陳 玲 李 楠 楊建樂(lè)

肝衰竭是由諸多因素引起的肝細(xì)胞廣泛性壞死,以黃疸、凝血功能障礙為主要表現(xiàn)的一組臨床綜合征[1]。肝衰竭常伴有肝外器官衰竭,28天病死率為50%～90%[2]。目前,對(duì)于肝衰竭患者,往往采用保守支持治療手段來(lái)緩解癥狀并保護(hù)肝功能。肝移植可能是其他治療手段效果不佳時(shí)的唯一治療方法[3]。而調(diào)控miRNA表達(dá)能夠有效減輕肝細(xì)胞損傷進(jìn)而改善肝衰竭[4]。因此,尋找miRNA作為肝衰竭新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn),改變miR-5590-5p的表達(dá)水平能夠調(diào)控D-半乳糖胺和脂多糖(D-galactosamine and LPS,D-GalN/LPS)誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。本研究進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot法、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和RNA免疫共沉淀等檢測(cè)手段深入探究miR-5590-5p在肝衰竭中的調(diào)控機(jī)制,為肝衰竭患者提供新的治療靶點(diǎn)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：L02細(xì)胞(人正常肝細(xì)胞系)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海);RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;D-半乳糖胺(D-GalN)和脂多糖(LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胰蛋白酶、裂解液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)試劑盒和Trizol試劑等均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;pmirGLO載體購(gòu)自美國(guó)Promega公司;miRNA-NC、miR-5590-5p模擬物、環(huán)狀RNA circLRP6、sh-circLRP6、OE-C5aR1和慢病毒包裝質(zhì)粒來(lái)源于上海GenePharma公司;C5aR1、β-actin、Ago-2抗體和IgG抗體等購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;RNA免疫共沉淀試劑盒購(gòu)自德國(guó)Merck KgaA公司;環(huán)狀RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

2.細(xì)胞模型構(gòu)建及藥物干預(yù)分組：L02細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中培養(yǎng),并置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。L02細(xì)胞在44μg/ml D-半乳糖胺(D-GalN)和100ng/ml脂多糖(LPS)中處理24h后獲得肝衰竭細(xì)胞模型。對(duì)照組為正常培養(yǎng)的L02細(xì)胞;D-GalN/LPS組為D-GalN/LPS誘導(dǎo)的L02細(xì)胞。D-GalN/LPS+miRNA-NC組為慢病毒在D-GalN/LPS誘導(dǎo)的L02細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-NC質(zhì)粒;D-GalN/LPS+miR-5590-5p模擬物組為慢病毒在D-GalN/LPS誘導(dǎo)的L02細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-5590-5p模擬物質(zhì)粒。IgG組為陰性對(duì)照抗體組;Ago2組為Argonaute 2抗體組。D-GalN/LPS+shRNA組為慢病毒在D-GalN/LPS誘導(dǎo)的L02細(xì)胞中轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒;D-GalN/LPS+sh-circLRP6組為慢病毒在D-GalN/LPS誘導(dǎo)L02細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-circLRP6質(zhì)粒;D-GalN/LPS+sh-circLRP6+OE-NC組為慢病毒在D-GalN/LPS誘導(dǎo)L02細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-circLRP6+OE-NC質(zhì)粒;D-GalN/LPS+sh-circLRP6+OE-C5aR1組為慢病毒在D-GalN/LPS誘導(dǎo)L02細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-circLRP6+OE-C5aR1質(zhì)粒。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：根據(jù)Annexin V-FITC/PI檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明,取L02細(xì)胞加入5μl Annexin V-/FITC避光反應(yīng)20min后,再加入5μl PI避光反應(yīng)20min,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)染色細(xì)胞凋亡。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)檢測(cè)：首先使用Trizol試劑收集L02細(xì)胞的總RNA,然后采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix)和miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別合成cDNA,然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行RT-qPCR,分別以GAPDH和U6為內(nèi)參,使用2-ΔΔCT法計(jì)算基因circLRP6和miR-5590-5p相對(duì)表達(dá)水平。引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列：circLRP6上游引物：5′-CACCAAAGGCACTTACTTCCCT-3′,下游引物：5′-AACTGATCAATTAAACAAAGCACTGT-3′;miR-5590-5p上游引物：5′-GCTGCGTTGCCATACATAGAC-3′,下游引物：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′;GAPDH上游引物：5′-GCATCCTGGGCTACACTG-3′,下游引物：5′-TGGTCGTTGAGGGCAAT-3′;U6上游引物：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAAC-3′,下游引物：5′-GCTTCACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′。

5.Western blot法檢測(cè)：L02細(xì)胞用RIPA裂解液提取總蛋白質(zhì),采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度,經(jīng)凝膠電泳分離,然后轉(zhuǎn)移至PDVF膜上,用5%脫脂牛奶封閉1h后與一抗(C5aR1,1∶1000,β-actin,1∶1000)在4℃反應(yīng)過(guò)夜,后與二抗(IgG/HRP,1∶2000)反應(yīng)1h,最后收集ECL顯影的蛋白條帶。

6.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)：將C5aR1基因3′UTR序列(WT-C5aR1),C5aR1基因3′UTR序列的突變型(MT-C5aR1),野生型質(zhì)粒circLRP6(WT-circLRP6)以及突變型質(zhì)粒circLRP6(MT-circLRP6)克隆到基因載體pmirGLO中,構(gòu)建野生型和突變型的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒載體。根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)試劑盒的使用方法檢測(cè)L02細(xì)胞的miRNA-NC和miR-5590-5p模擬物對(duì)WT-C5aR1、MT-C5aR1以及WT-circLRP6和MT-circLRP6熒光素酶活性的影響,利用螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值計(jì)算熒光素酶活性。

7.RNA免疫共沉淀檢測(cè)：使用RNA免疫共沉淀試劑盒檢測(cè)L02細(xì)胞中circLRP6、miR-5590-5p與Ago-2抗體的結(jié)合情況。用裂解緩沖液裂解L02細(xì)胞后離心30min,取上清液與Ago-2抗體和IgG抗體的磁珠一同孵育。然后,將他們?cè)?℃下孵育4h后,用緩沖液洗滌3次后獲得磁珠。最后,從磁珠中提取RNA利用RT-qPCR測(cè)定circLRP6和miR-5590-5p的相對(duì)表達(dá)水平。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)且多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.構(gòu)建體外細(xì)胞模型：本研究通過(guò)D-GalN/LPS誘導(dǎo)人肝細(xì)胞L02構(gòu)建體外肝衰竭細(xì)胞模型。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,結(jié)果發(fā)現(xiàn),D-GalN/LPS處理后,肝衰竭細(xì)胞模型L02細(xì)胞凋亡率顯著上升,肝衰竭細(xì)胞模型構(gòu)建成功(圖1A)。此外,RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,D-GalN/LPS組circLRP6表達(dá)上調(diào),而miR-5590-5p表達(dá)下調(diào)(圖1B,P<0.05)。Western blot法檢測(cè)表明,與對(duì)照組比較,D-GalN/LPS組的C5aR1蛋白表達(dá)上調(diào)(圖1C)。

圖1 構(gòu)建體外細(xì)胞模型A.流式細(xì)胞儀檢測(cè)L02細(xì)胞凋亡;B.RT-qPCR檢測(cè)L02細(xì)胞中circLRP6和miR-5590-5p的表達(dá);C.Western blot法檢測(cè)L02細(xì)胞中C5aR1蛋白的表達(dá)

2.miR-5590-5p改善肝細(xì)胞損傷：RT-qPCR檢測(cè)顯示,與D-GalN/LPS+miRNA-NC組比較,D-GalN/LPS+miR-5590-5p模擬物組的miR-5590-5p表達(dá)水平顯著升高(圖2A,P<0.05)。同時(shí),流式細(xì)胞儀檢測(cè)L02細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn),與D-GalN/LPS+miRNA-NC組比較,D-GalN/LPS+miR-5590-5p模擬物組L02細(xì)胞凋亡率顯著下降(圖2B)。

圖2 miR-5590-5p改善肝細(xì)胞損傷A.RT-qPCR檢測(cè)miR-5590-5p的表達(dá);B.流式細(xì)胞儀檢測(cè)L02細(xì)胞凋亡

3.circLRP6直接結(jié)合miR-5590-5p：通過(guò)circBank數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)circLRP6與miR-5590-5p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。然后,本研究通過(guò)RNA免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與IgG組比較,Ago2組的circLRP6和miR-5590-5p的表達(dá)水平顯著升高(圖3B)。此外,進(jìn)一步雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明,與miRNA-NC組比較,miR-5590-5p模擬物組顯著降低了WT-circLRP6熒光素酶活性,而MT-circLRP6熒光素酶活性不變(圖3C),表明circLRP6可直接結(jié)合miR-5590-5p。

圖3 circLRP6直接結(jié)合miR-5590-5pA.circLRP6和miR-5590-5p的結(jié)合位點(diǎn);B.circLRP6和miR-5590-5p的表達(dá)水平;C.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)WT-circLRP6和MT-circLRP6的熒光素酶活性

4.miR-5590-5p直接調(diào)控C5aR1：TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-5590-5p與C5aR1存在結(jié)合位點(diǎn)(圖4A),同時(shí),RT-qPCR檢測(cè)顯示,與miRNA-NC比較,miR-5590-5p模擬物組的miR-5590-5p表達(dá)升高而miR-5590-5p拮抗劑組的miR-5590-5p表達(dá)降低(圖4B,P<0.05)。此外,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與miRNA-NC比較,miR-5590-5p模擬物組顯著降低了WT-C5aR1熒光素酶活性,而MT-C5aR1熒光素酶活性不變(圖4C,P<0.01)。Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與miRNA-NC組比較,miR-5590-5p模擬物組的C5aR1蛋白表達(dá)降低而miR-5590-5p拮抗劑組的C5aR1蛋白表達(dá)升高(圖4D)。

圖4miR-5590-5p直接調(diào)控C5aR1A.C5aR1和miR-5590-5p的結(jié)合位點(diǎn);B.RT-qPCR檢測(cè)L02細(xì)胞中miR-5590-5p的表達(dá);C.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)WT-C5aR1和MT-C5aR1的熒光素酶活性;D.Western blot法檢測(cè)L02細(xì)胞中C5aR1的蛋白表達(dá)

5.circLRP6介導(dǎo)miR-5590-5p靶向C5aR1改善肝細(xì)胞損傷：深入分析circLRP6、miR-5590-5p和C5aR1三者在D-GalN/LPS誘導(dǎo)L02細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制。RT-qPCR和Western blot法結(jié)果顯示,與D-GalN/LPS+shRNA組比較,D-GalN/LPS+sh-circLRP6組circLRP基因和C5aR1蛋白表達(dá)下調(diào);同時(shí),與D-GalN/LPS+sh-circLRP6+OE-NC組比較,D-GalN/LPS+sh-circLRP6+OE-C5aR1組C5aR1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(圖5中A、B,P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與D-GalN/LPS+shRNA組比較,D-GalN/LPS+sh-circLRP6組的L02細(xì)胞凋亡率顯著下降;而與D-GalN/LPS+sh-circLRP6+OE-NC組比較,D-GalN/LPS+sh-circLRP6+OE-C5aR1組的L02細(xì)胞凋亡率上升(圖5C)。

討 論

肝衰竭的病理表現(xiàn)為肝臟大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞凋亡和壞死,病情進(jìn)展迅速,進(jìn)而可導(dǎo)致多器官衰竭[5]。目前,D-GalN/LPS被廣泛用于構(gòu)建體外肝衰竭細(xì)胞模型,且用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)肝衰竭的保護(hù)作用[6]。本研究證明了上調(diào)miR-5590-5p的表達(dá)能夠改善D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。

肝衰竭具有復(fù)雜的病理調(diào)控機(jī)制,其中肝細(xì)胞凋亡是肝衰竭早期的重要病理表現(xiàn)[7]。研究表明細(xì)胞凋亡是一種常見(jiàn)的細(xì)胞死亡形式,其參與多種肝臟疾病的病情發(fā)展[8]。四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化老鼠模型顯示促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3表達(dá)上調(diào)而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào),進(jìn)而引起肝細(xì)胞的凋亡[9]。因此,細(xì)胞凋亡通路在肝衰竭中發(fā)揮重要作用,研究肝細(xì)胞凋亡在肝衰竭中具有重要意義。本研究首先構(gòu)建了體外肝衰竭細(xì)胞模型,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),D-GalN/LPS誘導(dǎo)L02細(xì)胞的大規(guī)模凋亡。同時(shí),上調(diào)miR-5590-5p的表達(dá)水平能夠降低D-GalN/LPS誘導(dǎo)L02細(xì)胞凋亡,進(jìn)而改善D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。這些結(jié)果表明,miR-5590-5p能夠改善D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。

miR-5590-5p在肝衰竭中表現(xiàn)出積極的作用。近年來(lái)研究表明,miR-5590能夠抑制淋巴瘤的進(jìn)展和免疫逃避,也可抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)其凋亡[10,11]。然而,miR-5590-5p在肝衰竭中的作用尚不清楚。因此本研究主要探究miR-5590-5p在肝衰竭中的作用機(jī)制。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),circLRP6與miR-5590-5p存在結(jié)合作用,并通過(guò)RNA免疫共沉淀和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析證實(shí)circLRP6能夠直接與miR-5590-5p結(jié)合。越來(lái)越多的證據(jù)表明,環(huán)狀RNA廣泛參與細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程,且circLRP6能夠調(diào)控癌細(xì)胞的增殖和侵襲[12]。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),miR-5590-5p與C5aR1存在結(jié)合作用。C5aR1在補(bǔ)體激活過(guò)程中發(fā)揮重要作用,在D-GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠肝衰竭模型中,C5aR表達(dá)上調(diào),使用C5aR拮抗劑能夠減輕D-GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠肝組織損傷和提高小鼠存活率[13]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-5590-5p可以直接調(diào)控C5aR1。同時(shí),深入分析circLRP6、miR-5590-5p和C5aR1在D-GalN/LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制。circLRP6介導(dǎo)miR-5590-5p靶向C5aR1來(lái)降低L02細(xì)胞凋亡率。綜上所述,circLRP6可能通過(guò)介導(dǎo)miR-5590-5p靶向C5aR1來(lái)改善D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。

綜上所述,本研究證明了miR-5590-5p可有效降低D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),circLRP6可以結(jié)合miR-5590-5p,且miR-5590-5p可以直接調(diào)控C5aR1來(lái)保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷。同時(shí),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miR-5590-5p通過(guò)靶向C5aR1來(lái)降低L02細(xì)胞凋亡率。因此,筆者認(rèn)為circLRP6介導(dǎo)的miR-5590-5p靶向C5aR1來(lái)降低L02細(xì)胞凋亡從而改善D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果將為miR-5590-5p作為肝衰竭新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。