細胞的侵襲能力明顯強于對照組(P<0.05),抑制劑組細胞的侵襲能力明顯弱于實驗組(P<0.05)。見圖4。

圖4 細胞侵襲能力結(jié)果

2.6 RT-PCR檢測ERK1/2和核因子NF-κB的mRNA的相對表達結(jié)果

結(jié)果顯示,實驗組ERK1/2和NF-κB mRNA相對表達量明顯高于對照組(F=9.897,11.906;P=2.785,2.192;P=0.021,0.014<0.05),抑制劑組ERK1/2和NF-κB mRNA相對表達量明顯低于實驗組(P=2.437,3.908;P=0.013,0.009<0.05),見圖5。

圖5 RT-PCR檢測ERK1/2和核因子NF-κB的mRNA的相對表達結(jié)果

2.7 Western blot檢測ERK1/2和核因子NF-κB的蛋白表達結(jié)果

結(jié)果顯示,對照組、實驗組與抑制劑組的ERK1/2 蛋白表達量比較具有統(tǒng)計學差異(F=9.887,P<0.05),其中實驗組ERK1/2 蛋白表達量明顯高于對照組(P=2.012,P<0.05),抑制劑組ERK1/2 蛋白表達量明顯低于實驗組(P=2.003,P<0.05)。

對照組、實驗組和抑制劑組的NF-κB蛋白表達量比較具有統(tǒng)計學差異(F=9.761,P<0.05),其中實驗組NF-κB 蛋白表達量明顯高于對照組(P=2.4154,P<0.05),抑制劑組NF-κB 蛋白表達量明顯低于實驗組(P=2.007,P<0.05),見圖6。

圖6 Western blot檢測ERK1/2和核因子NF-κB的蛋白表達結(jié)果

3 討論

子癇前期與多種因素密切相關(guān),比如胎盤的過度炎癥反應(yīng)和滋養(yǎng)層細胞的異常增殖和侵襲等[11]。除了特異基因外,也有研究表明,骨髓間充質(zhì)干細胞可以在一定程度上影響子癇前期患者滋養(yǎng)層細胞的侵襲與增殖,但是具體的機制尚未完全明了[12]。本研究通過提取骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體,觀察其對子癇前期患者滋養(yǎng)層細胞的侵襲與增殖能力的影響,以及通過ERK1/2/MAPK信號通路對其具體的作用機制進行深入研究,以期為臨床上子癇前期患者的治療提供新的思路和方法。

外泌體是目前研究的熱點問題,可以攜帶相關(guān)的遺傳信息,從而影響細胞的生化性質(zhì),比如增殖,凋亡和侵襲等[13-14]。本研究通過提取BMSCs來源的外泌體,并且通過外泌體與JEG-3細胞共培養(yǎng)的過程中,可見JEG-3細胞可以攝取并內(nèi)化PKH67標記的外泌體。說明,JEG-3細胞可以內(nèi)吞外泌體,從而發(fā)揮作用。另外我們通過CCK-8試劑盒和Transwell 試劑盒檢測BMSCs來源外泌體對JEG-3細胞增殖和侵襲能力的影響,結(jié)果表明,外泌體與JEG-3細胞共培養(yǎng)后可以促進細胞的增殖能力和侵襲能力,明顯高于對照組,結(jié)果說明,BMSCs來源的外泌體可以促進JEG-3細胞的增殖,促進細胞的侵襲。

MAPK/ERK1/2信號通路是與細胞增殖密切相關(guān)的信號通路之一,ERK1/2信號通路與結(jié)腸癌細胞,肝癌細胞等增殖凋亡關(guān)系密切[15-16]。本研究也以ERK1/2為研究切入點,對BMSCs來源的外泌體促進JEG-3細胞增殖和侵襲進行機制研究,利用RT-PCR和Western blot檢測外泌體和ERK1/2抑制劑AZD0364處理后,細胞共培養(yǎng)體系中ERK1/2 和核因子NF-κB的mRNA和蛋白的表達量,結(jié)果表明,BMSCs來源外泌體與JEG-3細胞共培養(yǎng)后,可以促進ERK1/2和NF-κB的表達量,而經(jīng)過ERK1/2抑制劑AZD0364處理后,ERK1/2和NF-κB的表達量明顯降低。而且,CCK-8和Transwell檢測結(jié)果中,經(jīng)過AZD0364處理后,明顯可以抑制JEG-3細胞的增殖和侵襲水平。結(jié)果表明,ERK1/2信號通路可能是調(diào)控BMSCs來源外泌體促進JEG-3細胞增殖和侵襲的信號通路之一。

然而,本研究也有缺點。比如除了ERK1/2信號通路之外,是否存在其他的信號通路存在,是否有網(wǎng)狀信號通路可以參與調(diào)控外泌體對滋養(yǎng)層細胞的生物學行為的影響,這也是本研究后續(xù)的研究方向。