由 昆,畢東方,沈東悅,傅金祥

(沈陽建筑大學市政與環(huán)境工程學院,遼寧 沈陽 110168)

大蒜素是大蒜廢水中的主要活性物質(zhì),具有較高的抗菌功效,不在生物體內(nèi)殘留、不容易使生物體產(chǎn)生耐藥性以及不會對環(huán)境造成污染,這些優(yōu)點使其成為替代抗生素作為產(chǎn)品添加劑,被廣泛應用到醫(yī)藥、食品以及飼料等多個領域中[1-4]。然而,含硫基的酶又會被大蒜素中的硫醚氧化,進而會對細胞分裂產(chǎn)生抑制作用,影響微生物的正常代謝,對后續(xù)的生化處理造成嚴重影響[5-6]。目前大蒜素的測定方法主要有色譜法、生物檢測法及化學法。色譜法檢測結果較準確,可信度高,但其測定成本高,操作步驟繁瑣[7-8]。生物檢測法雖然方法簡單,但操作復雜且測定的準確度較差?；瘜W檢測法是測定大蒜素的主要方法,具體包括了定硫法、硝酸汞沉淀滴定法,硫酸鋇吸光比濁法。定硫法操作步驟復雜且耗時長,檢測結果誤差較大;硝酸汞沉淀法因其滴定終點判斷差異性較大從而導致檢測結果誤差較大[9-13]。

針對大蒜素檢測方法多以純品大蒜素或者經(jīng)過高度濃縮的大蒜油為檢測對象,筆者以大蒜廢水為研究對象,通過單因素和多因素試驗優(yōu)化硫酸鋇吸光比濁法測定條件,提出了一種簡單、快捷、高效的測定大蒜廢水中大蒜素的方法。

1 實 驗

1.1 大蒜廢水的制備

模擬大蒜加工廢水,稱取大蒜25 g,去掉蒜皮后洗凈晾干,用榨汁機榨出約6～6.5 mL大蒜汁,將大蒜汁用自來水稀釋至1 L備用。廢水各項水質(zhì)指標與實際廢水水質(zhì)模擬基本一致[14]。

1.2 主要儀器與試劑

1.3 測定原理和方法

新鮮的大蒜中并不含有大蒜素,它是大蒜辣素的降解產(chǎn)物,大蒜素的主要成分是二烯丙基三硫醚,帶有強烈的刺激性氣味,化學性質(zhì)極不穩(wěn)定,易揮發(fā),在大蒜廢水中以成分復雜的有機硫化物的混合物形式存在[14-18]。

硫酸鋇吸光比濁法主要是依據(jù)濃硝酸與大蒜廢水中硫元素反應生成硫酸根;加入的氯化鋇與硫酸根反應生成穩(wěn)定的硫酸鋇懸濁液;硫酸鋇顆粒在一定pH條件下,均勻分散在聚乙烯醇介質(zhì)中,通過分光光度法測定硫酸鹽質(zhì)量,溶液中大蒜素的質(zhì)量濃度計算公式:

ρA=2CsmA/GmSO4.

(1)

檢測步驟:用移液管準確移取3 mL樣品于25 mL比色管中,加入濃硝酸對樣品進行氧化,依次加入2%聚乙烯醇、10% BaCl2溶液,調(diào)節(jié)溶液pH值,加蒸餾水至25 mL,蓋上試管塞,搖晃試管使溶液均勻,穩(wěn)定一段時間后,以空白試劑為參比,用1 cm比色皿于一定波長處測定吸光度值。依據(jù)反應換算得出溶液中大蒜素的質(zhì)量濃度。

1.4 實驗方法

測定條件的影響因素分析:選取波長(400～500 nm)、BaCl2用量(1～7 mL)、pH值(1～7)、聚乙烯醇投加量(1～4 mL)和穩(wěn)定時間(0～60 min)5個影響因素,通過控制變量法,采用單因素和正交實驗方法確定其對大蒜素測定的影響,確定最佳反應條件。每組同步進行3組平行試驗。

樣品氧化影響因素分析:選取濃硝酸投加量(0～4.5 mL)和氧化時間(0～60 min)2個影響因素,采用單因素實驗確定大蒜素中的硫元素反應生成硫酸根的條件。

方法驗證:利用選取的最佳測定條件對硫酸根溶液和大蒜廢水樣品進行精密度及加標回收試驗,以相對標準偏差和加標回收率為評價指標,驗證測定方法的重現(xiàn)性和準確性。

2 結果與分析

2.1 大蒜素測定影響因素分析

2.1.1 波長對大蒜素測定的影響

取3 mL大蒜廢水于25 mL比色管中,加入2.5 mL濃硝酸氧化15 min,依次加入2%聚乙烯醇1 mL,10% BaCl2溶液5 mL,調(diào)節(jié)溶液pH=1,加蒸餾水定容至25 mL,穩(wěn)定15 min后,分析波長對大蒜素測定的影響(見圖1)。

吸光比濁法以丁達爾效應為基礎,在400～750 nm波長內(nèi)均可測定。在保證線性關系的前提下,選擇無任何吸收干擾的短波長為測定范圍,以400 nm作為試驗起點,依次逐步提高波長。

從圖1可知,隨著波長的增大,大蒜素測定值總體呈現(xiàn)下降趨勢。當波長處于400～420 nm區(qū)間內(nèi)時,大蒜素質(zhì)量濃度保持相對穩(wěn)定;在410～420 nm區(qū)間時,大蒜素質(zhì)量濃度穩(wěn)定不變。當波長大于420 nm時,隨著波長不斷增大,大蒜素質(zhì)量濃度逐漸下降,由最初的0.065 mg/mL下降到0.059 mg/mL。因此,選擇410～420 nm中點415 nm作為測定參數(shù)。

2.1.2 BaCl2用量對大蒜素測定的影響

在415 nm波長條件下,控制BaCl2投加量分別為1～7 mL,分析 BaCl2用量對測定結果的影響(見圖2)。

圖2 BaCl2投加量對測定的影響Fig.2 Effect of BaCl2 dosage on determination

2.1.3 pH值對大蒜素測定的影響

圖3 pH值對測定的影響Fig.3 Effect of pH value on determination

2.1.4 聚乙烯醇用量及穩(wěn)定時間對大蒜素測定的影響

聚乙烯醇上羥基為極性分子,可與水分子結合,加入BaCl2懸濁液后,部分羥基能夠主動與親水的固體顆粒相吸附,剩余羥基便分散在溶液中,形成穩(wěn)定的懸濁液。固體顆粒均勻分散在體系中,在一定時間內(nèi)能夠維持單位體積中粒子數(shù)量基本不變,使測得的吸光度穩(wěn)定可靠。

圖4 聚乙烯醇投加量對測定的影響Fig.4 Effect of polyvinyl alcohol dosage on determination

由圖4可知,隨著聚乙烯醇投加量的增加,大蒜素質(zhì)量濃度逐漸下降。當聚乙烯醇投加量為1 mL時,大蒜素質(zhì)量濃度最大分別為0.019 mg/mL,0.078 mg/mL和0.126 mg/mL。此時聚乙烯醇對生成的硫酸鋇沉淀具有很好的分散作用,懸濁液具有最佳穩(wěn)定性和最高靈敏度。隨著聚乙烯醇投加量進一步增大,體系中大蒜素含量逐漸減少并趨于穩(wěn)定。故測定方法中聚乙烯醇投加量為1 mL。

在上述試驗的基礎上,將溶液分別穩(wěn)定放置10～60 min(見圖5)。從圖5可知,隨著穩(wěn)定時間的延長,大蒜素質(zhì)量濃度呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。在時間為10～20 min內(nèi)時,體系的大蒜素質(zhì)量濃度最大且保持穩(wěn)定,質(zhì)量濃度分別為0.021 mg/mL,0.078 mg/mL和0.136 mg/mL。故確定反應的穩(wěn)定時間為15 min。

圖5 聚乙烯醇穩(wěn)定時間對測定的影響Fig.5 Effect of stability time of polyvinyl alcohol on determination

2.2 正交法優(yōu)化測定條件

表1 正交試驗方案表Table 1 The scheme table of orthogonal test

表2 正交試驗直觀分析Table 2 Visual analysis of orthogonal test

2.3 標準曲線的建立和分析

用該方法得出的回歸方程為y=0.301x+0.001,相關系數(shù)r2=0.999 1>0.99。標準曲線平均加標回收率為98%～99%,相對標準偏差為1.4%。

2.4 大蒜廢水中大蒜素氧化條件分析

2.4.1 濃硝酸投加量對大蒜素氧化的影響

移取3 mL同批次大蒜廢水樣品,分別加入0～4.5 mL的濃硝酸并氧化15 min,結果如圖6所示。

圖6 濃硝酸投加量對測定的影響Fig.6 Effect of concentrated nitric acid dosage on determination

隨著濃硝酸投加量的增加,大蒜素含量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當濃硝酸投加量為0～2.5 mL時,隨著濃硝酸投加量的增大,大蒜素含量從0增大到0.103 mg/mL。當濃硝酸投加量為2.5 mL時,大蒜素質(zhì)量濃度達到最大,此時大蒜素中的硫元素被徹底氧化。隨著濃硝酸投加量的進一步增加,大蒜素質(zhì)量濃度開始逐漸下降,從0.103 mg/mL下降至0.081 mg/mL,這是由于濃硝酸投加量過少時,有機硫化物氧化不徹底,僅生成少量的BaSO4沉淀,導致測定結果偏低;當濃硝酸投加量過多時,溶液酸度較大,酸效應會影響沉淀雙電層的構成,生成的BaSO4沉淀溶解度增大,影響吸光度的穩(wěn)定性,導致數(shù)值下降。因此,確定濃硝酸投加量為2.5 mL。

2.4.2 氧化時間對測定結果的影響

圖7為氧化時間對測定結果的影響。從圖7可知,隨著氧化時間的延長,溶液穩(wěn)定性呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。當氧化時間在10～20 min時,樣品中大蒜素含量較高,此時大蒜素質(zhì)量濃度為0.067 mg/mL。隨著氧化時間的進一步增長,大蒜素質(zhì)量濃度下降到0.053～0.06 mg/mL。故確定大蒜廢水氧化時間為15 min。

圖7 氧化時間對測定的影響Fig.7 Effect of oxidation time on determination

2.5 精密度和加標回收試驗分析

分別選取兩種不同大蒜素質(zhì)量濃度的大蒜廢水樣品進行測定,對每種樣品進行10次平行試驗,取10次試驗的平均值進行精密度試驗結果分析,結果如表3所示。

表3 大蒜廢水中大蒜素測定精密度試驗Table 3 The precision test of garlicin determination in garlic wastewater

表4 大蒜廢水中大蒜素測定加標回收試驗Table 4 The garlicin spiked recovery test in garlic wastewater

從表3和表4可知,使用硫酸鋇吸光比濁法對大蒜廢水中的大蒜素質(zhì)量濃度進行測定,樣品的相對標準偏差穩(wěn)定在0.8%～0.9%,樣品回收率在98%～101%,說明該方法具有良好的準確度和精密度。

3 結 論

(1)通過正交試驗得出影響測定大蒜素質(zhì)量濃度的4個主要因素的從大到小依次為:聚乙烯醇投加量、pH值、BaCl2投加量、波長,以硫酸鹽溶液為對象時,硫酸鋇吸光比濁法測定大蒜素質(zhì)量濃度的最佳測定條件為:聚乙烯醇投加量為1 mL,pH=1,BaCl2投加量為5 mL,測定波長為415 nm。

(2)曲線回歸方程為y=0.301x+0.001,相關系數(shù)0.999 1>0.99。標準曲線平均加標回收率達到98%～99%,相對標準偏差為1.4%。樣品的相對標準偏差穩(wěn)定在0.8%～0.9%,樣品回收率在98%～101%。