黃 悅 曾 平 劉金富 陳莉華 陸冠宇 熊 波 陳 財(cái)

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣西南寧市 530022; 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨二科,廣西南寧市 530022)

骨關(guān)節(jié)炎是臨床上常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)疾病,其主要臨床表現(xiàn)包括慢性疼痛、關(guān)節(jié)不穩(wěn)定、僵硬、關(guān)節(jié)畸形等,影像學(xué)上表現(xiàn)為關(guān)節(jié)間隙狹窄等[1-3]。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展與炎癥因子、代謝因子密切相關(guān)[4-5]。關(guān)節(jié)鏡檢查、MRI檢查和超聲檢查均發(fā)現(xiàn)并證實(shí)早期骨關(guān)節(jié)炎存在滑膜增厚、水腫等滑膜形態(tài)學(xué)改變[6]。有研究表明,骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨損失程度和關(guān)節(jié)退化進(jìn)程與滑膜增生及促炎細(xì)胞因子的異常產(chǎn)生有關(guān)[7-10]?；さ牟±砀淖兺ǔ０l(fā)生在軟骨損傷之前[11],滑膜炎癥介質(zhì)和促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[12],但其病理機(jī)制尚未完全確定。研究表明,骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展可能是由多種基因和信號(hào)通路介導(dǎo)[13]。因此,研究骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的分子機(jī)制,對(duì)尋找有效的治療方法具有重要意義。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘找出骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),對(duì)其進(jìn)行功能和通路富集分析,并通過(guò)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)篩選關(guān)鍵基因。同時(shí),對(duì)骨關(guān)節(jié)炎常用的治療藥物進(jìn)行文本挖掘,對(duì)其藥物靶基因行進(jìn)一步鑒定。然后對(duì)最終確定的靶基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR以驗(yàn)證其結(jié)果,為了解骨關(guān)節(jié)炎的潛在發(fā)病機(jī)制及臨床治療藥物的使用提供分子依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)來(lái)源 在基因表達(dá)綜合(Gene Expression Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)[14](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中以“Osteoarthritis”為檢索詞進(jìn)行篩選。篩選條件:(1)實(shí)驗(yàn)對(duì)象為“Homo sapiens(人類(lèi))”;(2)數(shù)據(jù)集包括實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組;(3)平臺(tái)文件可以直接下載;(4)樣本組織來(lái)源均為膝關(guān)節(jié)滑膜組織;(5)檢索時(shí)間為2012年1月至2020年12月。得到符合條件的微陣列芯片GSE41038、GSE55235、GSE55457和GSE82107,基因表達(dá)譜樣本共包含33個(gè)骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織樣本和31個(gè)健康人滑膜組織樣本。見(jiàn)表1。

表1 4個(gè)數(shù)據(jù)集相關(guān)信息

1.2 方法

1.2.1 篩選DEGs:對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理和log2轉(zhuǎn)換,以最大限度地減少本次綜合分析所涉及不同數(shù)據(jù)集之間的異質(zhì)性。采用R語(yǔ)言軟件(https://www.r-project.org/,版本:4.0.3)的 ggplot2包篩選DEGs,設(shè)置調(diào)整后的P<0.05和|Log2FC|≥2為篩選標(biāo)準(zhǔn),生成火山圖。使用pheatmap包生成DEGs的分層聚類(lèi)分析熱圖。

1.2.2 DEGs富集分析:采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)[15]進(jìn)行DEGs的基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。GO功能富集分析包括生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分。設(shè)定基因數(shù)>2和P<0.05為篩選條件,依據(jù)校正后的P值降序排列,將生物學(xué)過(guò)程、分子功能、細(xì)胞成分富集分析的結(jié)果以柱狀圖展示。

1.2.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和模塊化分析:將所有DEGs的目標(biāo)基因名導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[16](https://string-db.org/),并使用Cytoscape軟件(版本3.7.2, http://www.cytoscape.org/)制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖,設(shè)置中等置信區(qū)間為0.4,分子復(fù)雜檢測(cè)插件參數(shù)為得分>5、degree值截止=2、節(jié)點(diǎn)截止分?jǐn)?shù)=0.2、最大深度=100、k-得分=2。通過(guò)Cytoscape軟件cytoHubba插件中的degree算法,篩選出degree值排名前10的核心靶點(diǎn),并評(píng)估PPI網(wǎng)絡(luò)中的中樞模塊,對(duì)分子復(fù)雜檢測(cè)插件參數(shù)得分較高的兩個(gè)模塊進(jìn)行下一步分析,得分最高的模塊定義為中樞模塊,得分第二高的模塊定義為次模塊。

1.2.4 藥物和靶基因鑒定:DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/)是一個(gè)免費(fèi)的綜合性藥物資源網(wǎng)站,其包含有關(guān)美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)的藥物和正在申請(qǐng)F(tuán)DA批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)藥物的藥物靶點(diǎn)、藥物功效和藥物相關(guān)作用的信息[17]。在DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中以 “Osteoarthritis”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,選擇“已批準(zhǔn)的藥物”,可篩選出50種治療骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)藥物,在藥物-基因相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)(Drug-Gene Interaction Database,DGIdb;https://www.dgidb.org/)中鑒定其分子靶標(biāo),將這些可能具有治療骨關(guān)節(jié)炎作用的靶基因與中樞模塊的關(guān)鍵基因取交集,得到藥物治療骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵基因,并制作PPI圖。

1.3 相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

1.3.1 臨床資料 選取2021年1—3月在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行診治的4例骨關(guān)節(jié)炎患者(實(shí)驗(yàn)組)和4例關(guān)節(jié)創(chuàng)傷患者(對(duì)照組)的滑膜組織用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證,患者均為男性,患者之間無(wú)親緣關(guān)系。實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[18]和手術(shù)治療指征;(2)年齡30～50歲;(3)自愿參與本研究并簽署知情同意書(shū)。實(shí)驗(yàn)組排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患有風(fēng)濕性骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的患者;(2)合并乙肝、結(jié)核、梅毒等傳染性疾病的患者;(3)合并嚴(yán)重心腦血管疾病、惡性腫瘤等原發(fā)性疾病的患者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)因外傷導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)骨折或韌帶損傷,需要進(jìn)行手術(shù)治療;(2)年齡30～50歲;(3)自愿參與本研究并簽署知情同意書(shū)。對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn):(1)診斷為骨關(guān)節(jié)炎的患者;(2)合并乙肝、結(jié)核、梅毒等傳染性疾病的患者;(3)合并有嚴(yán)重心腦血管疾病、惡性腫瘤等原發(fā)性疾病的患者。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR:術(shù)中取患處膝關(guān)節(jié)的滑膜組織,剔除血污及脂肪組織,使用TRIzol試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司,批號(hào):391506)提取滑膜組織的總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒[莫納(武漢)生物科技有限公司,批號(hào):230631]將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后使用MonScriptTMRTⅢ All-in-One Mix with dsDNase[莫納(武漢)生物科技有限公司,批號(hào):130632]進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系:MonAmpTMChemoHS Specificity Plus qPCR Mix 10 μL,正向引物0.4 μL,反向引物0.4 μL,DNA模板1 μL,加Nuclease-Free水至20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃ 延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt法計(jì)算血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)A、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)1、MMP9、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。數(shù)據(jù)采集由LightCycler 96型PCR儀(Roche公司)完成。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。引物設(shè)計(jì)由PREMIER Biosoft公司完成,引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用R語(yǔ)言軟件(版本:4.0.3)和GraphPad Prism 軟件(版本:8.0.1)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs篩選結(jié)果 共篩選出111個(gè)DEGs,其中表達(dá)上調(diào)基因55個(gè)、表達(dá)下調(diào)基因56個(gè)。DEGs火山圖見(jiàn)圖1,DEGs熱圖見(jiàn)圖2。

圖1 DEGs火山圖

圖2 DEGs熱圖

2.2 DEGs富集分析 GO功能富集分析結(jié)果顯示,DEGs的生物學(xué)過(guò)程主要富集于對(duì)RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附、血管生成、免疫反應(yīng)、凋亡過(guò)程的正向調(diào)控等;細(xì)胞成分主要富集在細(xì)胞外區(qū)域、漿膜、細(xì)胞外間質(zhì)、細(xì)胞外泌體、漿膜的重要組成部分等;分子功能主要富集在轉(zhuǎn)錄因子活性與特異性序列DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)同質(zhì)化活性、肝素結(jié)合物、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異的DNA結(jié)合等。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,DEGs主要與白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-17信號(hào)通路、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)的皰疹病毒感染等有關(guān)。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 DEGs的GO功能富集分析圖

圖4 DEGs的KEGG通路富集分析圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵模塊分析結(jié)果 PPI網(wǎng)絡(luò)共由75個(gè)基因相關(guān)蛋白的節(jié)點(diǎn)和423條蛋白相互關(guān)系的連線(xiàn)組成,見(jiàn)圖5?；贑ytoscape軟件中的degree算法,篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前10的關(guān)鍵基因,分別是IL-6、轉(zhuǎn)錄因子AP-1亞基(transcription factor AP-1 subunit,JUN)、VEGFA、MMP9、PTGS2、MMP1、C-X-C基序趨化因子配體2(C-X-C motif chemokine ligand 2,CXCL2)、雙特異性磷酸酶1(dual specificity phosphatase 1,DUSP1)、多配體蛋白聚糖1(syndecan 1,SDC1)、活化轉(zhuǎn)錄因子3(activating transcription factor 3,ATF3)。PPI網(wǎng)絡(luò)的中樞模塊(模塊1)得分5.8分,包含11個(gè)關(guān)鍵基因:SDC1、Toll樣受體7(Toll-like receptor 7,TLR7)、Fos樣抗原 1(Fos-like antigen 1,FOSL1)、半胱氨酸富集蛋白 61(cysteine-rich protein 61,CYR61)、鋅指蛋白36(zinc finger protein 36,ZFP36)、VEGFA 、MMP9、MMP1、TNF配體6B(TNF ligand 6B,TNFSF11)、PTGS2、雙糖鏈蛋白聚糖(biglycan,BGN);次模塊(模塊2)得分4.4分,包含6個(gè)關(guān)鍵基因:JUN、MYC原癌基因、C-X3-C基序趨化因子受體1(C-X3-C motif chemokine receptor 1,CX3CR1)、IL-6、ATF3、CXCL2。見(jiàn)圖6。

圖5 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 PPI網(wǎng)絡(luò)中的兩個(gè)重要模塊

2.4 中樞模塊的GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 對(duì)中樞模塊進(jìn)行GO功能富集分析,結(jié)果顯示,其生物學(xué)過(guò)程主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)、凋亡過(guò)程的積極調(diào)控、免疫應(yīng)答、對(duì)RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)和對(duì)RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的負(fù)向調(diào)節(jié)中;細(xì)胞組分主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞表面、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外空間、細(xì)胞外泌體、細(xì)胞質(zhì)、漿膜和膜的重要組成部分中;分子功能主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合、同型的蛋白質(zhì)結(jié)合和蛋白結(jié)合力中(見(jiàn)圖7)。對(duì)中樞模塊進(jìn)行KEGG通路富集分析,結(jié)果顯示,中樞模塊主要富集在IL-17信號(hào)通路、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、TNF信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)的皰疹病毒感染等信號(hào)通路(見(jiàn)圖8)。

圖7 中樞模塊的GO功能富集分析結(jié)果

圖8 中樞模塊的KEGG通路富集分析結(jié)果

2.5 常用治療藥物和相關(guān)靶基因 在DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出50種治療骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)藥物,包括塞來(lái)昔布、吲哚美辛、曲馬多、雙氯芬酸、曲安西龍、蘇林達(dá)克、度洛西汀、玻尿酸、雙醋瑞因、甲基潑尼松龍等,在DGIdb數(shù)據(jù)庫(kù)中確定以上治療藥物共包含263個(gè)靶基因,將其與中樞模塊的關(guān)鍵基因取交集得到4個(gè)關(guān)鍵基因,即VEGFA、MMP1、MMP9、PTGS2。見(jiàn)圖9、圖10。

圖9 藥物靶基因和中樞模塊關(guān)鍵基因的韋恩圖

圖10 骨關(guān)節(jié)炎常用治療藥物與靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證微陣列的結(jié)果,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)關(guān)鍵基因在骨關(guān)節(jié)炎患者和健康人群滑膜組織樣本中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組滑膜組織中VEGFA、PTGS2的mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組,MMP9的mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組(均P<0.05),而兩組滑膜組織中MMP1的mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組滑膜組織MMP1、VEGFA、MMP9、PTGS2的 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎的病理特征包括關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)、軟骨下骨硬化、骨吸收/重建失衡、骨贅形成和滑膜炎癥等[19-20]。研究表明,滑膜炎癥從骨關(guān)節(jié)炎疾病早期就開(kāi)始參與其發(fā)病機(jī)制[21]。深入研究基因規(guī)律可為骨關(guān)節(jié)炎的診治提供新的思路,因此本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法分析治療骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織相關(guān)靶基因。

本研究結(jié)果顯示,DEGs的生物學(xué)過(guò)程主要與細(xì)胞黏附、免疫反應(yīng)、凋亡過(guò)程的正向調(diào)控有關(guān),細(xì)胞組分主要富集在細(xì)胞外區(qū)域、漿膜、細(xì)胞外間質(zhì)等,分子功能主要富集在轉(zhuǎn)錄因子活性與特異性序列DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)同質(zhì)化活性等方面;DEGs通過(guò)IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等信號(hào)通路參與骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥的發(fā)展。說(shuō)明免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞群都參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展,并引起炎癥反應(yīng)和疼痛表現(xiàn)。滑膜炎癥是由于單核細(xì)胞滲入滑膜后生成一系列促炎癥介質(zhì)(IL-1β、TNF-α和趨化因子)所致[22]。組織損傷和關(guān)節(jié)破裂導(dǎo)致促炎癥介質(zhì)因子合成增加,使其在滑膜中持續(xù)發(fā)揮促炎癥作用,引起軟骨細(xì)胞的分化及功能改變,誘導(dǎo)MMP和軟骨聚集蛋白聚糖酶的表達(dá)與活化,破壞軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài),引起關(guān)節(jié)周?chē)侵厮?進(jìn)而導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[23]。Liu等[24]發(fā)現(xiàn),MRI顯示的炎癥組織學(xué)特征與滑膜增厚存在相關(guān)性,并進(jìn)一步證實(shí)了滑膜炎癥是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎病理改變的重要因素。本研究PPI網(wǎng)絡(luò)的中樞模塊KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路可能參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展。IL-17是具有促炎癥作用的細(xì)胞因子,主要來(lái)源于受刺激的CD4+T淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞,其通過(guò)血管途徑到達(dá)滑膜和關(guān)節(jié)部位[25-26]。IL-17可單獨(dú)或通過(guò)與其他促炎癥細(xì)胞因子的協(xié)同作用破壞細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)[27],刺激成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞生成,進(jìn)一步刺激軟骨破壞因子的產(chǎn)生,加速滑膜損傷。研究表明,在患有骨關(guān)節(jié)炎的小鼠體內(nèi)注入特異性IL-17受體的DNA適配體,可抑制滑膜中IL-6的表達(dá),使滑膜增厚,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[28],提示調(diào)節(jié)IL-17信號(hào)傳導(dǎo)可以預(yù)防滑膜炎癥的發(fā)生。TNF是一種被廣泛研究的炎癥細(xì)胞因子,其可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,調(diào)控細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡和相關(guān)炎癥等[29]。研究表明,TNF在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中呈高表達(dá),并可激活核因子κB信號(hào)通路,誘導(dǎo)一氧化氮、環(huán)氧合酶2、一氧化氮合酶和前列腺素E2的表達(dá),加重關(guān)節(jié)的損傷程度,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的凋亡和滑膜炎癥的發(fā)生[30-33]。

本研究結(jié)果顯示,VEGFA、MMP1、MMP9、PTGS2是藥物治療骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵基因靶點(diǎn);實(shí)驗(yàn)組滑膜組織中VEGFA、PTGS2的mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組,MMP9的mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組(均P<0.05),而兩組滑膜組織中MMP1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。細(xì)胞外基質(zhì)的一個(gè)重要組成部分是由關(guān)節(jié)囊中的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的Ⅱ型膠原蛋白,其過(guò)度降解會(huì)使細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)受到破壞進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)損害[34]。MMP是一種參與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解的酶,也是平衡關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解的重要因子,可促進(jìn)軟骨基質(zhì)成分(如Ⅱ型膠原蛋白)的降解[35]。Xiao等[36]發(fā)現(xiàn),MMP通過(guò)裂解相關(guān)靶標(biāo)(如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)、趨化因子、細(xì)胞因子等)以激活與之相關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路,破壞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成,進(jìn)而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[37]。MMP9是MMP家族中最復(fù)雜的成員,主要由促炎癥刺激因子(TNF-α、內(nèi)毒素、IL-1等)誘導(dǎo)產(chǎn)生。研究表明,TNF-α可通過(guò)特異性細(xì)胞信號(hào)通路誘導(dǎo)MMP9的表達(dá),引起慢性炎癥[38]。此外,具有MMP9活性的巨噬細(xì)胞的表達(dá)可以誘導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)的發(fā)生,骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中的MMP9呈高表達(dá)[39]。

前列腺素是花生四烯酸通過(guò)環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)生成,可引起炎性疼痛的脂質(zhì)介質(zhì)的代謝物。COX有COX1和COX2兩種亞型,分別由PTGS1和PTGS2編碼。與構(gòu)成性表達(dá)的PTGS1不同,PTGS2的表達(dá)由細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子誘導(dǎo),其可激活產(chǎn)生前列腺素E2,促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成,誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化,引起滑膜發(fā)炎、軟骨變性和疼痛[40]。Tu等[41]發(fā)現(xiàn),COX2的高水平表達(dá)能夠刺激軟骨下骨的異常形成,這可能是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的原因之一。骨關(guān)節(jié)炎臨床治療中最常用的鎮(zhèn)痛藥是非甾體類(lèi)抗炎藥。本研究發(fā)現(xiàn),以塞來(lái)昔布、吲哚美辛為代表的骨關(guān)節(jié)炎治療藥物均為COX2抑制劑。研究表明,塞來(lái)昔布、吲哚美辛均能通過(guò)阻斷IL-17信號(hào)通路以刺激前列腺素(主要是前列腺素E2)的生成,誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化,從而影響MMP9的表達(dá),兩者既是促進(jìn)骨吸收的有效藥物,也是臨床上消炎鎮(zhèn)痛的實(shí)用性藥物[42-43]。VEGFA是VEGF家族的主要成員,其被證實(shí)參與多種疾病的發(fā)生機(jī)制。例如有研究發(fā)現(xiàn),VEGF表達(dá)水平升高與骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展密切相關(guān),其可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖分化,參與關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解,在關(guān)節(jié)炎癥早期產(chǎn)生大量促炎因子,參與關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨退變和疼痛等病變[44-45]。

綜上所述,VEGFA、MMP9、PTGS2可能為藥物治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在基因靶點(diǎn)。但本研究樣本量較小,且只針對(duì)篩選的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證,未來(lái)還需要進(jìn)一步研究以證實(shí)本研究結(jié)論。