劉書靜，魏妍姝，楊如意，曹 蒙，李建芳

（信陽農(nóng)林學(xué)院 食品學(xué)院，河南信陽 464000）

板栗是我國食用最早的堅果之一，年產(chǎn)量居世界首位，品種繁多。目前，板栗以鮮果和初加工為主，但是病蟲害、內(nèi)腐病、褐變等問題嚴(yán)重影響了板栗的產(chǎn)量及其深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。研究表明，多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）是引起板栗褐變的主要因素[1]。多酚氧化酶也稱酪氨酸酶，能催化多酚類化合物的氧化反應(yīng)，形成顏色較深的多酚化合物，導(dǎo)致板栗顏色變暗。在板栗中，多酚氧化酶的活性與褐變有著密切的關(guān)系，多酚氧化酶的活性越高，果實的褐變越快，如果減弱或抑制多酚氧化酶的活性，就能延緩果實的褐變速度，影響多酚氧化酶活性的主要因素有溫度、pH 值、底物濃度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花板栗：無病蟲害、無機械損傷的新鮮信陽板栗；磷酸緩沖液：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；鄰苯二酚：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XMTD-204 數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；GTR16-2 醫(yī)用離心機：北京新時代北利醫(yī)療器械有限公司；CP214電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；A390 紫外可見分光光度計：翱藝儀器（上海）有限公司；BC/BD-200HEP 電冰柜：青島海爾特種電冰柜有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 粗酶液的提取

參考饒先軍等[2]提取結(jié)球生菜中多酚氧化酶的方法，做適當(dāng)修改。取鮮板栗剝殼去衣，清水清洗后用干凈紙巾擦干表面水分，稱取5 g 不同部位的板栗，切碎混勻放入研缽中，加入少量石英砂和10 mL pH=7.0 的0.05 mol·L-1的預(yù)冷磷酸緩沖液進行冰浴研磨，研磨成勻漿后移到20 管 1.5 mL 離心管中，在4 ℃，12 000 r·min-1條件下冷凍離心15 min，取上清液，在4 ℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 鄰苯二酚溶液的配制

稱取0.11 g 的鄰苯二酚于燒杯中，加少量純水，用玻璃棒搗研溶解，用玻璃棒引流進100 mL 棕色容量瓶中，再用純水沖洗玻璃棒和燒杯3 次，將沖洗后的液體引流進容量瓶中，用純水定容，搖勻，得到0.01 mol·L-1的鄰苯二酚溶液。分別稱取0.22 g、0.33 g、0.44 g、0.55 g、0.66 g、0.77 g、0.88 g，0.99 g 和1.10 g 的鄰苯二酚，用上述方法配制成0.02 mol·L-1、0.03 mol·L-1、0.04 mol·L-1、0.05 mol·L-1、0.06 mol·L-1、0.07 mol·L-1、0.08 mol·L-1、0.09 mol·L-1和0.10 mol·L-1的鄰苯二酚溶液，配制完后貼好標(biāo)簽，放置于陰涼避光處備用。

1.3.3 酶活性測定

取1.5 mL 一定pH 值的磷酸緩沖液和1.0 mL 一定濃度的鄰苯二酚溶液于試管中，再加入0.5 mL 酶液，水浴保溫3 min 后立即用紫外分光度計測量吸光度并計時，在波長410 nm 下每隔0.5 min 進行吸光度測定，記錄以備計算，共記錄3 min。以每分鐘內(nèi)吸光度增加0.001 為1 個活性單位U，酶活性可以表示為U·min-1。用在沸水中加熱5 min 的酶液為對照，做3 組重復(fù)實驗，取平均值作為測得的PPO 活性。

1.3.4 溫度和底物濃度試驗

采用雙因素試驗[3]，分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃條件下讓濃度為0.01 mol·L-1、0.02 mol·L-1、0.03 mol·L-1、0.04 mol·L-1、0.05 mol·L-1、0.06 mol·L-1、0.07 mol·L-1、0.08 mol·L-1、0.09 mol·L-1和0.10 mol·L-1的鄰苯二酚溶液與PPO 粗酶液反應(yīng)。取1.5 mL 的pH=7 的磷酸緩沖液和1.0 mL 不同濃度的鄰苯二酚溶液于試管中，再加入0.5 mL 酶液，混勻后在不同溫度下保溫3 min，立即在410 nm 下測定吸光度變化值。

1.3.5 pH 值試驗

取1.5 mL 的pH 為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0的磷酸緩沖液，分別加入1.0 mL 濃度為0.05 mol·L-1的鄰苯二酚溶液，加入0.5 mL 酶液后30 ℃保溫，迅速倒入比色皿中測吸光度變化值。

1.3.6 褐變指數(shù)測定

褐變指數(shù)=∑（各褐變級別分值×各級褐變面積百分?jǐn)?shù)）/（褐變最高級別分值×100%），式中各級褐變面積用透明厘米方格紙測定，褐變級別分值按板栗果仁顆粒（直徑在1.0 ～2.0 mm）褐變顏色深度評判，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 褐變評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.7 丙二醛含量測定

采用硫代巴比妥酸法測定，從10 個板栗果實中稱取樣品2.0 g，加入10.0 mL 預(yù)冷過的100 g·L-1三氯乙酸溶液研磨成勻漿，將勻漿液4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，收集上清液，低溫保存?zhèn)溆?。?.0 mL 上清液，對照管中加2.0 mL 100 g·L-1的三氯乙酸溶液，加入2.0 mL 0.67%的硫代巴比妥酸溶液，混合，煮沸20 min，取出冷卻，如有沉淀需再離心，取上清液分別測定反應(yīng)液在波長450 nm、532 nm、600 nm 的吸光度，重復(fù)3 次。根據(jù)溶液吸光度計算出反應(yīng)混合液中丙二醛含量，按公式計算出每克樣品中丙二醛含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

除特殊說明外，所有數(shù)據(jù)平行測定3 次，用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)處理，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用Origin 9 軟件處理數(shù)據(jù)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對PPO 活性的影響

如表2 所示，PPO 活性在30 ℃時高，在35 ℃、40 ℃的活性次之，在20 ℃時活性最低。溫度對酶活性影響很大，低溫有助于抑制PPO 的酶活性，且低溫相較于高溫對PPO 活性的抑制效果更好。王磊等[4]的研究表明在95 ℃，5 min 左右就會幾乎完全抑制PPO 活性。高溫雖能更好地抑制酶活性，但是對于板栗的貯運和鮮銷是不利的，所以對于板栗的保鮮采用低溫冷藏較好。

表2 不同溫度和底物濃度對PPO 活性的影響

2.2 底物濃度對PPO 活性的影響

如表2 所示，在不同的溫度下，隨著底物濃度的升高，PPO 活性呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，本實驗PPO的最適反應(yīng)條件是30 ℃，底物濃度0.10 mol·L-1。30 ℃時，隨著底物濃度的升高，PPO 活性增加的速率先增大再減小，說明溫度適宜時，在一定范圍內(nèi)，板栗果實中的多酚類物質(zhì)越多，板栗果實就越容易褐變。

2.3 不同pH 值對PPO 活性的影響

如圖1 所示，當(dāng)pH 值為4 ～6 時，PPO 活性逐漸升高，pH=6 時PPO 活性最高，pH 值為7 ～9 時，酶液處于堿性環(huán)境，PPO 活性迅速下降，pH=9 時，PPO 活性幾乎全部喪失。堿性環(huán)境比酸性環(huán)境對PPO活性的影響大，與王磊等[4]、鄭龍等[5]的研究結(jié)果一致。

圖1 pH 值對PPO 活性的影響

2.4 褐變指數(shù)對丙二醛含量的影響

由圖2 可知，隨著褐變指數(shù)的增加，板栗中丙二醛的含量總體呈上升趨勢，說明板栗在貯藏過程中脂肪的氧化程度升高。當(dāng)褐變指數(shù)在0.2 時，丙二醛含量較低。褐變指數(shù)為0.8 時，丙二醛含量較高，為2.38 μmol·L-1。

圖2 褐變指數(shù)對丙二醛的影響

3 結(jié)論

本實驗以信陽板栗為原料，研究溫度、pH 值、底物濃度對板栗中多酚氧化酶活性和丙二醛含量的影響。實驗結(jié)果表明溫度對酶活性影響很大，低溫能更好地抑制多酚氧化酶的活性；堿性環(huán)境能更好地抑制多酚氧化酶的活性，pH=9 時效果最佳；當(dāng)褐變指數(shù)為0.2 時，丙二醛含量較低，褐變指數(shù)為0.8 時，丙二醛含量較高，為2.38 μmol·L-1。本次研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)控制溫度、pH 值、底物濃度，能很好地抑制多酚氧化酶的活性，提高板栗品質(zhì)。