李 睿, 杜心靈

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心臟大血管外科,武漢 430022

鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病(calcific aortic valve disease,CAVD)是一種與年齡高度相關(guān)的退行性疾病,主要表現(xiàn)為主動(dòng)脈瓣瓣葉增厚、鈣化導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣狹窄,引起顯著的血流動(dòng)力學(xué)變化[1]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示,50～69歲人群中CAVD發(fā)病率約為0.3%;而70歲以上人群中,CAVD發(fā)病率約高達(dá)1%[2]。隨著我國(guó)人口老齡化程度逐漸加重,CAVD已逐漸成為嚴(yán)重的社會(huì)負(fù)擔(dān)。目前,CAVD尚無(wú)有效的藥物治療手段,仍以手術(shù)換瓣治療為主。機(jī)械瓣置換術(shù)后需長(zhǎng)期服用華法林抗凝治療,具有出血及栓塞風(fēng)險(xiǎn);生物瓣因其易鈣化、衰敗,具有再次手術(shù)可能[3]。因此,深入研究主動(dòng)脈瓣鈣化病理機(jī)制,尋找可能的藥物干預(yù)靶點(diǎn),對(duì)CAVD預(yù)防及治療具有重要意義。

主動(dòng)脈瓣由內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞,以及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成[4]。研究表明,CAVD發(fā)生發(fā)展主要分為3個(gè)階段。初期表現(xiàn)為氧化型低密度脂蛋白水平升高、機(jī)械/剪切應(yīng)力變化、鈣磷代謝紊亂等因素引起瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷、內(nèi)皮下脂質(zhì)沉積、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),瓣膜發(fā)生纖維化、增厚;進(jìn)展期以主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞(aortic valve interstitial cells,AVICs)向成骨樣細(xì)胞分化為標(biāo)志,逐漸形成微小鈣結(jié)節(jié);終末期則是鈣鹽大量沉積,瓣膜狹窄,導(dǎo)致嚴(yán)重血流動(dòng)力學(xué)改變[5]。AVICs成骨樣分化是一直以來(lái)瓣膜鈣化研究的焦點(diǎn),是尋找藥物治療靶點(diǎn)干預(yù)最主要的病理進(jìn)程之一[6]。雖然目前研究對(duì)CAVD發(fā)生發(fā)展有了一定認(rèn)識(shí),但AVICs成骨樣分化機(jī)制仍不明確。

乳脂球表皮生長(zhǎng)因子8(milk fat globule-epidermal growth factor 8,MFG-E8)最早發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物乳腺分泌物中[7]。人MFG-E8蛋白主要由N端表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域以及C端兩個(gè)凝血因子Ⅴ/Ⅷ樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[8]。研究發(fā)現(xiàn),MFG-E8在細(xì)胞凋亡、衰老、炎癥反應(yīng)等病理生理過(guò)程以及動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、腫瘤等疾病中扮演重要角色[9-13]。新近研究表明,相較于小鼠正常頸動(dòng)脈,鈣化頸動(dòng)脈中MFG-E8表達(dá)顯著上調(diào);MFG-E8可顯著促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞成骨樣分化;小鼠MFG-E8基因缺失可顯著抑制氯化鈣誘導(dǎo)的頸總動(dòng)脈鈣化[14]。微小RNA(microRNA,miRNA)是能與信使RNA(messenger RNA,mRNA)3′端非翻譯區(qū)結(jié)合并抑制mRNA翻譯的一類非編碼RNA[15]。近年來(lái),miRNA被認(rèn)為是細(xì)胞功能的新型調(diào)節(jié)因子,miRNA診斷及治療策略正迅速成為全新觀念[16]。

細(xì)胞凋亡、衰老、炎癥反應(yīng)均被證實(shí)與CAVD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),結(jié)合近期研究發(fā)現(xiàn),我們提出科學(xué)假說(shuō):MFG-E8在CAVD病程中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探究MFG-E8是否參與調(diào)控AVICs成骨樣分化,并尋找影響MFG-E8表達(dá)的miRNA,為CAVD治療提供新思路和新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 人主動(dòng)脈瓣標(biāo)本獲取

本研究符合《赫爾辛基宣言》,標(biāo)本獲取由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。鈣化主動(dòng)脈瓣取自因嚴(yán)重CAVD行主動(dòng)脈瓣置換手術(shù)患者,術(shù)前心臟超聲檢查示主動(dòng)脈瓣明顯增厚、回聲增強(qiáng)、瓣葉上可見廣泛分布的鈣化強(qiáng)回聲,主動(dòng)脈瓣中重度至重度狹窄,流速顯著增快;術(shù)中剪下主動(dòng)脈瓣,肉眼觀察發(fā)現(xiàn)瓣膜增厚、變黃、有明顯鈣化斑,觸摸發(fā)現(xiàn)其質(zhì)地僵硬。排除風(fēng)濕性瓣膜病、主動(dòng)脈瓣二葉式畸形、感染性心內(nèi)膜炎患者。正常非鈣化主動(dòng)脈瓣瓣膜取自因擴(kuò)張型心肌病行心臟移植手術(shù)患者,術(shù)前心臟彩超檢查示主動(dòng)脈瓣無(wú)明顯增厚、瓣葉上無(wú)強(qiáng)回聲,開放及閉合正常;術(shù)中剪下主動(dòng)脈瓣,肉眼觀察瓣膜呈菲薄半透明狀,觸摸發(fā)現(xiàn)其質(zhì)地軟。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?予以相應(yīng)處理:需進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定;需提取組織蛋白質(zhì)或RNA的主動(dòng)脈瓣,沖洗去除血液并吸干水分后,置于液氮凍存;需提取AVICs的主動(dòng)脈瓣在離體后,置于DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco公司)中,帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

瓣膜固定48 h后,進(jìn)行石蠟包埋及切片,切片厚度為5 μm。切片依次浸泡二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化,檸檬酸抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù),3%雙氧水溶液避光孵育阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,5%山羊血清室溫封閉30 min。隨后,滴加一抗,4℃孵育過(guò)夜,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,滴加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗,室溫孵育50 min。PBS洗滌后,滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色液,顯微鏡下觀察組織出現(xiàn)棕黃色著色后,自來(lái)水沖洗,蘇木精染色3 min,自來(lái)水沖洗,返藍(lán)液返藍(lán)。最后切片進(jìn)行脫水透明,中性樹脂封片,顯微鏡拍照。實(shí)驗(yàn)所用抗體信息見表1。

表1 免疫組織化學(xué)染色所用抗體信息Table 1 Antibodies for immunohistochemical staining

1.3 組織蛋白質(zhì)及RNA提取

瓣膜從液氮中取出后置于陶瓷研缽中,重復(fù)多次加入液氮冷凍組織,用研磨杵將組織研磨成粉末狀。需提取蛋白質(zhì)的組織中加入混有蛋白酶/磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液,超聲裂解后,12000 r/min 4℃離心15 min,取上清。BCA試劑盒(碧云天公司)測(cè)得蛋白濃度后,加入上樣緩沖液并混勻,95 ℃加熱器加熱10 min,隨后置于冰上或凍于-20℃冰箱保存。需提取RNA的組織,采用RNA提取試劑盒(諾唯贊公司)提取大分子RNA及miRNA,分別采用HiScript Ⅲ RT SuperMix(諾唯贊公司),miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(諾唯贊公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,于-20 ℃冰箱冰凍保存。

1.4 細(xì)胞分離、培養(yǎng)及干預(yù)

將瓣膜組織置于含有1%雙抗的無(wú)菌PBS中,移液器吹打洗滌后,轉(zhuǎn)移至含有2 mg/mL Ⅰ型膠原酶(biosharp公司)的DMEM高糖消化液中。于37 ℃培養(yǎng)箱中消化30 min后,用移液器吹打瓣膜表面以去除內(nèi)皮細(xì)胞,離心,棄上清,隨后加入新的消化液,37 ℃培養(yǎng)箱中消化12～18 h。待瓣膜完全消化后離心、棄上清,用含有10%胎牛血清(Gibco公司)的DMEM高糖培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),每2天換1次培養(yǎng)液,待細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代,采用3～5代AVICs進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。將AVICs接種于6孔板干預(yù)后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),接種于12孔板進(jìn)行鈣鹽沉積實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞接種后,待融合度達(dá)到70%～80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),取4支1.5 mL EP管,各加入250 μL opti-MEM溶液(Gibco公司),其中兩支加入10 μL Lipo 3000(ThermoFisher公司),另外兩支分別加入10 μL濃度為20 mmol/L的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組siRNA或miRNA(購(gòu)自銳博生物科技公司,序列信息見表2),分別混勻后,再將兩支lipo 3000管與RNA管混合,靜置15 min,6孔板中每孔加入250 μL溶液,12孔板每孔125 μL,并用opti-MEM分別補(bǔ)齊至2 mL和1 mL。轉(zhuǎn)染8 h后換液,對(duì)照組換為含有2%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組換為成骨培養(yǎng)液(osteogenic medium,OM),3 d后,收取6孔板中細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。12孔板每2天換1次培養(yǎng)液,21 d后進(jìn)行茜素紅染色。OM培養(yǎng)液為含有2%胎牛血清,10 mmol/L β-甘油磷酸,100 nmol/L地塞米松,50 mg/mL維生素C的DMEM高糖培養(yǎng)液。

表2 siRNA及miRNA序列信息Table 2 Information of siRNA and miRNA sequences

1.5 免疫熒光染色

細(xì)胞接種至共聚焦皿,培養(yǎng)至匯合度達(dá)50 %后,棄去培養(yǎng)液,PBS洗3遍,加入4%多聚甲醛室溫固定15 min,棄去多聚甲醛,PBS洗3遍;滴加0.2% Triton X-100室溫孵育10 min進(jìn)行破膜,棄去破膜液,PBS洗3遍;滴加10 %山羊血清37℃溫箱中封閉30 min,滴加一抗4 ℃孵育過(guò)夜;棄去一抗,PBS洗滌10 min,重復(fù)3次,滴加二抗,室溫避光條件下孵育30 min;棄去二抗,PBS洗滌10 min,重復(fù)3次,滴加1滴含DAPI封片液,共聚焦顯微鏡拍照。滴加二抗后所有操作均在避光條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)所用抗體信息見表3。

表3 免疫熒光染色所用抗體信息Table 3 Antibodies for immunofluorescence staining

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

將相同蛋白質(zhì)量的樣品加入SurePAGETM預(yù)制聚丙烯酰胺凝膠(金斯瑞公司)進(jìn)行分離,分離后利用eBlot L1快速濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)印至0.22 μm的PVDF膜上,將膜放置在含5%脫脂牛奶的TBS-T溶液中室溫孵育1 h,然后與一抗在4 °C搖床上孵育過(guò)夜。最后,與適當(dāng)?shù)腍RP偶聯(lián)的二抗和ECL顯影液分別孵育后,通過(guò)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)特異性結(jié)合。為計(jì)算相對(duì)表達(dá)量,使用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)所用抗體信息見表4。

表4 Western blot實(shí)驗(yàn)所用抗體信息Table 4 Antibodies for Western blotting

1.7 茜素紅染色

瓣膜組織石蠟切片脫蠟后,向切片上組織滴加茜素紅染液至完全覆蓋,5～10 min后自來(lái)水清洗切片,65 ℃烤箱中,烘烤4 h。隨后,將切片浸泡至二甲苯中5～10 min進(jìn)行透明處理,中性樹膠封片,顯微鏡下拍照分析。12孔板中的細(xì)胞干預(yù)21 d后,PBS洗滌細(xì)胞3次,4%多聚甲醛溶液固定15 min,隨后蒸餾水洗滌3次,0.2%茜素紅溶液孵育30 min,用蒸餾水洗滌去除多余的染料,最后用相機(jī)及顯微鏡進(jìn)行拍照,Image-Pro Plus軟件分析茜素紅陽(yáng)性染色區(qū)域百分比。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)實(shí)驗(yàn)

用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix和miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊公司)以及特異性引物,在StepOne Plus PCR儀上對(duì)制備好的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,并分析熔解曲線。實(shí)驗(yàn)所用引物:RUNX2正向引物5′-CTGTCATGGCGGGTAACGAT-3′,反向引物為5′-GG-GTTCCCGAGGTCCATCTA-3′;MFG-E8正向引物為5′-GCCCTGGATATCTGTTCCAAA-3′,反向引物為5′-GCGATCTGTGAGTTGGCAAT-3′;GAPDH正向引物為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,反向引物為5′-GGGGT-CGTTGATGGCAACA-3′;hsa-miR-214-5p正向引物為5′-CGCGTGCCTGTCTACACTTG-3′,反向引物為5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′;U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且通過(guò)方差齊性檢驗(yàn),采用t檢驗(yàn);兩組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布但未通過(guò)方差齊性檢驗(yàn),則采用Welch校正t檢驗(yàn);兩組數(shù)據(jù)中任意一組不符合正態(tài)分布,則采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)。P值小于0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人鈣化主動(dòng)脈瓣中MFG-E8表達(dá)顯著升高

瓣膜組織切片茜素紅染色結(jié)果顯示,鈣化瓣膜中有大量鈣鹽沉積;免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),與非鈣化瓣膜相比,鈣化瓣膜中MFG-E8表達(dá)明顯增多(圖1A)。

Western blot實(shí)驗(yàn)對(duì)瓣膜組織中MFG-E8及成骨樣分化指標(biāo)RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX family transcription factor 2,RUNX2)蛋白水平進(jìn)行相對(duì)定量,結(jié)果顯示鈣化瓣膜中MFG-E8及RUNX2表達(dá)顯著上調(diào)(圖1B、1C)。

A:組織切片茜素紅及免疫組織化學(xué)染色代表性圖片,標(biāo)尺=50 μm;B:Western blot檢測(cè)RUNX2及MFG-E8表達(dá)水平代表性圖片;C:RUNX2及MFG-E8相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析,*P<0.05圖1 人鈣化主動(dòng)脈瓣中MFG-E8表達(dá)顯著升高Fig.1 MFG-E8 protein expression is significantly increased in human calcified aortic valves

2.2 MFG-E8調(diào)控AVICs成骨樣分化及鈣鹽沉積

瓣膜組織細(xì)胞提取培養(yǎng)后,首先通過(guò)免疫熒光染色對(duì)AVICs純度進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示AVICs表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志波形蛋白(Vimentin),而不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志白細(xì)胞分化抗原(CD31),證明提取的AVICs中不含內(nèi)皮細(xì)胞(圖2A)。OM誘導(dǎo)AVICs成骨樣分化,免疫熒光結(jié)果顯示成骨樣分化AVICs中MFG-E8及RUNX2表達(dá)明顯上調(diào)(圖2B)。隨后,為探究MFG-E8是否參與調(diào)控AVICs成骨樣分化,采用siRNA沉默AVICs中MFG-E8,并利用OM誘導(dǎo)其成骨樣分化。Western blot結(jié)果顯示:OM干預(yù)AVICs后,MFG-E8及成骨樣分化指標(biāo)RUNX2、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表達(dá)明顯升高,沉默MFG-E8可顯著抑制AVICs中RUNX2及ALP表達(dá)(圖2C～2F)。茜素紅染色結(jié)果顯示:沉默MFG-E8可顯著抑制AVICs中鈣鹽沉積(圖2G、2H)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MFG-E8在AVICs成骨樣分化及鈣鹽沉積過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

A:AVICs純度鑒定免疫熒光染色代表性圖片,標(biāo)尺=50 μm;B:免疫熒光檢測(cè)OM干預(yù)后AVICs中MFG-E8及RUNX2表達(dá)代表性圖片,標(biāo)尺=50 μm;C:Western blot檢測(cè)siMFG-E8/siNC及OM干預(yù)后AVICs中ALP、RUNX2及MFG-E8表達(dá)的代表性圖片;D～F:ALP、RUNX2及MFG-E8相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析;G:茜素紅染色肉眼及鏡下代表性圖片,標(biāo)尺=50 μm;H:茜素紅染色陽(yáng)性百分比統(tǒng)計(jì)分析;CTR:2% FBS DMEM高糖培養(yǎng)液對(duì)照組;OM:成骨培養(yǎng)液組;siNC:無(wú)義序列siRNA作為對(duì)照;siMFG-E8:靶向MFG-E8的siRNA;*P<0.05,**P<0.01圖2 MFG-E8調(diào)控AVICs成骨樣分化及鈣鹽沉積Fig.2 MFG-E8 regulates osteoblastic differentiation of AVICs and calcium deposition

2.3 miR-214-5p抑制AVICs中MFG-E8表達(dá)

TargetScanHuman網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-22-3p及miR-214-5p是兩個(gè)可能靶向MFG-E8的保守miRNA。在AVICs中轉(zhuǎn)染miR-22-3p或miR-214-5p模擬物(mimics)后Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:miR-214-5p可抑制MFG-E8表達(dá),miR-22-3p對(duì)MFG-E8表達(dá)量無(wú)影響。以上研究表明,miR-214-5p可能是一種調(diào)控MFG-E8表達(dá)的miRNA(圖3)。

A:Western blot檢測(cè)miR-22-3p mimics對(duì)AVICs中MFG-E8表達(dá)影響的代表性圖片;B:MFG-E8相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析;C:Western blot檢測(cè)miR-214-5p mimics對(duì)AVICs中MFG-E8表達(dá)影響的代表性圖片;D:MFG-E8相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析,**P<0.01; miR-NC:無(wú)義序列miRNA作為對(duì)照?qǐng)D3 miR-22-3p和miR-214-5p對(duì)MFG-E8表達(dá)的影響Fig.3 Effects of miR-22-3p and miR-214-5p on the expression of MFG-E8

2.4 miR-214-5p調(diào)控AVICs成骨樣分化及鈣鹽沉積

在AVICs中轉(zhuǎn)染miR-214-5p mimics,并采用OM培養(yǎng)液誘導(dǎo)AVICs成骨樣分化,Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MFG-E8及成骨樣分化指標(biāo)ALP、RUNX2的表達(dá)被顯著抑制(圖4A～4D);茜素紅染色結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-214-5p mimics可顯著抑制AVICs中鈣鹽沉積(圖4E、4F)。以上結(jié)果表明,miR-214-5p在AVICs成骨樣分化及鈣鹽沉積過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

A:Western blot檢測(cè)miR-NC/miR-214-5p mimic及OM干預(yù)后AVICs中ALP、RUNX2及MFG-E8表達(dá)的代表性圖片;B～C:ALP、RUNX2及MFG-E8相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖;D:茜素紅染色肉眼及鏡下代表性圖片,標(biāo)尺=50 μm;E:茜素紅染色陽(yáng)性百分比統(tǒng)計(jì);CTR:2% FBS DMEM高糖培養(yǎng)液對(duì)照,OM:成骨培養(yǎng)液,miR-NC:無(wú)義序列miRNA作為對(duì)照;*P<0.05,**P<0.01圖4 miR-214-5p調(diào)控AVICs成骨樣分化及鈣鹽沉積Fig.4 miR-214-5p regulates osteoblastic differentiation of AVICs and calcium deposition

2.5 人鈣化瓣膜中miR-214-5p表達(dá)明顯下調(diào)

為探究人鈣化瓣膜及非鈣化瓣膜中miR-214-5p的表達(dá)是否存在差異,進(jìn)行了real-time PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,鈣化瓣膜中RUNX2及MFG-E8的mRNA水平顯著上調(diào),而miR-214-5p的表達(dá)明顯下調(diào)(圖5)。

3 討論

全球心血管疾病負(fù)擔(dān)報(bào)告指出,CAVD患病及死亡人數(shù)在過(guò)去30年間逐年攀升,已成為嚴(yán)重的全球性疾病負(fù)擔(dān)[17]。主動(dòng)脈瓣鈣化是CAVD核心病理過(guò)程,引起瓣膜僵硬狹窄,從而導(dǎo)致血流動(dòng)力改變。研究表明主動(dòng)脈瓣鈣化是多種細(xì)胞類型參與的主動(dòng)復(fù)雜過(guò)程,包括內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等,目前認(rèn)為間質(zhì)細(xì)胞成骨樣分化是主動(dòng)脈瓣鈣化核心環(huán)節(jié),但其機(jī)制尚不明確[1]。

real-time PCR檢測(cè)人鈣化及非鈣化瓣膜中RUNX2(A)和MFG-E8(B)的mRNA及miR-214-5p(C)相對(duì)表達(dá)量;**P<0.01圖5 人鈣化瓣膜中miR-214-5p表達(dá)明顯下調(diào)Fig.5 miR-214-5p expression is significantly reduced in human calcified aortic valves

本研究發(fā)現(xiàn),CAVD患者的鈣化主動(dòng)脈瓣中MFG-E8表達(dá)顯著升高;分離人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)其成骨樣分化,同樣觀察到顯著上調(diào)的MFG-E8;siRNA沉默AVICs中MFG-E8表達(dá)再進(jìn)行成骨樣分化誘導(dǎo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)成骨樣分化指標(biāo)ALP及RUNX2顯著下調(diào),且鈣鹽沉積明顯減少,表明下調(diào)MFG-E8表達(dá)可顯著抑制AVICs成骨樣分化。本研究證實(shí)MFG-E8是AVICs成骨樣分化的重要調(diào)節(jié)因子,在CAVD中可能發(fā)揮重要作用。有研究表明,在血管平滑肌細(xì)胞成骨樣分化過(guò)程中,MFG-E8表達(dá)顯著上調(diào),抑制MFG-E8表達(dá)可明顯降低RUNX2及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)表達(dá),阻止血管平滑肌細(xì)胞成骨樣分化[14]。小鼠中MFG-E8基因缺失可以顯著減輕氯化鈣誘導(dǎo)的頸總動(dòng)脈血管鈣化。另外,有研究對(duì)鳥類蛋殼進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),MFG-E8可引導(dǎo)含有無(wú)定形碳酸鈣的囊泡到達(dá)需礦化部位,從而發(fā)生鈣化,形成蛋殼[18]。這些研究均表明MFG-E8是生物鈣化的重要調(diào)節(jié)因子,在細(xì)胞成骨樣分化及鈣鹽沉積中發(fā)揮重要作用。

本研究對(duì)可能調(diào)控MFG-E8表達(dá)的miRNA進(jìn)行探索,發(fā)現(xiàn)miR-214-5p可調(diào)節(jié)MFG-E8表達(dá),并參與AVICs成骨樣分化及鈣鹽沉積。本研究發(fā)現(xiàn),人鈣化主動(dòng)脈瓣膜中miR-214-5p水平顯著下調(diào),提示外源性補(bǔ)充miR-214-5p可能成為阻止AVICs成骨樣分化及鈣鹽沉積,抑制CAVD病程進(jìn)展的新策略。以往研究發(fā)現(xiàn),CAVD患者鈣化瓣膜中miR-214-3p表達(dá)顯著下調(diào),在AVICs中過(guò)表達(dá)miR-214可顯著降低骨橋蛋白、轉(zhuǎn)錄因子Sp7、轉(zhuǎn)錄激活因子4(ATF4)以及RUNX2等成骨分化指標(biāo)表達(dá),從而抑制AVICs成骨樣分化[19]。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明,miR-214可結(jié)合Sp7和ATF4的mRNA并抑制其翻譯,從而降低Sp7及ATF4表達(dá)。以高脂飲食及維生素D腹腔注射誘導(dǎo)主動(dòng)脈瓣鈣化模型,miR-214敲除大鼠主動(dòng)脈瓣跨瓣壓差及鈣化程度顯著高于對(duì)照組,表明miR-214表達(dá)降低顯著加重了主動(dòng)脈瓣鈣化。材料學(xué)研究發(fā)現(xiàn),將負(fù)載miR-214抑制劑的聚乙烯亞胺(PEI)功能化氧化石墨烯(GO)復(fù)合物組裝至絲素蛋白/羥基磷灰石(SF/HAP)支架,可通過(guò)控制miR-214抑制劑釋放,激活成骨分化關(guān)鍵因子ATF4,促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞成骨樣分化[20]。但也有研究與上述結(jié)果不一致,例如有研究表明,CAVD患者相較于主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全患者,其主動(dòng)脈瓣組織中miR-214表達(dá)顯著上調(diào);誘導(dǎo)AVICs中miR-214表達(dá)上調(diào),可激活NF-κB炎癥信號(hào)通路,IL-6、IL-8及MCP-1等炎癥因子增多,成骨分化指標(biāo)RUNX2及BMP2等表達(dá)上調(diào),促進(jìn)AVICs成骨樣分化[21]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),鈣化主動(dòng)脈瓣中巨噬細(xì)胞向M1型極化,釋放含有miR-214的微小囊泡,miR-214可抑制AVICs中TWIST1蛋白表達(dá),從而導(dǎo)致AVICs成骨樣分化。此外,在高脂喂養(yǎng)ApoE敲除小鼠誘導(dǎo)主動(dòng)脈瓣鈣化的模型中,尾靜脈注射miR-214抑制物,發(fā)現(xiàn)小鼠主動(dòng)脈瓣鈣化程度顯著減輕[22]。還有研究發(fā)現(xiàn)負(fù)載miR-214水凝膠可通過(guò)釋放miR-214干預(yù)AVICs,引起AVICs中ALP活性升高,促進(jìn)AVICs成骨樣分化[23]。分析上述研究結(jié)果和結(jié)論的差異,可能有以下幾點(diǎn)原因:①組織中miR-214表達(dá)存在爭(zhēng)議可能是由于對(duì)照組選擇不同,主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全患者瓣膜和擴(kuò)張型心肌病患者瓣膜的miR-214表達(dá)基礎(chǔ)值可能存在差異,這些瓣膜雖并無(wú)鈣化,但并不能完全視作正常瓣膜;②一些實(shí)驗(yàn)中只檢測(cè)了一種成骨樣分化指標(biāo),因此可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生偏倚;③動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)物種不同,由于不同動(dòng)物的miR-214序列和靶標(biāo)不盡相同,從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同。本研究以miR-214-5p為研究對(duì)象,排除了miR-214-3p干擾,通過(guò)檢測(cè)鈣鹽沉積以及成骨分化指標(biāo)RUNX2和ALP,多重角度證實(shí)了miR-214-5p對(duì)AVICs成骨分化的影響。

本研究仍存在一些不足之處,如未進(jìn)行熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)直接證明miR-214-5p與MFG-E8 mRNA的結(jié)合,未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)證實(shí)miR-214-5p及MFG-E8對(duì)主動(dòng)脈瓣鈣化的影響,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步深入研究。