何文麗 施春英 殷佳 閻文靜 王海萍

［摘要］ 目的 觀察脊髓脫細(xì)胞基質(zhì)（SCDM）材料搭載人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）及堿性成纖維生長因子（bFGF）對大鼠脊髓損傷（SCI）的修復(fù)效果。

方法 制備SCDM并檢測其特性及生物相容性；對hMSCs及bFGF進(jìn)行體外細(xì)胞活性檢測。將實驗大鼠分為對照組、SCDM組、SCDM+hMSCs組和SCDM+hMSCs+bFGF組，4組大鼠均行脊髓完全橫斷損傷，后3組SCI后給予相應(yīng)治療。術(shù)后評價大鼠運動功能，4周后取出脊髓進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色及相關(guān)免疫熒光染色。

結(jié)果 SCDM+hMSCs+bFGF組大鼠術(shù)后運動功能評分顯著高于對照組及SCDM組。HE染色結(jié)果顯示，4組大鼠脊髓組織均有炎癥細(xì)胞浸潤，其中對照組大鼠炎癥細(xì)胞浸潤最明顯。SCDM+hMSCs+bFGF組損傷中心Tuj1、Nestin免疫熒光染色強(qiáng)度高于其余各組，而GFAP免疫熒光強(qiáng)度低于對照組及SCDM組。

結(jié)論 該復(fù)合生物支架材料具有促進(jìn)大鼠SCI修復(fù)的作用。

［關(guān)鍵詞］ 脊髓損傷；生物相容性材料；組織支架；臍帶；間充質(zhì)干細(xì)胞；成纖維細(xì)胞生長因子2

［中圖分類號］ R318.1;R651.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）01-0027-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.047

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20230308.1401.020.html;2023-03-10 09：10：30

EFFECT OF SPINAL CORD DECELLULARIZED MATRIX CARRYING HUMAN UMBILICAL CORD MESENCHYMAL STEM CELLS AND BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR IN TREATMENT OF RATS WITH SPINAL CORD INJURY

HE Wenli， SHI Chunying， YIN Jia， YAN Wenjing， WANG Haiping

（Department of Neurology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

; ［ABSTRACT］ ?Objective ?To investigate the effect of spinal cord decellularized matrix （SCDM） carrying human mesenchymal stem cells （hMSCs） and basic fibroblast growth factor （bFGF） on the repair of spinal cord injury （SCI） in rats.

Methods

SCDM was prepared and then tested in terms of characteristics and biocompatibility， and in vitro cell survival assay was performed for hMSCs and bFGF. Experimental rats were divided into control group， SCDM group， SCDM+hMSCs group， and SCDM+hMSCs+bFGF group; the rats in all four groups had complete spinal cord transection injury， and those in the latter three groups were given corresponding treatment after SCI. Motor function was evaluated after surgery， and the spinal cord was collected after four weeks for HE staining and immunofluorescent staining.

Results ?The SCDM+hMSCs+bFGF group had a significantly higher motor function score than the control group and the SCDM group. HE staining showed inflammatory cell infiltration in all four groups， with the most significant inflammatory cell infiltration in the control group. The SCDM+hMSCs+bFGF group had a significantly higher immunofluorescence intensity of Tuj1 and Nestin in the center of injury than the other three groups， as well as a significantly lower immunofluorescence intensity of GFAP than the control group and the SCDM group.

Conclusion ?This composite biological scaffold material can promote the repair of SCI in rats.

［KEY WORDS］ ?spinal cord injuries; biocompatible materials; tissue scaffolds; umbilical cord; mesenchymal stem cells; fibroblast growth factor 2

目前脊髓損傷（SCI）仍是病人致殘致死的重要因素，全球每年每百萬居民中有10.4～83.0人患SCI，臨床尚無有效治愈措施［1］。近年來，有多種神經(jīng)組織工程生物材料被用于損傷脊髓組織的修復(fù)，如膠原蛋白水凝膠、殼聚糖水凝膠等，這些生物材料作為支架移植為神經(jīng)元軸突再生提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)［2-4］。在脊髓組織修復(fù)過程中，治療的關(guān)鍵是構(gòu)建合適的生態(tài)微環(huán)境，鼓勵內(nèi)源性或外源性干細(xì)胞增殖、分化并促進(jìn)脊髓神經(jīng)組織再生［5-6］。脊髓脫細(xì)胞基質(zhì)（SCDM）具有高度組織特異性，除了能夠模擬生物體生態(tài)微環(huán)境外，還可以提供一些細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如tenascin C（TNC）和堿性成纖維生長因子（bFGF），而這是天然生物材料及合成類生物材料所不具備的特性［7-8］。此外，有研究結(jié)果表明，來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞向神經(jīng)元分化［9-10］。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）因具有較高的分化潛能、較低的免疫原性而被應(yīng)用于多種組織修復(fù)工程。hMSCs作為種子細(xì)胞移植入大鼠體內(nèi)，除了能誘導(dǎo)部分干細(xì)胞增殖分化外，還可以作為神經(jīng)再生的支持底物，建立細(xì)胞間信息傳遞，促進(jìn)細(xì)胞的存活［11］。bFGF可以誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化，同時具有保護(hù)神經(jīng)的作用［12］。因此，本研究采用SCDM生物材料作為支架，搭載hMSCs及bFGF后移植入脊髓完全橫斷的大鼠體內(nèi)，觀察該復(fù)合生物支架材料促進(jìn)神經(jīng)元分化、軸突再生及神經(jīng)組織重建的效果，以期為臨床治療SCI提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 SCDM的制備及特性檢測

新鮮的豬脊髓反復(fù)沖洗后，去除表面硬脊膜、血管膜等組織，用眼科剪剪成約2 cm長的小段。經(jīng)10 g/L的十二烷基硫酸鈉（SDS）及體積分?jǐn)?shù)0.01的Triton溶液反復(fù)作用，脫去脊髓中的各類細(xì)胞，得到脊髓脫細(xì)胞組織。將組織置入凍干機(jī)中真空冷凍48 h，得到SCDM。對SCDM進(jìn)行包埋并切片，在電鏡下觀察其表面特征，然后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色及Ⅰ型膠原蛋白免疫組織化學(xué)染色，于光鏡下觀察并拍照。此外，將SCDM研磨成粉，在室溫下用胃蛋白酶消化后離心，在4 ℃下取上清液與0.1 mol/L NaOH混合，置于37 ℃溫箱中凝膠化，得到SCDM水凝膠，用于體外細(xì)胞活性檢測。

1.2 體外細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞活性檢測

為檢測SCDM作為生物支架的生物相容性，將hMSCs分別接種在SCDM（3D組）及不含SCDM材料（對照組）中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后進(jìn)行鈣黃綠素染色，觀察細(xì)胞在材料上的生長情況。為觀察bFGF濃度及SCDM對hMSCs細(xì)胞增殖的影響，將48孔板分為對照組（不含SCDM水凝膠）及SCDM組（加入100 μL SCDM水凝膠），將狀態(tài)良好的hMSCs加入48孔板中（培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)0.01胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液），同時加入不同濃度梯度的bFGF（0、312.5、625.0、1 250.0 nmol/L），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，取出48孔板，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入20 μL噻唑藍(lán)（MTT），置于37 ℃培養(yǎng)4 h，吸出MTT，加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），室溫?fù)u床（100 r/min）孵育10 min，每孔吸取50 μL置于96孔板中，在波長492 nm下測量吸光度值。

1.3 動物分組及處理

SD大鼠（體質(zhì)量230～250 g）購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。本研究實驗程序均按照動物使用和護(hù)理指南進(jìn)行，并經(jīng)青島大學(xué)相關(guān)管理部門批準(zhǔn)。實驗共使用32只SD大鼠，隨機(jī)分為對照組（SCI后未經(jīng)任何治療）、SCDM組（SCI后給予SCDM支架移植治療）、SCDM+hMSCs組（SCI后給予SCDM支架+hMSCs移植治療）和SCDM+hMSCs+bFGF組（大鼠SCI后給予SCDM支架+hMSCs+bFGF移植治療），每組8只。SCI模型制備：大鼠麻醉后，在T9～T13椎體水平進(jìn)行皮膚切口，移除T10和T11椎板，露出脊髓，使用顯微剪剪去一段3 mm長的脊髓。SCDM+hMSCs+bFGF組生物支架制作方法：將培養(yǎng)至第5代細(xì)胞密度為80%～90%的hMSCs用TrypLETM Express酶消化后置于EP管中；將100 ng bFGF溶于100 μL無菌PBS中（濃度為1 mg/L），取10 μL含有bFGF的PBS溶液，加入到含有hMSCs的EP管中，用移液槍混勻；將SCDM生物材料浸泡在此溶液中，待hMSCs及bFGF充分浸潤生物材料后，生物支架制備完成。SCDM組則將SCDM材料浸泡在10 μL不含有bFGF及hMSCs的PBS溶液中，SCDM+hMSCs組則將SCDM材料浸潤在含有hMSCs的10 μL PBS溶液中，制備生物支架。將制備好的生物支架移植入大鼠脊髓橫斷3 mm后的SCI部位（出血已控制），用6-0可吸收縫合線密實縫合大鼠脊椎椎旁肌肉，觀察無液體滲漏、無出血后，用6-0可吸收縫合線縫合大鼠背部筋膜層，觀察無滲液和出血后，用4-0不可吸收縫合線縫合大鼠背部皮膚，并用碘附消毒。

1.4 開放場地運動行為學(xué)評估

在SCI后4周內(nèi)，采用Basso、Beattie和Bresna-

han試驗（BBB）評估大鼠后肢運動功能，在術(shù)后第0、1、2、3和4周采用雙盲法對大鼠進(jìn)行運動功能評分并記錄數(shù)據(jù)。

1.5 組織學(xué)檢測

于SCI后第4周處死大鼠，取出脊髓組織，置40 g/L多聚甲醛中固定48 h，蔗糖脫水，OCT包埋，制備冷凍切片（7 μm）。分別進(jìn)行HE染色及免疫熒光染色。所用一抗包括兔抗Tuj1（1∶500，美國Abcam）、兔抗GFAP（1∶300，美國CST）和鼠抗Nestin（1∶300，美國CST）。染色完成后在奧林巴斯熒光顯微鏡下觀察，使用AJ-VERT圖像查看器捕獲圖像，應(yīng)用ImageJ 1.53c軟件對免疫熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 5及SPSS 23軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。各組細(xì)胞活性檢測吸光度值的比較采用析因設(shè)計方差分析，各組運動行為學(xué)評分的比較采用多組重復(fù)測量設(shè)計方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法；各組Tuj1、Nestin、GFAP免疫熒光強(qiáng)度的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey法。P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)? 果

2.1 SCDM的特性

HE染色顯示，SCDM材料中不含有細(xì)胞成分。Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色顯示，SCDM中含有豐富的Ⅰ型膠原蛋白，可以為細(xì)胞提供良好的黏附位點。電鏡觀察顯示，SCDM具有多孔結(jié)構(gòu)，可為細(xì)胞提供棲息環(huán)境。見圖1。

2.2 SCDM的生物相容性

對照組及3D組細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，進(jìn)行鈣黃綠素染色，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照組hMSCs多呈梭形生長，胞體較大，部分細(xì)胞為球形；而3D組hMSCs胞體較小，細(xì)胞形態(tài)為梭形并黏附于SCDM材料上生長。MTT結(jié)果顯示，隨bFGF濃度升高，細(xì)胞增殖數(shù)量增多，于625.0 nmol/L濃度時達(dá)到峰值，隨后細(xì)胞數(shù)量不再增加。析因設(shè)計方差分析表明，bFGF濃度和SCDM對hMSCs數(shù)量影響不存在交互作用（FSCDM=20.697，P＜0.05；FbFGF濃度=2.165，P＞0.05；FbFGF濃度*SCDM=1.117，P＞0.05）。單獨效應(yīng)分析結(jié)果顯示，在bFGF濃度為312.5、625.0及1 250.0 nmol/L條件下，3D組細(xì)胞數(shù)量顯著多于對照組（P＜0.05），表明SCDM是影響細(xì)胞數(shù)量的獨立因素。見圖2A～E。

2.3 運動功能評分

SCI術(shù)后第0、1、2、3、4周分別對大鼠進(jìn)行運動功能評分。多組重復(fù)測量設(shè)計方差分析表明，大鼠術(shù)后治療方式與時間之間具有交互作用（F組別=94.943，F(xiàn)時間=1 614.985，F(xiàn)組別*時間=49.162，P＜0.05）。兩兩比較顯示，SCDM+hMSCs+bFGF組

大鼠在第2、3、4周的運動功能評分均明顯高于對照組和SCDM組，差異具有顯著意義（P＜0.05）。見圖2F。

2.4 HE染色

本文4組脊髓組織均有炎癥細(xì)胞浸潤，其中對照組炎癥細(xì)胞浸潤最明顯。與對照組和SCDM組相比，SCDM+hMSCs+bFGF組大鼠脊髓移植部位周圍的線性纖維組織密度和細(xì)胞浸潤顯著增加。見圖3。

2.5 SCDM材料搭載hMSCs及bFGF治療對SCI大鼠神經(jīng)軸突再生的影響

Tuj1用于軸突免疫熒光染色。術(shù)后第4周，各組脊髓組織分界面均可見Tuj1陽性細(xì)胞，其中對照組損傷部位僅出現(xiàn)少量Tuj1陽性細(xì)胞。4組Tuj1免疫熒光強(qiáng)度比較差異有顯著意義（F=40.450，P＜0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，SCDM+hMSCs+bFGF組損傷部位的Tuj1免疫熒光強(qiáng)度均高于其他各組，差異有顯著意義（P＜0.05）。見圖4。

Nestin抗體用于檢測SCI后神經(jīng)干細(xì)胞的存在。術(shù)后第4周，SCDM+hMSCs+bFGF組脊髓組織損傷部位存在較多的Nestin陽性細(xì)胞。4組Nestin免疫熒光強(qiáng)度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.970，P＜0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，SCDM+hMSCs+bFGF組損傷部位的Nestin免疫熒光強(qiáng)度顯著高于其他各組，差異有顯著意義（P＜0.05）。見圖5。

GFAP免疫熒光染色用于檢測SCI區(qū)的陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞。術(shù)后第4周，各組脊髓組織SCI部位均有GFAP陽性細(xì)胞。4組GFAP免疫熒光強(qiáng)度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=27.000，P＜0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，SCDM+hMSCs+bFGF組損傷部位的GFAP免疫熒光強(qiáng)度低于對照組和SCDM組，差異有顯著意義（P＜0.05）。見圖6。

3 討? 論

軸突再生在SCI的治療中起著關(guān)鍵作用，神經(jīng)細(xì)胞的丟失和繼發(fā)性損傷使嚴(yán)重SCI病人難以康復(fù)［13］。研究表明，促進(jìn)神經(jīng)元再生和軸突延伸是修復(fù)SCI的主要方式。生物材料一直是神經(jīng)再生和組織工程領(lǐng)域的研究熱點，它不僅可以為軸突延伸提供物理支持，還可以為各種細(xì)胞和藥物提供輸送系統(tǒng)。大量的天然和合成高分子生物材料已被用作組織工程的支架材料，如膠原蛋白、殼聚糖、聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）及聚乙二醇（PEG）等［14］。然而，天然生物材料難以模擬細(xì)胞外基質(zhì)成分和復(fù)雜的生態(tài)微環(huán)境；對于合成類材料而言，它們具有降解能力，可以用作植入物，但PLGA等合成類材料的降解會導(dǎo)致周圍環(huán)境呈酸性，可能增強(qiáng)炎癥反應(yīng)［15］。

與天然材料和合成類材料相比，SCDM模擬了實際的脊髓基質(zhì)生態(tài)微環(huán)境，具有更高的孔隙率，從而增強(qiáng)了神經(jīng)干/祖細(xì)胞的遷移、增殖能力。而且，SCDM具有特定的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，例如TNC和bFGF，它們參與調(diào)節(jié)神經(jīng)干/祖細(xì)胞的分化［8］。此外，Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色證實SCDM含有Ⅰ型膠原成分。SCDM的以上特性促進(jìn)了hMSCs黏附，模擬了細(xì)胞存活的生態(tài)微環(huán)境［16］。本研究在SCDM材料上體外培養(yǎng)hMSCs，結(jié)果顯示，SCDM具有良好的生物相容性，并可為細(xì)胞提供適宜的黏附位點。細(xì)胞活性檢測結(jié)果提示，bFGF在一定濃度梯度范圍內(nèi)具有促進(jìn)hMSCs細(xì)胞增殖的作用。動物實驗結(jié)果顯示，用從豬脊髓中提取的SCDM生物材料搭載hMSCs及bFGF治療脊髓完全橫斷的大鼠，術(shù)后第4周，SCDM+hMSCs+bFGF組TuJ1陽性細(xì)胞及Nestin陽性神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量明顯高于其他各組，而GFAP陽性膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯低于對照組和SCDM組。提示該生物材料填充了脊髓組織缺損區(qū)，誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移進(jìn)入損傷區(qū)域，促進(jìn)了神經(jīng)元增殖分化及神經(jīng)軸突再生。

綜上所述，本研究構(gòu)建了一種搭載hMSCs及bFGF的功能性SCDM支架，該功能性支架移植到SCI部位可為神經(jīng)軸突再生提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ)，引導(dǎo)損傷部位軸突生長，促進(jìn)功能恢復(fù)。本研究結(jié)果為臨床治療SCI病人提供了新思路。

［參考文獻(xiàn)］

［1］WYNDAELE M， WYNDAELE J J. Incidence， prevalence and epidemiology of spinal cord injury： what learns a worldwide literature survey［J］？ Spinal Cord， 2006，44（9）：523-529.

［2］YANG Y M， FAN Y H， ZHANG H P， et al. Small molecules combined with collagen hydrogel direct neurogenesis and migration of neural stem cells after spinal cord injury［J］.? Biomaterials， 2021，269：120479.

［3］CHEDLY J， SOARES S， MONTEMBAULT A， et al. Physical chitosan microhydrogels as scaffolds for spinal cord injury restoration and axon regeneration［J］.? Biomaterials， 2017，138：91-107.

［4］SOARES S， VON BOXBERG Y， NOTHIAS F. Repair stra-

tegies for traumatic spinal cord injury， with special emphasis on novel biomaterial-based approaches［J］.? Revue Neurologique， 2020，176（4）：252-260.

［5］STENUDD M， SABELSTRM H， FRISN J. Role of endo-

genous neural stem cells in spinal cord injury and repair［J］.? JAMA Neurology， 2015，72（2）：235-237.

［6］AHUJA C S， MOTHE A， KHAZAEI M， et al. The leading edge： emerging neuroprotective and neuroregenerative cell-based therapies for spinal cord injury［J］.? STEM CELLS Translational Medicine， 2020，9（12）：1509-1530.

［7］SALDIN L T， CRAMER M C， VELANKAR S S， et al. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues： structure and function［J］.? Acta Biomaterialia， 2017，49：1-15.

［8］XU Y W， ZHOU J， LIU C C， et al. Understanding the role of tissue-specific decellularized spinal cord matrix hydrogel for neural stem/progenitor cell microenvironment reconstruction and spinal cord injury［J］.? Biomaterials， 2021，268：120596.

［9］BUCKENMEYER M J， MEDER T J， PREST T A， et al. Decellularization techniques and their applications for the repair and regeneration of the nervous system［J］.? Methods （San Diego， Calif）， 2020，171：41-61.

［10］MEDBERRY C J， CRAPO P M， SIU B F， et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix［J］.? Biomaterials， 2013，34（4）：1033-1040.

［11］LV B， ZHANG X， YUAN J S， et al. Biomaterial-supported MSC transplantation enhances cell-cell communication for spinal cord injury［J］.? Stem Cell Research & Therapy， 2021，12（1）：36.

［12］CHEN B， HE J Y， YANG H， et al. Repair of spinal cord injury by implantation of bFGF-incorporated HEMA-MOETACL hydrogel in rats［J］.? Scientific Reports， 2015，5：9017.

［13］QUADRI S A， FAROOQUI M， IKRAM A， et al. Recent update on basic mechanisms of spinal cord injury［J］.? Neurosurgical Review， 2020，43（2）：425-441.

［14］LI X， LIU D Y， XIAO Z F， et al. Scaffold-facilitated locomotor improvement post complete spinal cord injury： motor axon regeneration versus endogenous neuronal relay formation［J］.? Biomaterials， 2019，197：20-31.

［15］HE L M， ZHANG Y Q， ZENG C G， et al. Manufacture of PLGA multiple-channel conduits with precise hierarchical pore architectures and in vitro/vivo evaluation for spinal cord injury［J］.? Tissue Engineering Part C，

Methods， 2009，15（2）：243-255.

［16］HUANG F F， GAO T Y， WANG W Q， et al. Engineered basic fibroblast growth factor-overexpressing human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells improve the proliferation and neuronal differentiation of endogenous neural stem cells and functional recovery of spinal cord injury by activating the PI3K-Akt-GSK-3β signaling pathway［J］.? Stem Cell Research & Therapy， 2021，12（1）：468.

（本文編輯 馬偉平）