陸嘉欣 吳 旭 蔣永亮

低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是一種嚴重的進展性綜合征,會使肺血管阻力上升甚至右心衰竭,最終導致死亡。目前其病理機制包括血管收縮、血管重構(gòu)、血栓形成和炎癥等關鍵因素。雖已有眾多研究針對HPH,但其病因仍未完全明確,闡明HPH的發(fā)病機制十分迫切和必要。

自噬可降解受損或不需要的細胞成分進行自我更新,在特定環(huán)境下對宿主有保護功能,自噬-溶酶體途徑通過降解蛋白質(zhì)聚集體或受損的細胞器維持細胞生長調(diào)節(jié)等活動以發(fā)揮促生存作用,但同時自噬功能受損也可轉(zhuǎn)變?yōu)榇偎劳鲆蛩亍ｋS著對自噬的深入探索,研究自噬在HPH的調(diào)控機制有望成為HPH治療靶點。

自噬過程涉及一系列分子事件,包括膜的啟動、成核、延長和閉合。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)可直接參與調(diào)控自噬。自噬關鍵蛋白Atg6(autophagy 6/Beciln1)是自噬過程中一個重要調(diào)節(jié)因子,其作為Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)復合物的主要部分調(diào)節(jié)自噬小體形成。Ⅲ類PI3K復合物和Atg38與質(zhì)膜結(jié)合,催化磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇3-磷酸,從而招募與磷脂酰肌醇3-磷酸結(jié)合的蛋白[1]。

一、細胞自噬通路

1.PI3K/Akt/mTOR通路：PI3K以二聚體形式存在,由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成。當外部刺激因子信號轉(zhuǎn)導至細胞后,p85結(jié)構(gòu)改變使PI3K正式啟動,同時激活其下游信號分子蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜上成為p-Akt,p-Akt將信號轉(zhuǎn)導到mTOR,mTOR激活泛素蛋白酶體途徑并調(diào)節(jié)自噬相關基因或其他下游底物,以發(fā)揮抑制自噬的生理效應。

2.FoxO1通路：轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O1(forkhead box O1,FoxO1)通路可激活自噬。在應激狀態(tài)下FoxO1與沉默信息調(diào)節(jié)因子1結(jié)合物分離后出現(xiàn)的形式為活化狀態(tài)的乙?；疐oxO1,此狀態(tài)下FoxO1在細胞質(zhì)內(nèi)與Atg7特異性結(jié)合激活細胞自噬[2]。而PI3K/Akt信號通路可使FoxO1磷酸化,磷酸化后FoxO1從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì),失去調(diào)節(jié)其目標基因的能力而抑制自噬。

3.BMPR2通路：骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2(bone morphogenetic protein receptor 2,BMPR2)拮抗劑noggin可減少腺泡細胞中空泡形成,下調(diào)微管相關蛋白1B-輕鏈3(microtubule-associated protein 1B light chain 3 beta,LC3B)水平,即BMPR2通路可促進自噬發(fā)生[3]。但同時自噬的上調(diào)可加重缺氧誘導的BMPR2功能障礙,進一步說明該通路與自噬存在相互影響甚至負反饋調(diào)節(jié)的潛在機制可能。自噬和BMPR2之間的聯(lián)系還可能存在于其他細胞信號通路中,因為自噬和BMPR2都參與β-catenin等信號通路。

4.MAPK信號通路：細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶 (c Jun N terminal kinase,JNK)、p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases,p38 MAPK)是MAPK的主要通路,以上通路皆可調(diào)節(jié)細胞自噬。JNK1正向調(diào)控自噬的機制如下：一方面,JNK1介導抗凋亡蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)磷酸化干擾其與Beclin1的結(jié)合,Beclin1表達上調(diào)促進自噬發(fā)生。另一方面,JNK1可增強損傷調(diào)節(jié)自噬調(diào)控基因(damage-regulated autophagy modulator,DRAM)的表達,從而使DRAM刺激Beclin1釋放以誘導自噬的發(fā)生[4]。馬乾等[5]在肺成纖維細胞中驗證補腎益肺消癥方機制之一可能是抑制JNK/p62(sequestosome 1)/Parkin通路減緩細胞線粒體自噬進程。ERK5可直接磷酸化unc-51樣激酶1(unc-51-like kinase 1,ULK1)來下調(diào)自噬,ERK5抑制自噬通量不依賴腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)和mTOR,而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應激活有關。p38 MAPK在自噬中為雙向調(diào)節(jié)因子,血紅素加氧酶-1抑制劑通過激活p38 MAPK途徑誘導Beclin1非依賴性自噬,而p38 MAPK活化還可誘導ULK1磷酸化,其破壞ULK1-Atg13復合物導致自噬減弱,這一過程存在Atg5蛋白的干預[6]。以上證明p38 MAPK通路通過激活下游不同信號分子在自噬調(diào)控中具有雙重作用。

5.NF-κB通路：核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路與自噬之間的聯(lián)系非常復雜,其可經(jīng)多種途徑參與自噬活動。死亡相關蛋白激酶1通過下游p38 MAPK/NF-κB途徑觸發(fā)炎性反應和自噬,共同導致肺損傷。與之相反的是二氧化硅納米粒子通過p62/NF-κB途徑可引起肺組織中的自噬功能障礙,NF-κB抑制劑BAY11-7821可通過激活自噬抑制膠質(zhì)瘤細胞異常增殖[7,8]。同時研究發(fā)現(xiàn),不同蛋白質(zhì)聚集應激可經(jīng)非典型途徑激活NF-κB,誘導自噬過程[9]。以上提示NF-κB可通過多種途徑參與自噬發(fā)生,并雙向調(diào)節(jié)其功能。

二、自噬在低氧肺動脈高壓中的作用

現(xiàn)有研究表明,自噬在肺血管細胞中的活動對HPH發(fā)生、發(fā)展具有雙重調(diào)控機制。Lee 等[10]驗證缺氧誘導肺動脈高壓(pulmonary hypertension,PH)的小鼠肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCS)及內(nèi)皮細胞(pulmonary artery endothelial cells,PAECS)中LC3B、Beclin1表達增加,同時實驗表明,血管細胞中活躍的LC3B可能部分抑制血管重塑的增殖過程,首次證實自噬對HPH調(diào)控具有雙面性。在HPH大鼠模型中,蓽茇酰胺治療后PASMCS和大鼠肺組織中LC3BⅡ/LC3BⅠ比值升高,蓽茇酰胺增加了PASMCS自噬通量,顯著抑制缺氧誘導的PASMCS增殖,提示自噬在肺血管重構(gòu)中起保護作用[11]。而葛根素通過抑制自噬減輕缺氧誘導的肺血管細胞周期進展和增殖,其可逆轉(zhuǎn)缺氧引起的PASMCS進入S期的增加,并使細胞停滯于G1期,提示自噬在肺血管重構(gòu)中可為推動因素[12]。這意味著自噬在HPH中存在完全相反作用,明確自噬相關通路在HPH中作用可為其治療提供未來新方向。

1.mTOR、NF-κB通路雙向調(diào)節(jié)低氧性肺動脈高壓形成：mTOR復合物1(mTORC1)和 mTOR 復合物 2(mTORC2)為mTOR兩類不同的蛋白激酶復合物。低氧條件下可激活二者,mTORC1抑制對營養(yǎng)敏感的自噬,而mTORC2可能對分子伴侶介導的自噬存在特異性,二者通過抑制自噬調(diào)控血管生成和細胞增殖：在缺氧條件下mTORC1具有早期激活和晚期抑制細胞增殖作用,而mTORC2則為延遲和維持的激活細胞增殖作用。實驗驗證抑制mTORC1可減輕PH,而抑制mTORC2可引起自發(fā)性PH,使用mTOR抑制劑和血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)受體抑制劑可顯著延緩HPH[13]。這可能與mTORC1主要調(diào)控與肺血管重構(gòu)關系緊密的巨自噬,而mTORC2則主要影響細胞存活和細胞骨架重塑,抑制mTORC2通路激活自噬更易受其他因素干擾影響其對肺血管細胞的保護作用有關。Yes相關蛋白表達下調(diào)可降低自身核定位,從而下調(diào)PI3K表達,抑制PDGF-BB誘導的Akt磷酸化激活自噬,改善肺血管重構(gòu)和右心室肥大。某些藥物如槲皮素、白藜蘆醇均可在HPH大鼠模型中干擾PI3K活性,通過下調(diào)PI3K/Akt/mTOR通路增強自噬,抑制PASMCS增殖[14]。這些研究表明,自噬激活可發(fā)揮抗增殖效果,自噬誘導劑對防止肺血管重構(gòu)有潛在作用。

而與之結(jié)論相反的是,Li等[15]發(fā)現(xiàn)Galectin-3蛋白可通過抑制瞬時受體電位通道(transient receptor potential canonical TRPC)1/4途徑和激活Akt/mTOR通路,抑制自噬最終抑制PAECS的增殖。愛帕琳肽通過激活mTOR通路抑制缺氧誘導的自噬來緩解大鼠PASMCS增殖和遷移,17β-雌二醇可上調(diào)愛帕琳肽來減輕PH誘導的右心室衰竭[16]。達可替尼通過mTOR通路抑制缺氧誘導的PASMCS細胞周期進程、增殖、遷移和自噬,減弱PASMCS從G0/G1期進入S期的進程,抑制肺動脈血管重構(gòu)[17]。目前達可替尼對HPH的治療仍處于臨床試驗階段。

以上研究表明,mTOR通路可雙向調(diào)控HPH的形成,這意味兩個mTOR復合體的信號不僅在肺血管細胞對缺氧的反應中存在協(xié)同機制,還可能受其他因素影響。以mTOR抑制劑或mTOR激活劑為基藥的聯(lián)合治療可能提供基于重要通路機制的治療HPH新方向。

NF-κB在HPH中也是調(diào)控肺血管重構(gòu)的重要原因,該通路可誘導自噬激活,進而下調(diào)Rho家族GTP酶3表達,促進HPH發(fā)展。同時低氧誘導NF-κB激活后上調(diào)PASMCS中細胞周期蛋白D1表達,導致細胞周期G1向S期轉(zhuǎn)變,從而促進PASMCS增殖。激活AMPK可抑制NF-κB的p65亞基從胞質(zhì)到胞核的移位,降低PH中自噬標志物蛋白水平。AMPK激動劑二甲雙胍抑制NF-κB介導的自噬激活,從而降低野百合堿(monocrotaline,MCT)誘導的PH的右心室收縮壓,首次揭示二甲雙胍抑制自噬和逆轉(zhuǎn)肺血管重塑的新機制[18]。而缺氧后PAECS中NF-κB表達增加,給予NF-κB抑制劑后缺氧誘導的Galectin-3蛋白下調(diào),而Galectin-3下調(diào)可增加LC3B表達,上調(diào) TRPC1/4和鈣蛋白酶的信使RNA和蛋白水平從而促進自噬,提示NF-κB可抑制自噬以促進HPH發(fā)生[19]。同時NF-κB受體激動劑可抑制PASMCS Atg5/Atg7/Beclin1/LC3依賴的自噬途徑,從而減輕肺血管重構(gòu)和功能障礙,提示該通路可抑制自噬以達到緩解HPH[20]。這表明NF-κB不僅可雙向調(diào)節(jié)自噬,還對肺動脈血管細胞增殖具有雙面調(diào)控機制,其涉及的下游信號通路仍需進一步探究。

2.低氧條件下抑制低氧性肺動脈高壓形成的自噬相關通路：FoxO1通路由FoxO1誘導recombinant sestrin 3 (SESN3)蛋白表達上調(diào)形成FoxO1-SENS3-mTOR,該通路使下游mTOR被抑制而自噬激活,最終減弱PASMCS增殖從而延緩HPH。吡非尼酮目前已用于特發(fā)性肺纖維化治療,研究證實在缺氧大鼠模型中,吡非尼酮劑量依賴地增加FoxO1水平及其核轉(zhuǎn)位,從而減弱PASMCS增殖和遷移能力,這意味著已投入臨床使用的吡非尼酮有望以抑制FoxO1為靶點機制激活自噬抑制HPH的形成,實現(xiàn)老藥新用這一擴展用藥[21]。而在MCT誘導大鼠PH模型中胞質(zhì)內(nèi)FoxO1升高可刺激自噬激活,紫杉醇通過抑制FoxO1介導的自噬,最終降低PH,提示FoxO1介導的自噬可促進肺血管重塑[22]。這也表明在非低氧誘導的PH動物模型下,FoxO1通路激活自噬后可能對肺血管重構(gòu)產(chǎn)生相反作用。

BMPR2突變及介導信號的紊亂是HPH易感因素之一。SIN3轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白家族成員A過表達后可阻斷BMPR2啟動子區(qū)域的甲基化上調(diào)BMPR2表達,最終抑制PASMCS增殖[23]。PAECS中上調(diào)BMPR2可逆轉(zhuǎn)低氧誘導的大鼠PH[24]。內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial to mesenchymal transition,ENDMT)被認為是肺動脈重構(gòu)重要因素,而BMPR2可抑制ENDMT。Liu等[25]在人PAECS證明miRNA-204下調(diào)后促進自噬以減弱缺氧誘導的ENDMT,其中BMPR2表達上調(diào),在一定程度上改善HPH,以上提示BMPR2通路或可通過抑制ENDMT促進自噬以抑制肺動脈血管重構(gòu)。低氧促有絲分裂因子誘導的PH中,高遷移率族蛋白-1信號下調(diào)BMPR2以抑制自噬,協(xié)同增強肺血管細胞增殖,同時實驗驗證低氧抑制的FoxO1可能是自噬和BMPR2下調(diào)之間聯(lián)系的一種機制,FoxO1、BMPR2這兩條通路可能通過某一共同靶點激活自噬,從而對HPH形成起抑制作用[26]。

3.低氧條件下促進低氧性肺動脈高壓形成的自噬相關通路：JNK通路除可使Beclin1游離后形成PI3K復合物促進自噬,還能介導自噬研究相關基因表達上調(diào)激活自噬。JNK可作為Toll樣受體-9下游效應分子參與調(diào)控缺氧時PASMCS增殖,使用JNK抑制劑可減少其磷酸化,降低該細胞增殖水平[27]。缺氧通過激活ERK、JNK和p38信號通路促進細胞增殖和抑制PASMCS凋亡,進而誘導肺血管重構(gòu)。Guo等[28]實驗證明,在體內(nèi)沉默recombinant notch homolog4(Notch4)重組蛋白可通過Notch4-ERK/JNK/p38MAPK軸部分抑制HPH大鼠的肺血管重構(gòu)。因此,JNK相關抑制劑有望成為抑制PASMCS增殖的藥物之一。

p38 MAPK通路一方面可導致自噬激活,這是由于其可誘發(fā)內(nèi)皮屏障功能障礙并可能破壞緊密連接。該通路激活同時使調(diào)節(jié)血管通透性的重要屏障蛋白下調(diào),最終導致肺血管病變和重塑。黃芩苷可通過下調(diào)p38 MAPK/基質(zhì)金屬蛋白酶9通路來減輕慢性缺氧引起的PH[29]。另一方面,p38 MAPK通路可抑制自噬發(fā)生,如骨橋蛋白通過此信號通路抑制PASMCS自噬,促進HPH形成[30]。本實驗也證實人抵抗素樣分子β可通過Ca2+內(nèi)流激活MAPK通路,抑制自噬進而誘導PASMCS增殖,提示鈣離子通道與自噬通路相關性[31]。與激活mTOR通路抑制自噬不同的是,p38 MAPK通路在肺血管細胞自噬過程中呈雙面性,其通過不同下游靶點抑制/激活自噬,皆可在PASMCS細胞增殖調(diào)控中起促進作用,這或許使p38 MAPK抑制劑成為治療HPH的前景靶向藥物成為可能。

ERK1/2通路活化能夠直接促進LC3表達上調(diào),自噬通量增加。ERK1/2抑制劑可減弱鈣蛋白酶-2的磷酸化從而減輕PASMCS增殖。醛脫氫酶2對PASMCS和HPH遷移和增殖具有保護作用,或是通過阻斷ERK1/2-Beclin1通路以抑制自噬來實現(xiàn)[32]。miRNA-205-5p可通過傳導細胞骨架調(diào)控蛋白(microtubule associated monoxygenase,calponin and LIM domain containing 2,MICAL2)促進PASMCs增殖,ERK1/2抑制劑阻斷MICAL2介導的對PASMCS增殖的促進作用。因此抑制ERK1/2可作為HPH治療的理想治療靶點。

ERK5屬于MAPK信號家族,可調(diào)節(jié)細胞增殖和分化、細胞存活等信號轉(zhuǎn)導。過表達ERK5可導致p62蛋白表達水平增加,LC3Ⅱ、Beclin1表達水平降低,細胞自噬受到抑制[33]。既往研究發(fā)現(xiàn),ERK5抑制劑可緩解博來霉素誘導的小鼠肺纖維化的作用。ERK5蛋白激酶協(xié)調(diào)激活信號,導致炎性細胞因子如白介素1β、基質(zhì)細胞衍生因子1、單核細胞趨化蛋白-1的增加,抑制自噬從而觸發(fā)右心室肥大過程。

上述研究證實自噬在HPH中的兩面性,這些相互矛盾的結(jié)果也可能是由于實驗條件的差異,如治療時間和氧氣水平、LC3B自噬通量增加的具體含義。在所有PH模型中,與真實人類PH發(fā)展相關的組織病理學改變、肺壓力和右心功能之間也可能存在不同。這些復雜因素也可能影響自噬在HPH中的具體作用,針對自噬與HPH之間的作用仍有待于進一步深入研究。目前為止,自噬調(diào)節(jié)療法的應用大多局限于實驗階段,只有少數(shù)能調(diào)節(jié)自噬的化合物被用于臨床,自噬激活劑如mTOR抑制劑雷帕霉素和自噬抑制劑如氯喹等,未來需要更多的研究提供新的實驗與理論依據(jù)。

三、展 望

近年來,臨床工作中發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病患者繼發(fā)HPH者逐年上升,特別是多見于老年患者。如何快速有效地診斷和干預HPH這一相關疾病,給臨床工作提出了新的要求和挑戰(zhàn)。越來越多的研究表明,HPH與自噬密不可分,但是具體關系及相關機制尚未完全明確,期待今后開展更多的相關研究進一步明確兩者關系及發(fā)病機制,為更好地診斷和治療HPH提供新的方向和思路。