楊 銘, 李 梅, 孫 暢, 鄭士耀, 梁偉華,苗婷婷, 胡澆澆, 胡建明, 曹玉文, 李 鋒,2, 楊 蘭△

1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系/石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科,石河子 832000 2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院病理科,北京 100020

食管癌(esophageal carcinoma,ESCA)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,在世界范圍內(nèi),其發(fā)病率位于所有惡性腫瘤的第7位,死亡率居第6位[1]。我國是食管癌高發(fā)國家,食管癌按其組織學(xué)分類主要分為食管鱗狀細(xì)胞癌(食管鱗癌)(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC),其中食管鱗癌在我國最為常見,約占90%[2]。食管癌的發(fā)病率具有明顯的地域性和種族差異性,新疆是其高發(fā)地區(qū)之一,其中以哈薩克族(哈族)食管鱗癌發(fā)病率最高,達(dá)155.9/10萬,遠(yuǎn)超過全國平均發(fā)病率水平(14.95/10萬),而新疆漢族食管鱗癌發(fā)病率僅為13/10萬[3]。

目前食管鱗癌的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,越來越多的證據(jù)表明,轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路在上消化道腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[4]。據(jù)報道,TGF-β信號通路在包括ESCC在內(nèi)的多種癌癥類型中具有雙重功能,根據(jù)腫瘤分期和背景,可作為腫瘤啟動子或腫瘤抑制子[5-7]。而多數(shù)研究證實TGF-β信號通路在ESCC中起促癌作用[8-10]。

在TGF-β信號通路激活過程中,轉(zhuǎn)化生長因子β-1型受體(transforming growth factor-β receptor 1,TGFBR1,TβR1)被招募到TGF-β/TβR2復(fù)合體中,通過磷酸化Smad2和Smad3啟動信號傳導(dǎo),磷酸化的Smad2/Smad3與Smad4結(jié)合形成異質(zhì)復(fù)合體,易位到細(xì)胞核,調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。此過程中,TβR1主要負(fù)責(zé)信號傳導(dǎo),而Smad蛋白則是TGF-β通路最核心的組分,Smad2/3的磷酸化(phosphorylation of Smad2/3,p-Smad2/3)狀態(tài)直接反映了TGF-β通路的活性。Dong等[11]認(rèn)為,TβR1在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用,在腫瘤中TβR1和脯氨酸導(dǎo)向激酶對Smad2和Smad3進(jìn)行不同程度的磷酸化,從而產(chǎn)生它們的磷酸化異構(gòu)體[12-15],而Horitani等[16]發(fā)現(xiàn)p-Smad2/3陽性細(xì)胞出現(xiàn)在侵襲性食管鱗癌黏膜下浸潤和血管浸潤部位,p-Smad2/3可能影響食管鱗癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。因此,探討TβR1及p-Smad2/3在食管鱗癌中的表達(dá)狀況可進(jìn)一步反映TGF-β/Smad通路在食管癌中的活化狀態(tài)及在食管癌中所起的作用。故本研究采用免疫組織化學(xué)(免疫組化)技術(shù)聯(lián)合檢測了TβR1和p-Smad2/3蛋白在哈族食管鱗癌組織中的表達(dá)情況,首次分析了TβR1和p-Smad2/3在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性,初步探討了TβR1和p-Smad2/3蛋白表達(dá)水平與食管鱗癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者生存的關(guān)系。為闡明TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵分子與食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系提供理論依據(jù),并為進(jìn)一步尋找食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的分子靶標(biāo)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

兔抗TβR1和p-Smad2/3多克隆抗體均購于Santa Cruz公司;Envision二步法試劑盒、抗體稀釋液、DAB顯色試劑盒均購于美國Dako公司;石蠟包埋機(jī)購于中國德立森公司;組織切片機(jī)購于德國萊卡公司;60℃烤箱購于中國上海一恒科學(xué)儀器廠;普通光學(xué)顯微鏡和病理圖像采集系統(tǒng)購于日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載食管癌基因芯片數(shù)據(jù)集GSE161533和GSE20347,篩選食管癌中差異表達(dá)的mRNA;KOBAS網(wǎng)站(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)分析差異表達(dá)的mRNA主要富集的通路;運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)進(jìn)行TGF-β信號通路蛋白相互作用預(yù)測,Cytoscape v3.9.0分析軟件篩選出其中的核心基因;通過GEPIA網(wǎng)站(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析TβR1蛋白在泛癌中的表達(dá)情況;TIMER網(wǎng)站(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析TβR1和Smad2及Smad3蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1.2.2 食管鱗癌及配對正常組織樣本的獲取 收集2009年到2015年間伊犁友誼醫(yī)院和新華醫(yī)院的127例哈族食管鱗癌組織樣本及其中對應(yīng)的82例哈族食管正常組織標(biāo)本。所有樣本均先經(jīng)過10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋處理后切片,隨后蘇木精-伊紅(HE)染色,再由2位高年資臨床病理學(xué)醫(yī)師閱片進(jìn)行確認(rèn)。

1.2.3 組織芯片的制備及免疫組化染色 利用上述食管鱗癌樣本及配對正常組織樣本制備組織芯片,將包埋好的組織芯片蠟塊連續(xù)切片,石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后,梯度乙醇進(jìn)行脫水,切片加枸櫞酸緩沖液進(jìn)行微波抗原修復(fù);切片加兔抗人多克隆TβR1抗體(sc-398,Santa Cruz公司,稀釋度1∶500)或兔抗人多克隆p-Smad2/3抗體(sc-11769,Santa Cruz公司,稀釋度1∶50),4℃孵育過夜;加二抗孵育后用DAB顯色,蘇木精復(fù)染。免疫組化實驗結(jié)果判定根據(jù)陽性細(xì)胞比例及染色程度評分。陽性細(xì)胞比例評分:<5%為0分,5%～為1分,26%～為2分,51%～為3分,>75%為4分;染色程度評分:無著色為0分,淺棕黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。結(jié)果判定由2位病理學(xué)專家閱片,取上述兩項分值的乘積作為總積分:0～1分為陰性(-),2～4分為弱陽性(1+),5～8分為中度陽性(2+),9～12分為強(qiáng)陽性(3+);其中得分處于0～4分之間為低表達(dá),得分處于5～12分之間為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)均使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 26.0進(jìn)行分析。采用χ2檢驗分析TβR1和p-Smad2/3在哈族食管鱗癌及癌旁正常組織中的蛋白表達(dá)水平及其與食管癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系;使用Spearman秩相關(guān)分析TβR1與p-Smad2/3蛋白在哈族食管鱗癌中表達(dá)的相關(guān)性;Kaplan-Meier分析比較TβR1和p-Smad2/3蛋白低表達(dá)和高表達(dá)患者之間總體生存的差異;以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β信號通路及其關(guān)鍵因子與食管癌相關(guān)性的生物信息學(xué)分析

利用基因芯片數(shù)據(jù)集GSE161533和GSE20347篩選出差異表達(dá)mRNA,通過在線分析網(wǎng)站KOBAS進(jìn)行KEGG通路富集分析,發(fā)現(xiàn)TGF-β信號通路與食管癌相關(guān)(圖1A);隨后應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行TGF-β信號通路的94個基因的蛋白相互作用預(yù)測,再通過Cytoscape分析軟件篩選出TGF-β信號通路的核心基因(圖1B),結(jié)果發(fā)現(xiàn)TβR1和Smad2/3為TGF-β信號通路核心基因,提示TβR1和Smad2/3在TGF-β信號通路中發(fā)揮著重要作用。GEPIA在線網(wǎng)站分析TβR1在泛癌中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)TβR1在食管癌中表達(dá)上調(diào),且食管癌為所有腫瘤中TβR1表達(dá)較高的腫瘤之一(圖1C)。為了進(jìn)一步研究TβR1和Smad2/3在食管癌中的關(guān)系,我們通過在線分析網(wǎng)站TIMER分析其相關(guān)性(圖1D),結(jié)果顯示TβR1和Smad2/3在食管癌中的表達(dá)呈正相關(guān)。上述結(jié)果提示TGF-β信號通路中的TβR1和Smad2/3與食管癌高度相關(guān)。

A:基因芯片數(shù)據(jù)集GSE161533(左)和GSE20347(右)差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析;B:TGF-β信號通路核心基因篩選;C:TβR1在多種腫瘤中的表達(dá)情況;D:TβR1和Smad2(左)以及TβR1和Smad3(右)在食管癌中表達(dá)相關(guān)性散點圖圖1 TGF-β信號通路及其關(guān)鍵因子在食管癌中的生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of TGF-β signaling pathway and its key factors in esophageal carcinoma

2.2 TβR1和p-Smad2/3蛋白在哈族食管鱗癌中表達(dá)上調(diào)且呈正相關(guān)

我們運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測了103例(127例中24例脫片或無法判讀)哈族食管鱗癌組織和73例(82例中9例脫片或無法判讀)癌旁正常組織中TβR1蛋白表達(dá)情況,及107例(127例中20例脫片或無法判讀)哈族食管鱗癌組織和80例(82例中2例脫片)癌旁正常組織中p-Smad2/3的蛋白表達(dá)狀況。結(jié)果顯示,TβR1蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖2A～2D),而p-Smad2/3的蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞核中(圖2E～2H),且TβR1蛋白和p-Smad2/3蛋白在哈族食管鱗癌中的表達(dá)均明顯高于癌旁正常組織(χ2=25.345,P=4.79×10-7;χ2=35.775,P=2.21×10-9)(表1)。此外,對食管鱗癌組織中TβR1蛋白與p-Smad2/3蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析顯示二者呈正相關(guān)(r=0.322,P=0.002)。以上結(jié)果表明TβR1和Smad2/3在食管鱗癌中表達(dá)均上調(diào)且呈正相關(guān)。

A:癌旁正常組織中TβR1陰性表達(dá)(-);B:食管鱗癌組織中TβR1弱陽性表達(dá)(1+);C:食管鱗癌組織中TβR1中度陽性表達(dá)(2+);D:食管鱗癌組織中TβR1強(qiáng)陽性表達(dá)(3+);E:癌旁正常組織中p-Smad2/3陰性表達(dá)(-);F:食管鱗癌組織中p-Smad2/3弱陽性表達(dá)(1+);G:食管鱗癌組織中p-Smad2/3中度陽性表達(dá)(2+);H:食管鱗癌組織中p-Smad2/3強(qiáng)陽性表達(dá)(3+)圖2 哈族食管鱗癌組織及癌旁正常組織中TβR1蛋白和p-Smad2/3蛋白免疫組化染色結(jié)果(×200)Fig.2 Immunohistochemical staining results of TβR1 and p-Smad2/3 protein in Kazakh esophageal squamous cell carcinoma tissues and adjacent normal tissues(×200)

表1 TβR1和p-Smad2/3蛋白在食管鱗癌及癌旁正常組織中的表達(dá)情況(例)Table 1 Expression of TβR1 and p-Smad2/3 protein in esophageal squamous cell carcinoma tissues and adjacent normal tissues (n)

2.3 TβR1和p-Smad2/3蛋白表達(dá)水平與哈族食管鱗癌的浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)

利用免疫組化結(jié)果對TβR1、p-Smad2/3蛋白表達(dá)水平與哈族食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,TβR1、p-Smad2/3蛋白表達(dá)與食管鱗癌的浸潤深度密切相關(guān)(χ2=11.943,P=0.003;χ2=10.651,P=0.005),且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的樣本中的表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的樣本(χ2=4.811,P=0.028;χ2=21.614,P=3×10-6),而TβR1、p-Smad2/3蛋白表達(dá)情況與患者年齡、性別和腫瘤分化程度無明顯相關(guān)性(均P>0.05)(表2)。以上結(jié)果提示TβR1、p-Smad2/3蛋白的高表達(dá)與食管鱗癌的浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

表2 食管鱗癌組織中TβR1和p-Smad2/3蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系(例)Table 2 Relationship between expression levels of TβR1 and p-Smad2/3 protein and clinicopathological parameters in patients with esophageal squamous cell carcinoma (n)

續(xù)表2

2.4 TβR1和p-Smad2/3蛋白表達(dá)水平影響哈族食管鱗癌患者預(yù)后

Kaplan-Meier生存分析顯示,TβR1、p-Smad2/3蛋白低表達(dá)組患者的術(shù)后中位生存時間分別為33.5個月和32.0個月,而TβR1、p-Smad2/3蛋白高表達(dá)組患者的術(shù)后中位生存時間分別為18.0個月和18.5個月。TβR1、p-Smad2/3蛋白高表達(dá)組患者術(shù)后生存時間明顯短于低表達(dá)患者(χ2=10.34,P=0.0013;χ2=9.879,P=0.0017)(圖3)。因此,TβR1、p-Smad2/3蛋白的表達(dá)水平可能是影響哈族食管鱗癌患者術(shù)后生存情況的重要因素。

A:TβR1蛋白表達(dá)水平與哈族食管鱗癌患者術(shù)后生存時間關(guān)系的生存曲線;B:p-Smad2/3蛋白表達(dá)水平與哈族食管鱗癌患者術(shù)后生存時間關(guān)系的生存曲線圖3 TβR1和p-Smad2/3蛋白表達(dá)水平與哈族食管鱗癌患者術(shù)后生存時間關(guān)系的生存曲線Fig.3 Survival curve of the relationship between TβR1 and p-Smad2/3 protein expression levels and postoperative survival time in Kazakh esophageal squamous cell carcinoma patients

3 討論

食管癌是我國高發(fā)的惡性腫瘤之一。位于新疆北部的哈薩克族食管鱗癌發(fā)病率處于較高水平[17],有流行病學(xué)資料顯示,食管癌患者的死亡率位于新疆哈族惡性腫瘤的首位。食管癌早期缺乏特異性癥狀,導(dǎo)致大部分患者首次就診時就處于疾病的中晚期。有研究顯示食管癌術(shù)后5年生存率低,其中75%的患者在確診后1年內(nèi)因浸潤、轉(zhuǎn)移而死亡[18]。因此,深入研究食管癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制,對于食管癌的診斷、治療及預(yù)后具有重要意義。

據(jù)報道,TGF-β信號通路與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)[9]。在本研究中,我們首先通過KEGG通路富集分析對食管癌進(jìn)行探索,發(fā)現(xiàn)TGF-β信號通路參與了食管癌的發(fā)生與發(fā)展。然后,我們對TGF-β信號通路的94個基因進(jìn)行蛋白相互作用預(yù)測,并篩選出該信號通路的核心基因。分析顯示,TβR1和Smad2/3在TGF-β信號通路發(fā)揮著重要作用。因此,我們對TβR1在所有腫瘤樣本中的基因表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TβR1在食管癌中高表達(dá),且食管癌為所有腫瘤中TβR1表達(dá)較高的腫瘤之一,由此提示,TβR1可能與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時,我們也通過在線分析網(wǎng)站TIMER對TβR1和Smad2/3在食管癌中的關(guān)系進(jìn)行了研究,結(jié)果表明TβR1和Smad2/3在食管癌中的表達(dá)呈正相關(guān)。

因此,本研究通過免疫組化方法檢測了TβR1和p-Smad2/3蛋白在哈薩克族食管鱗癌患者中的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)均上調(diào)且正相關(guān),這與我們通過生物信息學(xué)分析得到的結(jié)果相一致。在既往研究中,部分學(xué)者如李秋香等[19]研究發(fā)現(xiàn)p-Smad2/3蛋白在食管鱗癌中高表達(dá),李冠華等[20]發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌組織中Smad2蛋白的表達(dá)高于正常組織;然而也有部分學(xué)者,如何欣蓉等[21]發(fā)現(xiàn)p-Smad2和TβR2蛋白在食管癌中的表達(dá)低于癌旁正常組織,這可能與研究人群的選擇、樣本量的大小等有關(guān)。

本實驗還分析了TβR1和p-Smad2/3的蛋白表達(dá)水平與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TβR1和p-Smad2/3蛋白高表達(dá)的哈族食管鱗癌患者,其腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯高于低表達(dá)患者。據(jù)報道,TGF-β信號通路可通過誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤,并促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[22-24]。有研究顯示,胰腺癌組織中TβR1表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)胰腺癌的轉(zhuǎn)移,其機(jī)制與TβR1能夠參與調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)[25];Cao等[26]發(fā)現(xiàn)TGF-β1和p-Smad3高表達(dá)促進(jìn)食管鱗癌轉(zhuǎn)移,由此說明TβR1和p-Smad2/3可能參與了食管鱗癌的進(jìn)展。我們進(jìn)一步通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)TβR1和p-Smad2/3高表達(dá)組生存率均較低表達(dá)組低,說明TβR1和p-Smad2/3蛋白表達(dá)水平與哈族食管鱗癌患者生存時間相關(guān),TβR1和p-Smad2/3蛋白表達(dá)可被用來作為判斷食管鱗癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述,TGF-β/Smad信號通路與哈族食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān),但其具體分子機(jī)制仍待進(jìn)一步的實驗研究與探討。