沈 燕,張正文,劉興凱,王福成,邵學(xué)東*
(1.君頂酒莊有限公司,山東煙臺 265607;2.煙臺市蓬萊區(qū)葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心,山東煙臺 265699)
有機(jī)酸是葡萄果實(shí)及葡萄酒中體現(xiàn)風(fēng)味的主要物質(zhì)之一,其含量是衡量葡萄果實(shí)成熟度和品質(zhì)的重要參數(shù),在葡萄酒的釀造中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,對酒的感官質(zhì)量有一定的影響,與酒的物理化學(xué)以及微生物穩(wěn)定性有著緊密聯(lián)系[1-4]。酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等有機(jī)酸普遍存在于葡萄果實(shí)以及葡萄酒中,具有各自的特點(diǎn)及功效[4-5]。此外,有機(jī)酸含量的高低會直接影響葡萄酒的酸堿平衡與整體的口感風(fēng)味[6-7]。
近年來,采用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)測定葡萄及葡萄酒中有機(jī)酸的方法有很多,相較于氣相色譜、離子色譜以及其他的傳統(tǒng)檢測方法,HPLC 具有對樣品要求低、操作簡單、檢測時(shí)間短、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好以及可同時(shí)檢測多種有機(jī)酸等優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用廣泛[8]。液相設(shè)備和色譜柱型號不同,檢測條件及方法也不盡相同,導(dǎo)致有機(jī)酸檢測結(jié)果有差異。本研究擬用HPLC 法,在前人研究的基礎(chǔ)上,對檢測條件進(jìn)行優(yōu)化,形成一套檢測葡萄及葡萄酒中有機(jī)酸的完整體系,為葡萄酒企業(yè)提供良好的技術(shù)支撐。
葡萄及葡萄酒樣品,君頂酒莊有限公司;純凈水,娃哈哈宏振食品飲料貿(mào)易有限公司;濃硫酸(分析純),山東萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠;酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、草酸、乳酸和乙酸(標(biāo)準(zhǔn)品),英國政府檢測標(biāo)準(zhǔn)集團(tuán)。
1260 Infinity II 高效液相色譜儀;G7114A1260 VWD 檢測器;Hi-Plex H 色譜柱(300 mm×7.7 mm,8 μm);PL Hi-Plex H 保護(hù)柱(50 mm×7.7 mm,8 μm),美國Agilent 公司;KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;HC-3016R 高速冷凍離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。
1.3.1 試樣處理
取5 mL 葡萄汁或葡萄酒于離心管中,在14 000 r·min-1、4 ℃下離心20 min,抽取上清液,用0.45 μm 膜過濾,將濾液置于進(jìn)樣小瓶中待測。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品處理
有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品配制前,將標(biāo)準(zhǔn)品分別注入儀器中,以確認(rèn)各有機(jī)酸出峰順序及預(yù)計(jì)保留時(shí)間?;旌蠘?biāo)準(zhǔn)品母液配制:酒石酸4 000 mg·L-1、蘋果酸4 060 mg·L-1、檸檬酸4 060 mg·L-1、乳酸4 100 mg·L-1、草 酸2 020 mg·L-1、 琥 珀 酸2 140 mg·L-1、 乙 酸2 100 mg·L-1,按照實(shí)驗(yàn)要求稀釋到不同濃度梯度備用。
1.3.3 高效液相色譜條件
色譜柱:Hi-Plex H(300 mm×7.7 mm,8 μm);波長:205 ~215 nm;流動相:0.004 ~0.008 mol·L-1硫酸水溶液;流速:0.4 ~0.8 mL·min-1;柱溫箱溫度:40 ~60 ℃;有機(jī)酸進(jìn)樣量:5 ~15 μL。
2.1.1 波長的選擇
根據(jù)馬永強(qiáng)等[8]的研究,在波長205 ~215 nm下進(jìn)行有機(jī)酸的檢測。結(jié)果表明,在210 nm 波長下,7 種有機(jī)酸的響應(yīng)值最高。
2.1.2 流動相的選擇
根據(jù)色譜柱使用要求及郭燕等[9]的研究,比較0.004 mol·L-1、0.005 mol·L-1、0.006 mol·L-1、0.007 mol·L-1和0.008 mol·L-1的硫酸作為流動相的分離效果。結(jié)果表明,低濃度下(0.006 mol·L-1濃度以下),檸檬酸與酒石酸分離效果較差;高濃度下(0.006 mol·L-1濃度以上),整體分離效果都差。因此,選擇0.006 mol·L-1的硫酸作流動相。
2.1.3 流速的選擇
根 據(jù) 丁 玲 等[10]的 研 究, 在0.4 mL·min-1、0.5 mL·min-1、0.6 mL·min-1、0.7 mL·min-1和0.8 mL·min-1流速下檢測有機(jī)酸。在低流速下,草酸的峰出現(xiàn)了拖尾的現(xiàn)象,且檢測時(shí)間長,全部出峰所需時(shí)間約40 min;在高流速下,柱壓過高,可達(dá)48 MPa,而色譜柱最高壓力要求為50 MPa。因此,確定流速為0.6 mL·min-1。
2.1.4 柱溫的選擇
根據(jù)張軍等[11]的研究,選擇在柱溫為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃下對有機(jī)酸進(jìn)行檢測。當(dāng)柱溫較低時(shí),檸檬酸與酒石酸的分離度過低,隨著柱溫的升高,二者分離度逐漸增大。60 ℃為Hi-Plex H 色譜柱的最高使用溫度,因此為了柱效以及長期檢測效果,確定檢測柱溫為55 ℃。
2.1.5 進(jìn)樣量的選擇
根據(jù)丁青芝等[12]的研究,選擇進(jìn)樣量為5 μL、10 μL、15 μL 檢測有機(jī)酸,當(dāng)進(jìn)樣量為5 μL 時(shí),各有機(jī)酸的響應(yīng)值相對較低,當(dāng)進(jìn)樣量為15 μL 時(shí),檸檬酸與酒石酸的分離度不到1.5。因此,確定進(jìn)樣量為10 μL。
綜上所述,HPLC 檢測有機(jī)酸的最佳色譜條件為紫外檢測波長210 nm;流動相0.006 mol·L-1硫酸;流速0.6 mL·min-1;柱溫55 ℃;進(jìn)樣量10 μL。
2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
根據(jù)上述優(yōu)化得到的色譜條件,將不同濃度梯度的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣,得出7 種有機(jī)酸的色譜圖,見圖1。出峰時(shí)間在20 min 內(nèi),分離度均大于1.5。用峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x,mg·L-1)繪制7 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,見表1。
表1 有機(jī)酸的線性相關(guān)性
圖1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖
由表1 可知,7 種有機(jī)酸的峰面積和濃度的相關(guān)系數(shù)(R2)都在0.999 9 ~1.000 0,說明在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;各有機(jī)酸的最低檢出限在0.031 4 ~0.722 3 mg·L-1(信噪比(S/N≥3),說明該方法的靈敏度較高。
2.2.2 加標(biāo)回收率
取一葡萄酒樣品,添加3 種不同濃度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品,重復(fù)檢測6 次,結(jié)果見表2。各有機(jī)酸加標(biāo)回收率在95.24%~102.04%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.16%~1.87%,表明該方法的準(zhǔn)確性良好。
表2 有機(jī)酸加標(biāo)回收率
2.3.1 有機(jī)酸保留時(shí)間的重現(xiàn)性
取一葡萄酒樣品,重復(fù)檢測6 次,測定各有機(jī)酸的保留時(shí)間,結(jié)果見表3,各有機(jī)酸保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.005 ~0.073 min,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.029%~0.811%,說明在該條件下,有機(jī)酸保留時(shí)間具有良好的重現(xiàn)性。
表3 有機(jī)酸保留時(shí)間的重現(xiàn)性
2.3.2 有機(jī)酸含量的重現(xiàn)性
取一葡萄酒樣品,重復(fù)檢測6 次,測定各有機(jī)酸的平均含量,結(jié)果見表4。各有機(jī)酸含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.024 ~11.430 mg·L-1,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.388%~3.426%,表明該方法重現(xiàn)性較好。
表4 有機(jī)酸含量的重現(xiàn)性
本研究確定了HPLC 檢測葡萄以及葡萄酒中草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸和乙酸等7 種有機(jī)酸的方法,最佳色譜條件如下。色譜柱為Hi-Plex H;紫外檢測波長為210 nm;流動相 為0.006 mol·L-1的 硫 酸;流 速 為0.6 mL·min-1;柱溫為55 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。該方法樣品前處理簡便、檢測時(shí)間短、靈敏度高、精確性及準(zhǔn)確性好,適用于葡萄及葡萄酒中有機(jī)酸的快速檢測。