劉娜 劉志敏 宋東輝，

（1. 天津科技大學海洋與環(huán)境學院，天津 300457；2. 天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津 300457）

在我國水污染控制中，含酚廢水被列為重點解決的有害廢水之一［1]。其中鄰苯二酚作為一種重要的有機化學中間體，大量應用于印染業(yè)、石油化工業(yè)、造紙業(yè)、制藥業(yè)及化妝品等行業(yè)［2]，因此與之相關的也伴隨著各行各業(yè)大量排放含酚廢水。目前含酚廢水的處理方法［3-4]有物理法包括吸附法、萃取法、離子交換法等；化學法包括濕式空氣氧化法、化學氧化法、濕式催化氧化法等；生化法包括生物膜法、厭氧法和活性污泥法等，其中生化法因無二次污染而被廣泛應用。

苯甲酸為芳香族化合物代謝過程中的一種中間產(chǎn)物，苯甲酸及其苯甲酸鈉廣泛應用在食品業(yè)、化工業(yè)和染料工業(yè)，導致其成為工業(yè)廢水常見的環(huán)境污染物。動物實驗研究表明，苯甲酸鈉能夠降低雄性生殖細胞質(zhì)量，并且有遺傳毒性和致突變毒性［5]。此外，苯甲酸鈉還能破壞蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，使蛋白結(jié)構(gòu)變得更加疏松［6]。生活中苯甲酸鈉和鄰苯二酚的污染日益嚴重，嚴重影響人們生活健康，而微生物修復技術(shù)作為一種經(jīng)濟、高效、無二次污染的治理技術(shù)，已被廣泛應用在水污染處理中，成為目前最具有潛力的治理方法［7]。

本研究前期分離篩選的石油烴降解菌Acinetobactersp.Tust-DM21可以高效降解原油中芳香烴組分［8]。此外，還發(fā)現(xiàn)其能夠利用其他苯類物質(zhì)如鄰苯二酚、苯甲酸鈉作為唯一碳源進行生長，為了研究其降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的能力，本試驗測定了其在不同培養(yǎng)條件下的生長情況和對這兩種苯類化合物的降解情況，以及鄰苯二酚-1，2雙加氧酶、苯甲酸1，2-雙加氧酶的酶活和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的動力學反應常數(shù)，旨為污水處理苯類物化合物提供備選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH調(diào)至7.0-7.2。

無機鹽培養(yǎng)基：Na2HPO41.5 g，KH2PO41.5 g，（NH4）2SO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.01 g，F(xiàn)eSO4·12H2O 0.02 g，加蒸餾水定容至1 L。

上述培養(yǎng)基在高壓蒸汽滅菌鍋中1×105Pa滅菌20 min。

菌株：石油烴降解菌Acinetobactersp. Tust-DM21由本實驗室前期分離自渤海灣海洋石油勘探船廢油收集區(qū)［8]，存于40%甘油，-80℃冷藏。該菌株已被中國海洋微生物菌種保藏管理中心（http：//mccc.org.cn/）收藏，菌株編號MCCC 1K03249，其16S rRNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄號為 KX390866。

1.2 方法

1.2.1 鄰苯二酚、苯甲酸鈉測定方法的建立［9-10]鄰苯二酚和苯甲酸鈉濃度的測定采用紫外分光光度法，用蒸餾水分別配置不同底物濃度的溶液，在275 nm和224 nm下分別測定不同濃度鄰苯二酚及苯甲酸鈉溶液的吸光值，然后以底物濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 菌懸液的制備 活化石油烴降解菌，并培養(yǎng)至生長對數(shù)期，然后取1 mL菌液轉(zhuǎn)接到100 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后，5 000 r/min，離心5 min，棄上清，用無菌蒸餾水重懸菌體，重新離心，反復3次，最后用等量的無機鹽培養(yǎng)基懸浮，并使OD600維持在1.0左右。

1.2.3 鄰苯二酚、苯甲酸鈉降解率的測定［9-10]將制備好的菌懸液分別加入以鄰苯二酚或苯甲酸鈉為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)液中，以不接菌的培養(yǎng)基為空白對照，每個樣品設置3個平行，然后30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)，分別在不同的時間點取樣，8 000 r/min，離心2 min，取上清，在各自波長下測定吸光度，根據(jù)吸光度值和標準曲線計算底物含量，底物的降解率計算如下：

其中，N0：初始底物濃度，N1：剩余底物濃度。

1.2.4 不同培養(yǎng)條件下石油烴降解菌對鄰苯二酚、苯甲酸鈉的降解

1.2.4.1 不同接菌量對石油烴降解菌降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 在鄰苯二酚濃度為600 mg/L，苯甲酸鈉濃度為1 500 mg/L，培養(yǎng)基初始pH為6.5的條件下，各自分別接入1%、3%、5%、7%和9%的菌液，以不接菌液的培養(yǎng)基為空白對照，每個樣品做3個平行，30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)，并按照1.2.3的方法測定底物濃度。

1.2.4.2 不同底物濃度對石油烴降解菌降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 在培養(yǎng)基初始pH為6.5，接菌量為5%的條件下，分別配置鄰苯二酚濃度為200、400、600、700和 800 mg/L；接菌量為3%，苯甲酸鈉濃度為1 500、2 500、3 500、4 500和5 500 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基，以不接菌的培養(yǎng)基為空白對照，每個樣品做3個平行，30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)，并按照1.2.3的方法測定底物濃度。

1.2.4.3 不同pH值對石油烴降解菌降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 鄰苯二酚在堿性環(huán)境中容易氧化，當pH值在9.0以上時，菌株對鄰苯二酚的利用率遠遠小于鄰苯二酚的氧化速率，且在9 h后鄰苯二酚已經(jīng)氧化變黑，試驗指標難以測定。所以在鄰苯二酚濃度為600 mg/L，接菌量為5%的條件下，把培養(yǎng)基pH值分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，以不接菌的培養(yǎng)基為空白對照，每個樣品做3個平行，30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)，并按照1.2.3的方法測定鄰苯二酚濃度。

該菌從海洋環(huán)境中分離純化出來，適宜在弱堿性的環(huán)境中生長。在苯甲酸鈉濃度為1 500 mg/L，接菌量為3%的條件下，把pH值調(diào)為7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，以不接菌的培養(yǎng)基為空白對照，每個樣品做3個平行，30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)，并按照1.2.3的方法測定苯甲酸鈉濃度。

1.2.4.4 不同溫度對石油烴降解菌降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 在鄰苯二酚濃度為600 mg/L、接菌量為5%；以及苯甲酸鈉濃度為1 500 mg/L、接菌量為3%的條件下，設置不同溫度值（20、25、30、35和40℃），以不接菌的培養(yǎng)基為空白對照，每個樣品做3個平行，30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)，并按照1.2.3的方法測定鄰苯二酚濃度和苯甲酸鈉濃度。

1.2.5 鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的粗酶特性

1.2.5.1 細胞粗酶液的制備 將菌懸液接入以鄰苯二酚為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，12 h搖床培養(yǎng)，5 000 r/min離心5 min，棄上清，然后用磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）洗滌菌體3次，經(jīng)超聲波破碎，最后4℃、12 000 r/min離心15 min，上清液用于酶活測定。酶活力的計算公式為：U/mg=△A×V/（ε×M），其中△A：260nm下每分鐘光密度變化值，V：酶活測定體積（L），ε：鄰苯二酚在260 nm下的摩爾消光系數(shù) 1 L/（mmol·cm），M：測定體系中蛋白質(zhì)量（mg）。

1.2.5.2 溫度、pH對酶活力的影響 鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的活力以單位時間內(nèi)反應產(chǎn)物黏康酸在260 nm處的光吸收值測定。酶活力測定總體系為10 mL，內(nèi)含濃度為20 mg/L的鄰苯二酚0.5 mL、粗酶液2.5 mL、磷酸鹽緩沖溶液7 mL。通過單位時間內(nèi)吸光度的變化值和體系中的蛋白含量來計算酶活力［11]，其中體系中蛋白的含量測定采用考馬斯亮藍法［12]。

利用不同緩沖溶液的pH緩沖范圍，在pH值為6.0-10.0范圍內(nèi)進行試驗，探究粗酶的最適pH。

在15-45℃下，分別測定粘康酸在260 nm下吸光度值隨時間的變化，探討粗酶的最適反應溫度。

1.2.5.3 粗酶反應動力學的測定 在最適溫度和最適pH條件下，固定粗酶液加入量，以不同濃度鄰苯二酚（50-300 μmol/L）為底物，在1.2.5.2的反應體系中進行，依據(jù)底物濃度和相應的酶促反應速率作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，得到Km和Vmax。

1.2.6 苯甲酸1，2-雙加氧酶酶活測定［13]將菌懸液接種到以苯甲酸鈉為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，所獲得的菌體用于酶活的測定，其中NADH的濃度為30 mmol/L，在1.2.5.2的反應體系中進行，檢測波長為340 nm。

2 結(jié)果

2.1 鄰苯二酚、苯甲酸鈉標準曲線的測定

用紫外分光光度計分別在275 nm和224 nm下測定鄰苯二酚、苯甲酸鈉的吸光度。以鄰苯二酚、苯甲酸鈉濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制的標準曲線，如圖1。

2.2 不同培養(yǎng)條件對菌株Tust-DM21降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響

2.2.1 不同接種量對菌株降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 不同接種量對菌株降解鄰苯二酚和苯甲酸鈉的影響分別如圖2-A、圖2-B所示。從圖2-A中可以看出隨著接種量的增加，石油烴降解菌對鄰苯二酚的降解速率也逐漸增加，當接種量為1%時，菌株延滯期增長，而鄰苯二酚隨著延滯期增長的這段時間會發(fā)生部分氧化，導致菌株可能受到其氧化產(chǎn)物的毒害作用，不能正常利用鄰苯二酚。當接種量為5%以上時，菌株在18 h時對鄰苯二酚的降解速率都能達到88%以上，出于節(jié)省接菌量和較高的降解速率，確定5%為菌株降解鄰苯二酚的最佳接菌量。

圖1 （A）鄰苯二酚、（B）苯甲酸鈉標準曲線

在含有1 500 mg/L苯甲酸鈉無機鹽培養(yǎng)基中，分別以1%、3%、5%、7%和9%的接種量接種，震蕩培養(yǎng)36 h，測定苯甲酸鈉的降解率，結(jié)果如圖2-B，從圖中可以看出當接種量為7%、9%時，在各個時間點菌株對苯甲酸鈉降解率相差不大。當接種量為3%、5%時，在18 h內(nèi)菌株對苯甲酸鈉的降解率已達80%以上，在21 h時降解率都達到95%以上。當接種量為1%時，菌株達到最高降解率所用時間最長，出于節(jié)省接菌量和較高的降解速率，選用3%為最佳接菌量。

圖2 接種量對菌株降解鄰苯二酚（A）、苯甲酸鈉（B）的影響

2.2.2 不同底物濃度對菌株Tust-DM21降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 在含有不同鄰苯二酚濃度的無機鹽培養(yǎng)基中加入5%的接種量，30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)36 h，鄰苯二酚降解率和菌株生長分別如圖3-A、3-B。從圖3-A、3-B可以看出底物濃度不超過700 mg/L時，菌株對鄰苯二酚的降解率都達到90%以上，菌株的OD600也隨著底物濃度的增加而增加，刺激了菌株的生長。當?shù)孜餄舛葹?00 mg/L時，菌株受到鄰苯二酚的毒害作用，抑制了菌株的生長，菌株的OD600僅達到0.160左右，導致其對鄰苯二酚的降解率急劇下降，僅有30%左右，故700 mg/L為該菌株的最大耐受濃度。當鄰苯二酚濃度為600 mg/L時，菌株的生物量較大，在36 h內(nèi)能夠更直觀的反應菌株在鄰苯二酚中的生長變化情況，相比于700 mg/L，菌株在600 mg/L鄰苯二酚中降解效果更好，所以選用底物濃度為600 mg/L的鄰苯二酚進行后續(xù)試驗的研究。

以3%的接種量接種到含有不同苯甲酸鈉濃度的無機鹽培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)36 h后測定培養(yǎng)基中苯甲酸鈉的含量，計算其降解率，菌株生長和對苯甲酸鈉的降解率如圖3-C。從圖3-C中可以看出，當苯甲酸鈉的濃度小于2 500 mg/L時，菌株對苯甲酸鈉有較高的降解率，達95%以上。隨著苯甲酸鈉濃度的增加，菌株受到其毒害作用，其生長受到抑制。當苯甲酸鈉濃度為4 500 mg/L時，菌株對苯甲酸鈉的降解率僅有10%，所以菌株對苯甲酸鈉的最大耐受濃度為4 500 mg/L。

圖3 不同底物濃度對菌株降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響

2.2.3 不同pH值對菌株降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 以5%的接種量接種到不同初始pH值的無機鹽液體基中，培養(yǎng)36 h，確定菌株降解鄰苯二酚的最適pH，結(jié)果如圖4-A所示，在偏酸環(huán)境中該菌株的生長受到抑制，導致其在pH值為4.0、5.0 中不能更好的利用鄰苯二酚。在pH值為6.0時菌株對鄰苯二酚的降解達到最高為94.8%，確定最佳pH值為6.0，此外菌株在pH值為6.0-8.0范圍內(nèi)都有較好的降解范圍。

菌株Tust-DM21是從海洋中分離純化出來的，適宜在弱堿性的環(huán)境中生長，用NaOH或HCl調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH值為6.0-11.0，菌株對苯甲酸鈉的降解率如圖4-B。在pH值7.0-11.0范圍內(nèi)，菌株對苯甲酸鈉都有較高的降解率達80%以上，在pH值為8.0時降解率達到最高為97.6%，確定最佳pH值為8.0。

2.2.4 不同溫度對菌株降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響 不同溫度對菌株生長及鄰苯二酚、苯甲酸鈉降解的影響分別如圖5-A、5-B所示。菌株在25-35℃時對鄰苯二酚、苯甲酸鈉的降解率較高，達到80%以上，當溫度達到40℃時，菌株不能正常生長，說明該菌適宜在中性溫度中生長。菌株對鄰苯二酚、苯甲酸鈉的最佳降解溫度為35℃，其降解率分別高達92.7%、95.9%。

2.3 鄰苯二酚1, 2-雙加氧酶的粗酶特性

2.3.1 pH值、溫度對酶活力的影響 pH值是影響酶活力的重要因素之一，pH過高或過低會破壞蛋白酶的穩(wěn)定性，使酶受到不可逆的破壞。在不同pH值的緩沖溶液中測定鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的活力，結(jié)果如圖6-A所示，隨著pH值增加，鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的酶活也隨之增高，在pH值為8.0時，Tust-DM21粗酶液的酶活達到最高為3.56 U。當pH值繼續(xù)增加時，鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的活性隨之降低，降低到1.16 U，所以在pH值5.0-10.0范圍內(nèi)，粗酶液的最佳pH值為8.0。

圖4 pH對菌株生長和菌株降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響

圖5 溫度對菌株生長和菌株降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的影響

溫度是影響酶活力的另一個重要因素，溫度過高蛋白酶易變性從而導致酶失活，溫度較低時酶活性不高。分別在不同溫度下測定粗酶液的酶活力，結(jié)果如圖6-B所示，在15-35℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的活力也逐漸增加，在35℃時達到最大為3.93 U，當溫度繼續(xù)升高時，粗酶液的酶活力逐漸降低到0.39 U，所以鄰苯二酚1，2-雙加氧酶在35℃時酶活力最高。

圖6 pH值（A）、溫度（B）對酶活的影響

2.3.2 粗酶反應動力學的測定 固定酶的加入量，分別測定不同鄰苯二酚濃度（50-300 μmol/L）的降解速率，依據(jù)底物濃度和相應的酶促反應速率作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，如圖7所示，得到該酶作用于鄰苯二酚的米氏常數(shù)為25.68 μmol/L，最大反應速度為0.13 mol/（L·min）。米氏常數(shù)的大小反映酶和底物的親和程度，值越小說明酶和底物的親和力越好。本實驗測定的米氏常數(shù)為25.68 μmol/L，說明該酶與底物有較好的親和力。

圖7 鄰苯二酚1，2-雙加氧酶酶促反應動力學

2.3.3 苯甲酸1，2-雙加氧酶酶活測定 苯甲酸鈉1，2-雙加氧酶酶活測定如圖8，隨著反應時間的加長，粗酶液在340 nm下的吸收值不斷減小，在15 min內(nèi)NADH吸光度的變化值為0.42，說明反應體系中的NADH不斷被苯甲酸1，2-雙加氧酶氧化。

圖8 苯甲酸鈉1，2-雙加氧酶酶活測定

3 討論

鄰苯二酚作為一種常見環(huán)境激素化合物，具有易富集、難降解的特點，且毒性比苯酚大，同時其毒性能夠通過食物鏈進行傳遞和放大，對水生生物如水蚤、鮭魚等產(chǎn)生毒害作用，破壞海洋生態(tài)環(huán)境。雷忻等［14]研究發(fā)現(xiàn)，鄰苯二酚在48 h內(nèi)對模式生物泥鰍的半致死濃度為96.74 mg/L，并且當鄰苯二酚在泥鰍體內(nèi)聚集濃度越大，其毒性也會隨之增強。環(huán)境中鄰苯二酚的污染日益嚴重，而微生物修復作為一種經(jīng)濟有效的去除有機污染物的手段，成為目前最具有潛力的治理方式［15]。如張云波等［16]分離到一株石油烴降解菌JZ3-21，該菌株在接種量為1%時，30 d內(nèi)對1 000 mg/L的鄰苯二酚降解率達80.9%，其接種量小、底物濃度大，使菌株生長延滯期延長，在第5-10天時菌株生長才進入對數(shù)期，在第15天時菌株對鄰苯二酚的降解率僅有50%左右。而本研究所用菌株Tust-DM21在底物濃度為700 mg/L，接種量為3%時，菌株的延滯期很短僅有12 h左右，12 h后菌株進入對數(shù)生長期，在24 h時進入穩(wěn)定期，同時降解率也達到最高為90%。說明菌株Tust-DM21具有高效性，能夠在較短時間內(nèi)降解鄰苯二酚，并且降解率高達94.8%。Bastos等［17]分離到的酵母菌可降解濃度為1 500 mg/L苯酚。胡忠等［18]從海洋分離出的苯酚降解菌能耐受濃度為1 500 mg/L的苯酚，在3 d內(nèi)降解率高達95%以上。程珂珂等［9]分離純化出一株鄰苯二酚降解菌，并且能耐受濃度為600 mg/L的鄰苯二酚，當鄰苯二酚濃度為400 mg/L時，菌株在3 d內(nèi)對鄰苯二酚的降解率僅有45%左右。本菌株最大能夠耐受700 mg/L的鄰苯二酚，當濃度在700 mg/L以下時，菌株在2 d內(nèi)對鄰苯二酚的降解率高達90%以上，與已經(jīng)報道的菌株相比，該菌對鄰苯二酚耐受濃度為700 mg/L，菌株對鄰苯二酚適應性較差，這可能是由于該菌株是從渤海灣海洋石油勘探船廢油收集區(qū)分離純化出來，并非專門的酚類物質(zhì)降解菌，因此耐受性較差。此外，石油中成分復雜含有烷烴、芳香烴及多環(huán)芳烴等物質(zhì)，菌株對這些物質(zhì)的難易降解程度為烷烴＞芳香烴＞多環(huán)芳烴，因此菌株會優(yōu)先利用烷烴物質(zhì)來進行自身的生長代謝，在進一步利用難降解的芳香烴，這也可能導致菌株對鄰苯二酚的適應性較差。但本菌株除了具有高效降解石油的能力，如對烷烴的降解率高達98%，對環(huán)烴和芳香烴的降解率高達88%［8]，也能高效降解鄰苯二酚和苯甲酸鈉，其降解底物范圍廣才是本菌株的主要特性。

苯甲酸鈉廣泛應用于化工、食品和醫(yī)藥工業(yè)等領域，是一種常見的環(huán)境污染物。對一般微生物的最小抑菌濃度范圍為0.05%-0.1%，其毒性作用主要表現(xiàn)在：損害神經(jīng)系統(tǒng)；可致機體癌變（如苯甲酸鈉可以使染色體發(fā)生斷裂從而使機體癌變）；破壞細胞結(jié)構(gòu)等。目前已經(jīng)報道多種細菌能夠降解苯甲酸，如鹽單胞菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、紅假單胞菌屬和無色桿菌屬［19-23]等。蔡寶立等［24]分離出的不動桿菌BJ1菌株能降解1 000 mg/L苯甲酸鈉，降解率達98%以上。方艷芬等［25]篩選的菌株LS01能夠耐受濃度為6 000 mg/L的苯甲酸鈉，當濃度不超過3 000 mg/L 時，降解率能達到80%以上。苗艷芳等［26]分離篩選出來的菌株BJS3對苯甲酸的最大耐受濃度為6 000 mg/L，在苯甲酸濃度為3 000 mg/L時，菌株對苯甲酸的降解率僅有65%左右；當其濃度小于2 000 mg/L時，降解率高達80%以上。本實驗室保存的菌株Tust-DM21已鑒定為不動桿菌屬［27]，其對苯甲酸鈉的耐受濃度為4 500 mg/L，但當其濃度小于2 500 mg/L時，該菌株對苯甲酸鈉的降解率優(yōu)于蔡寶立、苗艷芳等分離純化出來的菌株，其降解率高達95%以上。菌株Tust-DM21對鄰苯二酚、苯甲酸鈉的降解特性研究表明，其對鄰苯二酚、苯甲酸鈉的最高降解率可達90%以上，其中鄰苯二酚的降解率最高達94.8%，苯甲酸鈉的降解率最高達97.6%。因此降解菌譜廣，降解能力高是該菌的主要特點。雖然菌株對鄰苯二酚、苯甲酸鈉的耐受濃度相對較低，但其對底物的適應范圍很廣，因此可以嘗試將該菌株與其他菌株混合，利用微生物之間的相互促進關系進行環(huán)境修復，以達到高效降解污染物的目的，彌補該菌株對鄰苯二酚、苯甲酸鈉耐受性差的缺點。該菌株可處理含酚、苯甲酸鈉廢水和被石油污染海洋，具有良好的應用前景。

正交試驗因其能夠快速找到最優(yōu)的試驗方案，而備受科研工作者的青睞。本試驗在做完單因素分析后，發(fā)現(xiàn)菌株在各個因素的最佳條件下其降解率在36 h內(nèi)最高能分別達到94.8%、97.6%，具有較高的降解效果，因此通過正交試驗探尋菌株降解鄰苯二酚、苯甲酸鈉的最優(yōu)條件以及降解率增加的空間已不大，出于成本考慮并未進行正交試驗。

本試驗所用的菌株Tust-DM21已完成基因組測序，發(fā)現(xiàn)含有鄰苯二酚1，2-雙加氧酶和苯甲酸1，2-雙加氧酶［27]，有較高的酶活。其中鄰苯二酚代謝途徑可能是先通過鄰苯二酚1，2-雙加氧酶鄰位途徑開環(huán)形成乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A［28]，再進入TCA循環(huán)。而苯甲酸鈉在其苯甲酸1，2-雙加氧酶的作用下先生成中間產(chǎn)物龍膽酸（2，5-Dihydroxy benzoic acid，DHB），然后在DHB脫氫酶的作用下在生成鄰苯二酚［29-30]，然后經(jīng)鄰位開環(huán)形成乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A進入TCA循環(huán)中。C12O在苯甲酸鈉和鄰苯二酚這兩個降解途徑中都發(fā)揮了重要作用，因此本研究只需測定C12O的米氏常數(shù)，Km的測定多以純酶為主［31]，但也有相關文獻用粗酶液測定Km，如艾芳芳等［32]測定粗酶液中C13O的Km為10.93 μmol/L。本研究測定菌株Tust-DM21的C12O為胞內(nèi)酶，其米氏常數(shù)為25.68 μmol/L，說明酶和底物的親和性較好，酶促反應容易進行。

4 結(jié)論

本實驗室分離純化出來的菌株Tust-DM21能夠高效的降解鄰苯二酚和苯甲酸鈉，可以耐受700 mg/L的鄰苯二酚和4 500 mg/L的苯甲酸鈉。菌株降解鄰苯二酚的最佳條件為：接種量5%、pH6.0、溫度35℃，在24 h內(nèi)對600 mg/L鄰苯二酚降解率達92%以上。菌株降解苯甲酸鈉的最佳條件為接種量3%、pH8.0、溫度35℃，在24 h內(nèi)對1 500 mg/L苯甲酸鈉的降解率達95%以上。通過測定鄰苯二酚1，2-雙加氧酶酶活，確定該酶的最適pH為8.0，最適溫度為35℃，其動力學參數(shù)為Km=25.68 μmol/L，Vmax=0.131 mol/（L·min）。